全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 552-558, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-04-23; 接受日期: 2008-09-01
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30370044, 30470016)
* 通讯作者。E-mail: w ytao1946@163.com
.实验简报.
内生真菌培养液对东北红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响
李永成1, 2, 陶文沂1 *
1江南大学教育部工业生物技术重点实验室, 无锡 214122; 2海南大学食品学院, 海口 570228
摘要 产紫杉醇的内生真菌(Fusarium mairei)先培养在B5液体培养基中, 然后制备成内生真菌培养液。在东北红豆杉(Taxus
cuspidata )细胞悬浮培养的不同阶段(5、10和15天), 用不同剂量的内生真菌培养液(2、4和6 mL)分别进行处理。结果表明,
在用4 m L内生真菌培养液处理的植物细胞中可获得最高的紫杉醇产量(5 .88 m g.L-1)与释放率(67%), 分别是对照的1.9 倍与
5.6 倍。添加时间方面, 在植物细胞培养周期的第5天添加4 mL内生真菌培养液, 可获得最佳效果, 紫杉醇产量与释放率分别
为6.1 mg.L-1与75%, 分别是对照的2倍与6.8倍。与其它诱导子相比, 4 mL内生真菌培养液不仅可提高紫杉醇的释放率, 而
且不会引起东北红豆杉细胞膜的明显伤害, 说明内生真菌发酵液激活了紫杉醇主动运输过程中的相关酶类。
关键词 内生真菌, 美丽镰刀菌, 紫杉醇, 植物细胞悬浮培养, 东北红豆杉
李永成 , 陶文沂 (2008). 内生真菌培养液对东北红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响. 植物学通报 25, 552-558.
紫杉醇是一种优良的抗癌药物(Suffness and Wall,
1995), 主要存在于裸子植物红豆杉科(Taxaceae)的红豆
杉属(Taxus)和澳洲红豆杉属(Austrotaxus) 植物中。红
豆杉属植物生长非常缓慢, 而且其紫杉醇的含量普遍很
低。因此有限的供应成为紫杉醇在临床应用中的最大
瓶 颈 。
为解决紫杉醇供需之间的矛盾, 多年来, 科学家在寻
找及扩大紫杉醇药源方面做了大量工作。目前主要的
生产方法有:全化学合成法 (Ni colaou e t al. , 1994;
Holton et al. , 1995)、半合成法 (Commercn et al. ,
1995)、内生真菌发酵法(林福呈等, 2003)、人工种植
红豆杉(张佐玉, 2000)以及植物细胞悬浮培养法。其中,
植物细胞悬浮培养法被认为是未来最有前途的生产方
法。紫杉醇作为红豆杉中的一种次生代谢物, 像其它次
生代谢物一样, 被认为是植物对外界胁迫(如微生物、
昆虫和病原菌侵袭等)所产生的防御反应的一个分支。
在植物细胞悬浮培养法中, 促进紫杉醇合成的方法都基
于该原理(Zhao et al. , 2005)。其中, 利用各种诱导子
通过激活植物细胞的防御反应来促进紫杉醇的合成是植
物细胞悬浮培养法的主要技术手段(Fet t-Neto et al. ,
1993; Yuk imune et al. , 1996; Mirjali l i and Linden,
1996 )。
很多报道表明, 真菌诱导子能有效促进植物细胞中
紫杉醇的合成, 但报道中的真菌诱导子均来自于真菌菌
体的粗提物(兰文智等, 2002; 仇燕等, 2003)。本实验
室曾从南方红豆杉(T. mairei)中分离得到一株能够产生
紫杉醇的内生真菌(Fusarium mairei)(Xu et al., 2006)。
本研究利用该内生真菌(F. mairei)的浓缩培养液作为诱
导子探讨了其对东北红豆杉(T. cuspidata)细胞生长及合
成紫杉醇的影响, 进而阐明它们之间的相互关系。研究
发现该内生真菌对东北红豆杉悬浮培养细胞中的紫杉醇
合成与释放均有良好的诱导作用, 实验结果对紫杉醇生
产方法的开发有一定参考意义。
1 材料与方法
1.1 植物细胞的悬浮培养
东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb. et . Zucc.)细胞培养
在含0.2 mg.L-1萘乙酸、 0.15 mg.L-1 6-苄基嘌呤和 25
g.L-1蔗糖的 B5液体培养基中。在 250 mL三角瓶内倒
553李永成等: 内生真菌培养液对东北红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响
入 80 mL上述液体培养基, 接种20 mL3代培养物(约含
