全 文 ：植物学通报 2006, 23 (5): 595~602
Chinese Bulletin of Botany
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30370143)
* Author for correspondence. E-mail: zhangxs@sdau.edu.cn
植物离体器官发生控制机理研究进展
关春梅,张宪省*
山东农业大学生命科学学院, 山东省作物生物学重点实验室, 泰安 271018
摘要 植物离体器官发生不仅是获得大量无性繁殖植物和进行基因转化的重要途径, 而且亦是研究植
物发育问题的主要实验系统之一。迄今为止, 包括营养器官和生殖器官在内的几乎所有的器官都可以在
离体条件下得到再生, 为深入研究植物离体器官发生的分子机理奠定了基础。本文着重介绍了营养器官
发生过程基因表达的调节及重要功能基因的作用, 并对器官特征决定基因在生殖器官发生过程中的作用
进行了分析, 提出了揭示离体器官发生分子机理的主要途径。
关键词 离体器官发生, 激素, 分子机理
Advances in the Molecular Mechanism of in vitro
Plant Organogenesis
Chun Mei Guan, Xian Sheng Zhang*
Shandong Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University,
Taian 271018, China
Abstract Plant organ regeneration has an important role in plant reproduction and genetic engineering, and also
provides an experimental system to study molecular mechanism of plant development. So far, almost all of
vegetative and reproductive organs have been regenerated in vitro, which might be helpful to further understand
the molecular mechanism of plant organogenesis. In this review, regulation of gene expression and functions of
a few genes involved in the regeneration of vegetative organs are introduced. Further, roles of organ identity
genes, such as HAG1 and HoMADS1, are evaluated in reproductive organ development. Finally, we discuss the
questions which may be focused in the future study.
Key words organ regeneration, hormone, molecular mechanism
植物离体器官发生是指在培养条件下离
体的组织或细胞分化形成不定芽、根或花芽
等器官的过程(Bonga, 1988)。它不仅可在生
产上快速无性繁殖植物, 而且也是进行植物基
因工程的前提和基础(谷瑞升等, 1999)。同时,
由于离体条件下植物器官再生的环境因素比
较容易控制, 因此它也是研究植物发育问题的
主要实验系统之一。因而, 深入研究植物离体
器官发生的机理既具有重要的实践价值又具有
重要的理论意义。
1 植物离体器官发生的发展过程与规
律性
1.1 离体器官发生的发展过程
离体条件下诱导器官的形成在约一个世纪
前就已经获得成功。1908年, Winkler通过培养
综述 . 植物离体器官
