全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 490-497, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-09-06; 接受日期: 2007-01-13
基金项目: 江苏省科技攻关项目(No. BE2005349)和国家基础研究专项(No.2002CB111402)
* 通讯作者。E-mail: wrl@njau.edu.cn
.技术与方法.
整体透明技术在植物生物学中的应用实例及其剖析
郝建华 1,2, 强胜 1*
1南京农业大学杂草研究室, 南京 210095; 2常熟理工学院生物系, 常熟 215500
摘要 通过采用不同的透明剂和透明方法, 对番茄 (Lycopercicon esculentum)侧根原基、加拿大一枝黄花 (Solidago
canadensis)与一枝黄花 (S. decurens)的亲和性识别反应和苏门白酒草 (Conyza sumatrensis)的胚珠发育过程进行了观
察, 提供了整体透明技术在植物生物学中的应用实例, 简要回顾了该技术在植物生殖生物学中的应用和发展状况, 分析了该技
术在植物生物学应用中的优势和不足, 探讨了该技术应用中一些具体的技术环节, 如透明剂的选择和使用以及与特殊用途显
微镜的配合使用等方面的问题, 并对该技术的应用前景进行了展望。
关键词 显微技术, 植物生物学, 植物生殖生物学, 整体透明技术
郝建华, 强胜 (2007). 整体透明技术在植物生物学中的应用实例及其剖析. 植物学通报 24, 490-497.
整体透明技术是植物生物学教学和研究中常用的一
种技术。植物组织或器官经过各种透明剂处理后, 由于
透光性增加, 且由于不同组织的厚度和折射率的不同, 呈
现出不同的形态。透明后的组织不经过染色或用不同
的染料染色后, 利用明视野显微镜、相差显微镜 (phase
contrast microscopy)、微分干涉差 (differential inter-
ference contrast, DIC)显微镜 (又称Nomarski相差显
微镜, Nomarski contrast microscopy)、荧光显微镜
(fluorescence microscopy)和激光扫描共聚焦显微镜
(confocal laser scanning microscopy, CLSM)等, 可
观察到通常不易观察到的组织和细胞。
整体透明技术的优点在于: (1)可对组织和器官进行
整体观察, 了解其中特定组织或细胞的三维结构, 即具有
原位地形学 (topograph)观察和指定性观察的优势 (杨弘
远, 1986)。在观察的基础上, 可进行必要的统计和测量
分析, 如对幼苗中的维管系统的分布(毕冬玲等, 2004)以
及叶中分泌细胞团和分泌囊的观察等(蔡霞和胡正海,
2000; 吕洪飞等, 2001)。(2)对一些较小的、制作切片
困难或用切片法观察效率低的材料, 用此法可快速观察
到内部组织和结构的发育过程, 避免人力物力的浪费。
例如在植物生殖生物学中对某些种的花粉发育(李国平和
黄群策, 2005; 李国平等, 2006)、胚囊发育和胚囊结构
(Smith and Johnson, 1980; 杜中等, 1995; 任宏等,
1998; 张华华等, 2003; 郭海滨等, 2006)、受精与胚发
育(杨弘远, 1988; 刘向东等, 1993; 赵世绪等, 1993; 吴
晓东和杨世杰, 1998; 张华华等, 2006)、种子和果实的
形成(Shih et al., 1983; 陈庆亮等, 2005)等过程的观察。
整体透明方法作为植物生物学中的一种重要技术,
在我国的研究和应用报道较少。杨弘远(1988)在 19世
纪80年代做了专题介绍后, 未见到有关此技术的系统性
报道。即使是在整体透明技术应用最广的植物生殖生
物学领域, 整体透明技术也仅限于对成熟胚囊、胚和种
子等胚胎学发育较后时期的部分报道 (杨弘远, 1986; 赵
世绪等, 1993; 杜中等, 1995; 任宏等, 1998; 吴晓东和
杨世杰, 1998; 张华华等, 2003; 陈庆亮等, 2005; 郭海