6 g湿细胞)。100 rpm, 25°C 黑暗培养。
1.2 内生真菌培养液的制备
美丽镰刀菌(Fusarium mairei)由本实验室分离筛选。在
500 mL三角瓶中加入 200 mL不含激素的 B5液体培养
基, 接种 5 mL美丽镰刀菌液体种子, 170 rpm, 25°C培
养 6天。培养液先用 4层纱布过滤, 然后过 0.45 mm 的
微孔滤膜, 取其滤液90 mL, 浓缩至30 mL, 121°C灭菌
15 分钟后备用。
1.3 植物细胞生物量及其活性的测定
植物细胞生长量以细胞干重计, 细胞活性采用氯化三苯
四氮唑(2, 3, 5-t ripheny ltet razolium chloride, TTC)法
测定(Iborra et al. , 1992)。
1.4 植物细胞内丙二醛含量及细胞膜完整性的
测定
植物细胞内丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量采用
硫代巴比妥酸法测定(Heath and Packer, 1968)。细胞
膜的完整性采用伊文思蓝(Evans b l ue )染色法测定
(Suzuk i et al. , 1999), 在 600 nm 处测定吸光值。染
料通过细胞膜进入细胞内, 高OD600值说明细胞膜结构
受到破坏, 其细胞膜的完整性差。
1.5 紫杉醇的提取与测定
1.5.1 胞外紫杉醇的提取
取红豆杉细胞培养液 40 mL, 10 000 × g离心 10分钟,
得到的上清液用相同体积的三氯甲烷萃取 3次。收集三
氯甲烷, 45°C下真空浓缩至干, 其残留物用 1 mL甲醇
复溶, 并过 0.2 mm的滤膜后待测。
1.5.2 胞内紫杉醇的提取
取 100 mg干细胞, 用研钵研磨后加入 20 mL甲醇, 浸
泡 12 小时, 滤纸过滤, 滤液中加入 20 mL去离子水混
匀。用 20 mL三氯甲烷萃取 3次。以后过程同 1.5.1
节所述。
1.5.3 紫杉醇的含量测定
采用高效液相色谱法测定紫杉醇含量。色谱条件: 色谱
柱, XDB-C18(4.6 mm × 250 mm, 5 mm); 流动相, 甲醇:
水(65: 35, v/v); 柱温 25°C; 检测器为紫外检测器, 检测
波长 227 nm。
1.6 统计分析
实验数据采用3个平行实验的平均值, 误差用标准差表示,
显著性分析用 Student-tes t进行, P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 内生真菌发酵液对东北红豆杉悬浮培养细
胞生长的影响
当用 2 mL内生真菌发酵液(endophytic fungus culture
broth, EFCB)处理东北红豆杉悬浮细胞培养物时, 其生
长曲线与对照相似(图 1A)。在细胞生长周期的第 10天,
分别加入 2、4 和 6 mL EFCB, 在处理后的 2天内, 细
胞的比生长速率分别是 0.015 /d、0.02 /d和 0.01 /d, 而对
照是 0.07 /d, 对照细胞的比生长速率比经EFCB处理的
细胞高 3-7倍。但在处理后的 3-8天内, 细胞的比生
长速率分别是 0.15 /d (2 mL EFCB)、0.12 /d (4 mL
EFCB)和 0.11 /d (6 mL EFCB), 而对照则是 0.13 /d (图
1A), 处理与对照无明显区别。这说明 EFCB 对东北红
豆杉细胞生长的抑制作用是短暂的, 东北红豆杉细胞生
长受 EFCB 抑制但能很快恢复。统计分析表明, 2 mL
与 4 mL EFCB处理对东北红豆杉细胞生长无明显影响
(P＞0.05), 而 6 mL EFCB对东北红豆杉细胞生长有明
显的抑制作用(P ＜ 0.05)。
关于 EFCB的添加时间, 结果显示在培养第 10天添
加, 细胞生物量出现小幅度下降, 而在培养第 15天添加
EFCB对东北红豆杉细胞生长则无明显影响(P ＞ 0.05)。
但在第 5天添加, 细胞生物量比对照下降近 26%(图1B)。
2.2 内生真菌发酵液对东北红豆杉悬浮培养细
胞活性的影响
图 2A 显示了 EFCB添加量对东北红豆杉悬浮培养细胞
554 植物学通报 25(5) 2008
活性的影响。当用 2 mL 与 4 mL 的 EFCB 处理细胞
时, 处理后的4天内, EFCB对细胞活性无明显影响(P＞
0.05)。图2B则显示了 EFCB添加时间对东北红豆杉细
胞活性的影响, 在细胞培养周期的第5天, 用4 mL EFCB
处理, 细胞活性有明显下降(P＜ 0.05)。在第 10天与第
15天添加 EFCB 时, 处理后的细胞活性也出现下降, 但
下降幅度明显小于第 5天的处理。另外, 经 EFCB 处理
后细胞活性降低的细胞培养物, 其耗糖速度并没有降低
(图 3)。这说明 EFCB 促进了东北红豆杉细胞的代谢。
2.3 内生真菌发酵液对植物细胞膜的影响
了解紫杉醇如何通过细胞膜分泌到胞外的机制对研究紫
杉醇的合成至关重要。本实验通过测定东北红豆杉细