596 23(5)
长叶蝴蝶草(Torenia asiatica)的叶切段, 观察到
了花芽从叶切段上的直接再生(Winkler, 1908)。
20世纪30-50年代, 根和营养芽等营养器官的
直接再生在许多植物中获得了成功。这一时
期, White(1943)通过培养番茄的根尖, 获得了根
尖的大量离体再生; Skoog和Tsui(1948)则诱导
了营养芽的直接形成。离体生殖器官的再生
从 20世纪 70年代初开始进入快速发展时期。
1973年, Tran Thanh Van通过烟草(Nicotiana
tabacum)的薄层培养诱导了花芽的直接再生
(Tran Thanh Van, 1973), 这种离体生殖器官发生
系统被广泛应用于生殖生理和生殖发育分子机
理的研究(Kaur-Sawhney et al., 1988; Tiburcio et
al., 1988; Meeks-Wagner et al., 1989)。随后
Hicks和McHughen (1974)在烟草胎座组织的培
养过程中成功获得了再生的柱头和心皮状结
构。1988年, 陆文梁等以风信子(Hyacinthus
orientalis)为材料获得了花被片、雄蕊和胚珠
的直接再生(Lu et al., 1988), 后来又通过小麦
(Triticum sativum)稃片和颖片的培养获得了小
穗的离体再生(Lu, 1992)。进入20世纪90年代
以来, 花序和果实的离体再生也在多种植物中取
得成功(Lu and Liang, 1994; Li and Zhang, 1999;
Lu, 2002, 2003)。迄今为止, 被子植物中包括营
养器官和生殖器官在内的几乎所有的器官都可
以在离体条件下得到再生。然而, 由于绝大多
数用于器官再生的植物种类其遗传背景比较复
杂、基因转化比较困难以及分子生物学的信
息积累较少等原因, 严重制约了离体器官发生的
分子机理的研究。为此, 我们实验室以水稻
(Oryza sativa)的雌蕊为外植体, 成功诱导了该器
官的离体发生, 但该系统的不足之处在于器官再
生的频率较低, 需进一步提高花器官再生的种类
和频率(An et al., 2004)。最近, 我们从模式植
物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中诱导了花
序、花芽、萼片和心皮的再生, 并且获得了较
高的再生频率(Guan et al., 2006; 尚未发表研究
结果)。研究工作为深入研究离体器官发生的
分子机理提供了重要实验系统。
1.2 离体器官发生的规律性
通过对离体器官发生的研究, 发现在植物
器官离体发生过程中有规律可循。首先, 可通
过调节培养基中生长素/细胞分裂素的浓度比
例而得到不同植物器官, 浓度比高时易于诱导根
的形成, 浓度比低时促进芽的分化, 浓度比处于
中间值时则易导致细胞无规则增殖形成愈伤组
织(Skoog and Miller, 1957)。最近10余年的研
究还发现植物器官再生的种类受内外两种因素
的控制, 即外植体的来源和外施激素的种类和浓
度。外植体的来源即分离外植体的器官在植
物个体发育中所处的分化时期。分化时期越
早, 来源于这种器官的外植体在培养时形成的细
胞的再分化潜能越低, 再生器官的种类越少; 反
之则越多。这表明外植体来源的器官在植株
个体发育中形成的时期决定了其细胞在离体培
养中能再生的器官的种类。外源施加的激素
的种类和浓度, 尤其是生长素的浓度, 对离体器
官的再生有重要作用。对于植株分化花芽前
形成的各种器官, 分化时期越早, 再生这种器官
需要的生长素浓度越低; 而对于植株分化花芽
后形成的器官即花器官, 分化时期越晚, 则获得
这种器官的再生所需要的生长素浓度越低(陆文
樑, 2005)。上述规律性的发现对指导不同种类
植物的不同器官的再生具有重要价值。
离体器官可以通过直接和间接两条途径得
到再生, 前者不经过愈伤组织阶段, 后者首先形
成愈伤组织, 然后通过愈伤组织产生离体器官。