胞膜过氧化作用的产物— —丙二醛及其细胞膜的完整性
来评估 EFCB对植物细胞膜的影响。用 2 mL EFCB处
图 1 内生真菌发酵液剂量(A)和添加时间(B)对东北红豆杉细胞
生长的影响
(A)在细胞培养周期的第10天加入内生真菌培养液; (B) 在细胞培
养周期的第5、10和 15天分别加入4 mL内生真菌培养液
Figur e 1 Effects of endophytic f ungus culture broth (EFCB)
amount (A) and its addit ion time (B) on the grow th of Taxus
cuspidata cells
(A) Endophytic f ungus culture broth (EFCB) (2, 4 and 6 mL)
w as added to the suspens ion cultures of T. cuspi data on the
10th day of cult ivation; (B) Endophytic f ungus culture broth
(EFCB) of 4 mL w as added to the suspens ion cultures of T.
cuspi data on the 5th, 10th and 15th day of cultivation
图 2 内生真菌发酵液剂量(A)和添加时间(B)对东北红豆杉细胞
活性的影响
(A)和(B) : 同图 1
Figur e 2 Ef fec ts of endophytic f ungus culture broth (EFCB)
amount (A) and its addit ion time (B) on the cell viability of Taxus
cuspi data cultures
(A) and (B): See Figure 1
555李永成等: 内生真菌培养液对东北红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响
理东北红豆杉细胞悬浮培养物, 发现 EFCB对细胞内的
MDA含量及细胞膜的完整性均无明显影响(图 4)。用 4
mL EFCB处理时, 处理 2天内, EFCB可明显引起胞内
MDA含量上升及细胞膜完整性下降, 而处理后 5-7天,
胞内的MDA含量与细胞膜的完整性可恢复到与对照相
同的正常水平(图 4)。但用 6 mL EFCB 处理时, 胞内
MDA含量始终处于较高水平, 细胞膜的完整性受到明显
伤害(图 4)。这说明植物细胞受到中低剂量(2和 4 mL)
EFCB的胁迫伤害时, 能进行自我修复, 这可能是植物与
内生真菌长期共生的结果。
2.4 内生真菌发酵液对东北红豆杉悬浮培养细
胞中紫杉醇积累与释放的影响
用 4 m L EF CB 处理东北红豆杉细胞可获得最大产量
(5.88 mg.L-1)的紫杉醇和最高的释放率(67%), 分别是对
照(3.1 mg.L-1 和 12%)的 1.9倍与 5.6倍(表 1)。关于
EFCB 的添加时间方面, 在细胞培养周期的第 5天添加
可获得最佳效果(紫杉醇产量 6.1 mg.L-1, 释放率 75%)
(表 2)。这与其它诱导子有较大区别, 据报道, 在植物细
胞生长对数后期(10-15天)添加诱导子效果最佳。由于
培养 6天的 EFCB不含紫杉醇及其前体物, 12天后才产
图 3 内生真菌发酵液在不同时间(5、10和 15天)添加时东北
红豆杉细胞悬浮培养液的糖耗曲线
Figur e 3 Depletion curve of sugar in suspension cultures of
Taxus cuspidata treated w ith 4 mL endophytic f ungus culture
broth (EFCB) at dif ferent culture s tage (on the 5th, 10th and
15th day)
图 4 内生真菌发酵液处理后东北红豆杉细胞内丙二醛含量(A)
以及细胞膜完整性(B)的变化曲线
在细胞培养周期的第 10天加入内生真菌培养液(2、4和 6 mL)。
细胞膜的完整性以OD60 0.50 mg-1 FW细胞表示, OD6 00值越高表
示细胞膜的完整性越低
Figur e 4 Time courses of intracellular malondialdehyde (A)
and the membrane integrity (B) of Taxus cuspidata cells treated
w ith endophytic f ungus culture broth (EFCB)
Endophytic fungus culture broths (EFCB) (2, 4 and 6 mL) w ere
added into the suspension cultures on the 10th day of cultivation.