一般认为离体器官发生由三个连续的时期组成:
第一个时期, 细胞对激素作出识别、脱分化、
获得向器官发育的潜在能力; 然后, 脱分化的细
胞在激素的作用下向特定器官发育; 第三个时
期是器官的形态发生阶段, 此时已不再需要激素
诱导(Sugiyama, 1999)。上述三个阶段的划分
对探索激素诱导离体器官发生的分子机理具有
重要价值。我们认为探索分子机理应着重考
虑以下问题: (1)激素通过何种信号转导途径决
5972006 关春梅 等: 植物离体器官发生控制机理研究进展
定细胞和组织向特定器官方向发育？(2)器官特
征决定基因起到何种作用？如何受到上游基因
的调节？(3)细胞脱分化和再分化的分子机理;
(4)离体条件下的器官发生与植株上自然状态下
器官发生的机理有何区别？
2 离体营养器官发生的分子基础
2.1 营养器官发生过程中基因表达的调节
植物细胞具有全能性, 在合适浓度的激素
条件下, 植物大部分组织来源的外植体均可以分
化出不定芽并发育成完整植株(Skoog et al.,
1957; Murashige et al., 1962)。在模式植物拟
南芥中, 芽可以通过间接器官发生的方式以根或
下胚轴为外植体而得到再生(Valvekens et al.,
1988)。外植体首先在富含生长素的愈伤诱导
培养基(callus-inducing medium, CIM)上进行预
培养, 然后转至富含细胞分裂素的苗诱导培养基
(shoot-inducing medium, SIM)上诱导芽的形成,
或转至根诱导培养基(root-inducing medium,
RIM)上诱导根的分化。Che等(2006)利用基因
芯片技术分析了拟南芥愈伤组织、芽和根离
体发生过程中基因表达的变化情况, 发现了一系
列在不同器官离体发生过程中表达量增加和降
低的基因。在外植体预培养过程中, 表达量增
幅最大的几个基因为 IAA-氨基合成酶基因、
GCN5-related N-乙酰基转移酶(GNAT)基因以及
late-embryogenesis abundant-domain protein基
因和一个胞外脂酶基因, GNAT基因家族的某些
成员编码与组蛋白乙酰化和染色质修饰等有关
的酶。在表达量大幅增加的基因中, 大部分基
因编码转录因子, 表明在外植体预培养过程中基
因表达程序发生了剧烈变化。在外植体预培
养过程中, 7个编码class Ⅲ过氧化物酶的基因
的表达量大幅降低, 该酶参与植物组织的木质
化、栓化作用、生长素代谢、伤口的修复以
及对病原菌侵害的防御, 这些基因表达量的降低
表明在预培养过程中, 维管组织的木质化程度降
低。此外, 分析了在不定芽、根和愈伤组织形
成过程中表达量特异增加或降低的基因, 发现在
不定芽分化过程中, 478个基因受到特异性的正
调控, 397个基因受到负调控; 在根形成时, 568
个基因的表达量上升, 583个基因的表达量下降;
而在愈伤组织形成过程中, 241个基因的表达受
到正调控, 373个基因的表达受到负调控。还
发现以根为外植体进行的不定芽分化过程中, 拟
南芥根特异表达的许多基因的表达被关闭。
在芽发育的早期阶段, 表达量增加的许多基因是
与细胞分裂素信号转导有关的基因, 最为显著的
是A类ARR基因(Che et al., 2006)。
2.2 营养器官发生关键基因的鉴别
C h e 等 ( 2 0 0 6 )进一步的研究发现 ,
APETALA2 (AP2)/ERBP基因家族的成员
RAP2.6L的表达量在芽分化过程中增加, 该基因
的T-DNA敲除突变降低了组织培养过程中芽
分化的频率, 影响了芽分生组织特异基因的表
达, 并可以使SIM培养过程中受到特异性正调
节的478个基因中大约35%的基因的表达量显
著降低, 表明其编码的转录因子在芽再生过程中
发挥重要作用。
AP2/ERBP家族参与植物的许多发育过程
和对环境信号的响应, 该家族在拟南芥中由144
个成员组成。从拟南芥cDNA文库中筛选到了
另一个 A P 2 / E R B P 家族成员 — — E S R 1
(ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1)基
因, 当利用农杆菌介导的转化法使之在拟南芥根
中过量表达时, 可以促进芽在不添加细胞分裂素
的条件下得到再生, 但愈伤组织的形成和根的分
化不受影响。分析表明, 在细胞分裂素缺失条
件下, 由ESR1过量表达所引起的芽的分化可能
是由于该基因的过量表达使外植体对低浓度细
胞分裂素的响应敏感性增加导致的, 而野生型根
外植体在这种低水平的细胞分裂素条件下不能
够引起芽的形成。由于该基因对细胞分裂素
信号的响应需要较长时间, 因此认为ESR1基因
可能不是细胞分裂素信号转导途径中的初级响
应基因, 但可能是细胞分裂素诱导的苗再生过程
598 23(5)
中的一个下游响应因子(Banno et al., 2001)。
以拟南芥处于球形胚到鱼雷型胚发育阶段
的不成熟的合子胚(immature zygotic embryos,
IZEs)为外植体, 可以诱导拟南芥体细胞胚的离
体发生。Gaj等(2005)分析了 lec1、lec2 和 fus3
三个突变体中体细胞胚胎离体发生的情况。
发现3个基因的单突变体与野生型相比, 其体细
胞胚胎离体发生的频率显著降低, 而双突变体和
三突变体的体细胞胚离体发生则被完全抑制, 表
明 LEC/FUS基因不仅在拟南芥合子胚发生过
程中起作用(Harada, 2001), 而且也是拟南芥体细
胞胚诱导所必需的。此外, 利用DR5::GUS转
基因植株分析了体细胞胚发生过程中生长素分
配的时空模式, 发现在野生型和 lec2-1突变体
的外植体组织中, 生长素的积累都非常迅速, 表
明lec2突变体中体细胞胚离体发生受抑制与外
施生长素的分配无关, LEC基因可能在生长素诱
导的体细胞胚发生过程的下游起作用。
2.3 细胞分裂素作用的分子机理
植物激素是影响植物离体器官发生的关键
因素, 各种器官的离体发生可以通过调节培养基
中激素的种类和浓度而获得成功。目前认为,
生长素和细胞分裂素可能通过激活特定的激素
信号转导途径从而启动了不定芽的生长发育过
程。Kakimoto(1996)发展和利用了目前在激素
信号转导研究中广泛应用的“不定芽分析技
术”, 在不添加外源细胞分裂素的条件下, 用
35S增强子的T-DNA标签法筛选得到了拟南芥
cki1 (cytokinin independent 1)功能获得性突变
体。在无外源细胞分裂素的条件下, CKI1基因
的过量表达足以促进不定芽的分化。CKI1曾
被认为可能是细胞分裂素在植物体内的一个受
体, 但由于其在体外不能结合细胞分裂素, 因此
无法证明其具有受体的功能。与之类似, 通过
利用在正常组织培养条件下不能再生不定芽的
方法筛选到了对外源细胞分裂素不敏感的突变
体 cre1。该突变体即使在正常浓度的外源细
胞分裂素的条件下也不能分化不定芽。酵母
突变体的遗传互补实验证明CRE1可以与细胞
分裂素结合, 从而证明了CRE1是植物体内的细
胞分裂素受体(Inoue et al., 2001)。
细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent
kinases, CDKs)和细胞周期蛋白(cyclin)是真核生
物细胞周期的主要调节因子, 细胞分裂素可以通
过诱导D类cyclin而对植物的细胞周期进行调
控。植物体内CDKs活性的降低导致根原始细
胞在细胞分裂停止之前即分化形成。水稻R2
蛋白与CDK7亲缘关系最近, 且具有CDK激酶
的活性; 而水稻 cyclin H 则可以特异性的与R2
结合并激活其激酶活性。利用糖皮质激素诱
导系统使水稻R2的 cDNA在烟草叶片外植体
中过量表达, 发现在富含生长素的培养基上, 根
的形态发生受到抑制, 从而引起细胞无规则增殖
导致愈伤组织的形成(Yamaguchi et al., 2003)。
研究结果表明器官发生早期阶段的CDKs的活
性水平控制了叶片细胞的分化命运。我们和
其他实验室的研究也发现过量表达D类CycD3;
1的拟南芥叶外植体可以在外源细胞分裂素缺
失的条件下诱导愈伤组织的形成。这些结果
表明细胞周期及其调控的细胞分裂在离体器官
发生过程中发挥重要作用(Riou-Khamlichi et al.,
1999; Wang et al., 2006)。
3 离体生殖器官发生的分子基础
3.1 离体生殖器官的发生
植物的生活周期可以分为两个阶段: 营养
生长阶段和生殖生长阶段。生殖生长是植物
生活周期中的关键环节。通过遗传学和分子
生物学的研究, 发现在拟南芥中至少有5条途径
参与调控拟南芥的开花时间。随后, 在花序分
生组织的侧翼形成花分生组织, 进而分化产生各
种花器官原基。A B C 模型、A B C D 模型、
ABCDE模型以及四聚体模型的提出为了解花
器官发育的分子机理奠定了坚实的基础(Coen
and Meyerowitz, 1991; Colombo et al., 1995;
Theissen, 2001; Honma and Goto, 2001)。近年
5992006 关春梅 等: 植物离体器官发生控制机理研究进展
来, 离体生殖器官再生系统的建立为进一步了解
单个生殖器官发育的调控机制提供了便利。
植物生殖器官的离体发生也有两条途径:
直接发生和间接发生。第一类再生系统已经
在烟草、风信子、黄瓜等多种单双子叶植物
中成功建立。 樑陆文 等以风信子为材料, 先后
报道了以风信子花被片为外植体成功诱导了花
芽、花被片、雄蕊、心皮和胚珠的直接再生,
建立了风信子的各种离体生殖器官再生系统。
在风信子的花器官再生系统中, 以花被片为外植
体, 在高浓度细胞分裂素和生长素条件下, 能诱
导花被片的不断再生; 当外植体从含高浓度激
素的培养基转移到含低浓度激素的培养基上时,
能够诱导再生花芽中形成子房和胚珠(Lu and
Zhu, 1991; Lu and Liang, 1992; Lu et al., 1999,
2000)。
第二类再生系统也已经在单子叶植物小
麦、水稻和双子叶植物花叶千年木中获得成
功。以小麦幼穗的内稃和外稃为外植体, 可以
先形成愈伤组织, 然后从愈伤组织上直接再生小
穗及雌蕊状结构(Lu and Liang, 1992)。以小麦
的未成熟胚为外植体可首先诱导愈伤组织的形
成, 然后在愈伤组织上直接再生雌蕊(Wu et al.,
2003)。再生雌蕊除了具有单生胚珠, 还发现了
双生胚珠, 离体雌蕊的再生频率与小麦的基因型
有密切的联系。
3.2 生殖器官特征决定基因的作用
由于器官特征决定基因在植株上器官发生
过程中起关键作用, 因此推测离体条件下器官特
征决定基因可能起同样重要的作用。为了证
实这一观点, 我们分析了此类基因在离体器官发
生过程中的作用, 并希望以此为切入点, 解析激
素调节生殖器官发生的分子机理。
风信子花器官离体再生系统的成功建立为
研究这些器官发生的分子机理奠定了良好的实
验基础。进一步的研究发现, 在离体条件下, 高
浓度外源激素通过激活风信子中拟南芥AG基
因的同源基因HAG1的表达促进了再生花芽和
花器官的分化,低浓度激素通过诱导HoMADS1
的表达来促进再生胚珠的分化(Li et al., 2002; Xu
et al., 2004)。HAG1基因是一个MADS-box基
因, 该基因在拟南芥中的过量表达与AG基因在
拟南芥中过量表达产生的表型相似。HAG1的
mRNA最早可以在用高浓度的细胞分裂素和生
长素诱导处理5天的风信子花被片外植体中检
测到, 在该种浓度的激素处理下可以诱导风信子
花芽的直接再生。而在没有激素或者激素浓
度低的条件下 , 则未能检测到该基因的
mRNA。这表明在花芽再生过程中高浓度激素
诱导了该基因的表达。然而, 与花器官发生有
关的A类和B类基因HAP2和 HPI1基因的表
达则不受激素诱导, 这可能与他们已经在花被片
外植体中的表达有关(Li et al., 2001; Su et al.,
2005)。HoMADS1是风信子胚珠中特异表达的
D类MADS-box基因, 在花芽离体发生过程中,
在高浓度激素条件下检测不到HoMADS1基因