The cell membrane integr ity w as represented as OD600 per 50
mg FW cells , and the higher OD600 means low er cell membrane
integrity
生微量的紫杉醇(180 µg.L-1) (Xu et al. , 2006)。因此
经 EFCB处理的东北红豆杉培养物中, 紫杉醇含量的增
加不是 EFCB本身带来的, 而是 EFCB对东北红豆杉细
胞诱导的结果。
3 讨论
本实验结果表明, 内生真菌培养液对东北红豆杉细胞悬
556 植物学通报 25(5) 2008
浮培养物中紫杉醇的合成与释放有明显影响。内生真
菌培养液中含有多种诱导成分。实验表明, 它具有诱导
子的共同特性, 如激活苯丙氨酸解氨酶(pheny lalanine
ammonia-lyase, PAL)的活性和培养基的碱化等(Zhao et
al. , 2005)。
有研究表明, 很多诱导子如茉莉酸甲酯(m et hy l
jasmonate, MJ)、真菌诱导子和重金属离子等均可抑
制植物细胞的生长与活性, 这些是影响植物细胞合成紫
杉醇与引起紫杉醇产量不稳定的重要原因(Lindsey and
Yeoman, 1983; Yu et al. , 2001, 2002a)。植物细胞
合成次生代谢物与其生长及活性有密切关系(Yu et al. ,
2002b )。本实验中, 东北红豆杉细胞在添加适量的
EFCB(4 mL)后培养 2 天内也可引起类似现象。但在
添加后的 3-8天内, 受 EFCB 抑制的细胞其生长速率
又可恢复到正常水平(图 1 )。这说明植物细胞可适应
一定剂量的内生真菌的胁迫, 这种适应性可能是二者长
期共生关系的结果。
关于诱导时机, 很多研究表明在植物细胞对数生长
后期诱导可获得较高的紫杉醇积累(Yuk imune et al. ,
1996; Mirjalil i and Linden, 1996; Wu and Lin, 2003)。
过早加入诱导子, 会抑制植物细胞的生长。但本实验在
东北红豆杉悬浮培养细胞生长前期(5天)添加 EFCB 也
获得了较好的紫杉醇积累与释放(表2), 这与其它诱导子
有明显差异。可能的原因如下: (1)红豆杉细胞对内生真
菌培养液的胁迫具有耐受性; (2)红豆杉细胞对内生真菌
有适应性; (3)在培养早期, 培养基中有害成分较少, 受影
响的红豆杉细胞能很快恢复过来; (4)诱导时间长, 导致
较高紫杉醇的积累, 这也说明红豆杉细胞能适应内生真
菌培养液的长时间胁迫。
紫杉醇是脂溶性分子, 可通过生物膜, 但只有少部分
紫杉醇通过被动运输的方式分泌到胞外, 大部分是通过
主动运输穿过细胞膜的(B a l as ub ram a n i an and
Straubinger, 1994)。紫杉醇在胞内积累会引起反馈抑
制、降解并抑制细胞的活性。因此了解紫杉醇的运输
表 1 内生真菌发酵液添加剂量对东北红豆杉悬浮培养细胞紫杉醇产量与释放率的影响
Table 1 Eff ec t of dif ferent endophytic fungus culture broth (EFCB) amount on accumulation and release of paclitaxel in
suspension cultures of Taxus cuspidata
Treatment
Paclitaxel content (mg.L-1)
Release ratio (%)
Ex tracellular Intracellular Total
CK 0.38±0.05 0.28±0.08 3.14±0.13 12±1
2 mL EFCB 1.55±0.10 2.58±0.11 4.13±0.19 38±0.86
4 mL EFCB 3.90±0.14 1.94±0.12 5.88±0.23 67±1.14
6 mL EFCB 1.99±0.23 1.89±0.09 3.89±0.15 51±0.83
在细胞培养周期的第 10天加入EFCB, 第 20天取样测定紫杉醇含量。释放率＝胞外紫杉醇 /总紫杉醇×100%; EFCB: 内生真菌发酵液
EFCB w as added to suspension cultures of T. cuspi data on the 10th day of cultivation. Samples w ere taken on the 20th day of
cultivation. Release ratio＝ ex tracellular pac litaxel / total pac litaxel×100%. EFCB: Endophytic fungus culture broth
表 2 内生真菌发酵液不同的添加时间对东北红豆杉悬浮培养细胞紫杉醇产量与释放率的影响
Table 2 Accumulation and release of paclitaxel in the case of 4 mL endophytic f ungus culture broth (EFCB) being added to
suspension culture of Taxus cuspi data at diff erent culture s tages
Treatment time Paclitaxel content (mg.L-1) Release ratio