的mRNA, 而当再生花芽转至含低浓度激素的
培养基上时, 可以诱导胚珠的离体分化, 并可检
测到HoMADS1的mRNA。这些结果初步揭示
植物激素可能通过调节花器官同源异型基因的
表达来调控植物花器官的分化与发育(Li et al.,
2002; Xu et al., 2004)。
以水稻幼嫩的子房为外植体, 通过愈伤组
织成功诱导了水稻离体雌蕊和稃片的产生。
再生的离体雌蕊状结构在形态上具有雌蕊的特
征, 组织切片观察发现再生雌蕊与植株上的雌蕊
相似, 都具有胚珠。利用水稻雌蕊特异表达基
因OsMADS3作为分子Marker进行Northern杂
交分析表明, OsMADS3只在离体雌蕊和植株上
的雌蕊中表达, 进一步证明了再生雌蕊状结构具
有雌蕊的特征。离体稃片状结构也与植株上
的稃片在外部形态上相似, 但进一步的形态学分
析结果显示离体稃片状结构的细胞类型和排列
以及主脉数都与植株上的稃片存在显著差异
(An et al., 2004)。
Guan等(2006)以WS生态型拟南芥的花序
600 23(5)
轴为外植体, 通过调节培养基中激素的种类和浓
度, 首先诱导愈伤组织的形成, 然后使愈伤组织
分化花序, 成功诱导了拟南芥离体花序的再生,
并获得了两种类型的再生花序, 类型Ⅰ花序无茎
生叶形成, 类型Ⅱ花序则有少量茎生叶。构建
拟南芥苗端特征基因TFL1的启动子与GUS报
告基因的融合表达载体, 对转基因植株进行组织
培养和GUS染色分析, 在分化的愈伤组织中检
测到GUS基因的表达, 且其表达量随愈伤组织
在分化培养基上培养时间的延长而增加。在
再生的转基因花序中同样检测到GUS基因的
表达, 其表达模式与TFL1基因在野生型拟南芥
植株中的表达模式一致。
对TFL1基因上游调控序列的分析发现, 在
该基因的启动子序列中存在3个生长素响应元
件(auxin response elements, AuxREs), 该元件可
以与生长素响应因子(auxin response factor,
ARF)特异结合, 调控生长素响应基因的表达
(Woodward et al., 2004)。应用重表型 TFL1反
义表达突变体的花序轴作外植体, 不能诱导花序
的分化。表明在拟南芥离体花序发育过程中,
生长素可能通过作用于TFL1基因的启动子而
诱导该基因的表达, 从而最终影响花序分生组织
在离体条件下的形成; 而细胞分裂素则可能通
过作用于其它基因调节拟南芥离体花序的发育
(Guan et al., 2006)。
LFY转录因子在拟南芥营养生长向生殖生
长转变过程中发挥关键作用。Wagner等(2004)
利用地噻米松诱导LFY基因的过量表达, 以转
基因植株的根为外植体, 在CIM和SIM培养基
上培养, 发现从根外植体上直接形成了花器官。
形态学和报告基因分析表明分化过程中形成的
叶状器官在LFY基因的作用下向花器官形态转
变。cDNA微阵列分析发现, 已知的 LFY基因
的目的基因AP1等的表达水平增加, 并发现了
一些未报道的 LFY基因的下游基因。
上述研究工作说明生殖器官特征决定基因
同样在离体花器官发生过程中起重要作用。
4 结束语
目前, 尽管植物包括营养器官和生殖器官
在内的各种器官都可以在离体条件下得到再生,
但由于物种遗传背景和转化等种种原因的存在,
利用这些离体再生实验系统对器官发生的分子
机理进行研究遇到了各种困难, 因而研究进展缓
慢, 尤其是离体生殖器官发生分子机理的研究。
因此进一步完善模式植物离体花序和花器官再
生实验系统将是重要的基础工作之一。其次,
细胞生物学和遗传学等研究手段的应用将为揭
示离体器官发生的分子机理提供强有力的工
具。进一步寻找早期对激素响应的基因以及
调节器官特征决定基因表达的上游基因将是理
解离体器官发生分子机理的关键所在。深入
研究离体器官发生的分子机理不仅为指导离体
器官的再生提供理论依据, 而且亦为揭示自然状
态下植株上器官发生的分子机理提供重要资
料 。
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