(d) Ex tracellular Intracellular Total (%)
CK 0.33±0.02 2.65±0.12 2.97±0.11 11±0.87
5 4.58±0.21 1.53±0.09 6.10±0.36 75±0.98
10 4.09±0.20 1.75±0.15 5.84±0.27 70±1.07
15 3.23±0.18 1.98±0.16 5.21±0.33 62±1.20
在细胞培养周期的第 5、10和 15天分别加入4 mL EFCB, 第 20天取样测定紫杉醇含量
EFCB of 4 mL w as added to suspens ion cultures of T. cuspidata on the 5th, 10th and 15th day of cultivation, respec tively. Samples
w ere taken on the 20th day of cultivation
557李永成等: 内生真菌培养液对东北红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响
机制对改善紫杉醇合成至关重要。本实验中内生真菌
发酵液可提高紫杉醇的释放率(表1, 表2), 适量的EFCB
(4 mL)并不引起植物细胞膜的明显损害(图 4)。这说明
紫杉醇释放率的提高并不是由植物细胞膜物理渗透性升
高而引起的, 因此可推断内生真菌激活了紫杉醇主动运
输途径中相关酶的合成。
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Effect of Endophytic Fungus Culture Broth on the Growth and
Paclitaxel Accumulation of Taxus cuspidata Cells
Yongcheng Li1, 2, Wenyi Tao1*
1Ke y L aborato ry of Indu strial Bio techno log y of Mi nistry of Edu cat ion, Ji ang nan Uni versit y, Wuxi 2 141 22, Chi na
2 Scho ol o f Food , Hain an University, Haikou 57 022 8, Chi na
Abstr act To inves tigate the ability of endophytic fungus culture broth (EFCB) to improve paclitaxel release from cultured cells,
EFCB w as prepared from Fusar ium mai rei cultured in B5 medium. Suspension cultures of Taxus cuspi data cells w ere treated w ith
2, 4 and 6 mL EFCB at different cult ivation stages (days 5, 10 and 15). Cells treated w ith 4 mL EFCB show ed the highest paclitaxel
yield (5.88 mg.L-1) and release ratio (67%) , 1.9 and 5.6 times higher , respectively , than that of untreated control cells. In terms of
timing of the addit ion of EFCB, the mos t desirable paclitaxel production (6.1 mg.L-1) and release ratio (75%) w ere 2 and 6.8 times,
respec tively, higher than that of control cells , w ith 4 mL EFCB added to cultures on day 5 of cultivation. Compared w ith other
elicitors, EFCB, at 4 mL, did not damage the plant cell membrane, although it promoted the paclitaxel release capability of plant cells,
w hich suggests that EFCB can activate the related enzymes involved in paclitaxel transport in T. cuspi data cells.
Ke y w ords fu nga l e ndo phyte, Fu sarium ma ire i, paclita xel , p lan t cell suspen sio n cultu re, Ta xus cuspida ta
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Ch in Bull Bo t 25 , 55 2-55 8.
(责任编辑: 孙冬花)
* Author for correspondence. E-mail: w y tao1946@163.com