滨等, 2006; 张华华等, 2006), 对大孢子母细胞、四分
体和单核胚囊等早期胚胎学事件的报道不多。国外一
些作者对不染色或染色的材料, 结合微分干涉差显微镜
或激光共聚焦扫描显微镜研究了多种植物的生殖发育过
程, 得到了各关键时期的图片(Smith and Johnson,
1980; Aulbach-Smith and Herr, 1984; Fredrikson et
al., 1988; Calderini and Mariani, 1995; Hodnett et al.,
491郝建华等: 整体透明技术在植物生物学中的应用实例及其剖析
1997; van Baarlen et al., 2002; Noyes and Allison,
2 0 0 5 ) , 这值得我们借鉴。苏门白酒草( C o n y z a
sumatrensis)为菊科白酒草属植物, 目前尚未见到对该
属植物的生殖生物学研究的报道。本文通过对不染色
的苏门白酒草胚珠发育过程的子房整体透明观察, 一方
面可以积累该种的生殖发育过程的基础资料; 另一方面
也可为国内学者利用此项技术进行相关研究提供参考。
整体透明技术在结构植物学中的应用也缺乏系统的研
究。例如对侧根原基的观察, 仅见对陆地棉幼根发育中
侧根原基的文字描述, 而无显微图片展示 (段留生等,
2002); 且描述该方法的文章属于植物生理学范畴, 不易
受到更需要应用此技术的植物形态学教师和研究者的注
意。用整体透明技术结合荧光显微镜进行花粉 -柱头
亲合性识别反应的观察虽在多种植物中被尝试过, 但
对不同种之间的亲合性反应, 尤其是对具有严重危害
性的外来入侵种与本地种之间的亲合性反应进行观察,
尚属首次。
本文结合上述研究内容, 对不同的整体透明技术的
一些应用进行介绍, 并对此技术在植物生物学中的应用
进行评介, 以期为此项技术在植物生物学教学和研究中
的推广应用有所裨益。
1 材料与方法
1.1 番茄侧根原基
选取侧根未伸出前的番茄(Lycopercicon esculentum)主
根, 经过FAA固定, 参照段留生等 (2002)的整体根Feul-
gen染色透明法观察侧根原基。孚尔根染色法中, 60℃
10%盐酸处理的时间缩短为 6-8分钟。染色、洗涤和
漂洗后, 经过 10%、30%、50% 和 80%梯度甘油透
明并脱水后, 保存在纯甘油中。将透明后的整条主根置
于载玻片上, 盖上盖片(解剖观察时可省去这一步), 在
Olympus解剖镜和显微镜下观察其侧根原基的发育, 并
统计其数量。
1.2 加拿大一枝黄花和一枝黄花亲和性识别反应
加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)和一枝黄花
(S. decurens)的头状花序均由两型花构成: 缘花为雌性
的舌状花, 盘花为两性的管状花。在加拿大一枝黄花的
总苞片刚张开时, 将中央的管状花摘除, 防止自花花粉落
在柱头上, 然后用指甲盖大小的硫酸纸袋将花序套上。
2-3天后, 剪去纸袋的顶端, 取一枝黄花处于散粉期的花
序, 将花粉涂擦于加拿大一枝黄花舌状花的柱头上, 之后
再用胶水封好纸袋口。在授粉后的 12、24、48和 72
小时, 分别取不同植株上的至少 3个花序, 固定于 FAA
中。花序经过 50%和 30%乙醇各 30分钟, 下降至水,
在1 mol.L-1NaOH中透明约8小时后, 用脱色苯胺蓝染
色, 在激发光处于紫外波段的Olympus荧光显微镜下观
察并摄影。
1.3 苏门白酒草有性生殖过程
苏门白酒草(Conyza sumatrensis)为菊科白酒草属植物,
为入侵性和危害性较强的外来入侵种之一。其花序由
中央的管状花和边缘的舌状花组成, 平均每个花序上有
158 朵小花。
取不同发育时期的苏门白酒草的花序(较大的花序可
纵剖为二)固定在 FPA或 FAA中。经过 70%、85%、
90%和 100%乙醇(2次)脱水, 每级2-3小时, 转入1/2
100%乙醇 +1/2冬青油(水杨酸甲酯)的混合液中处理
2-3小时, 经过3次冬青油透明, 前两次4-12小时左右,
最后 1次时间不限。材料可在冬青油中保存 1年。观
察时取出花序, 置于滴有冬青油的Raj slide或浅凹玻片
上, 用解剖针挑出其中的盘花和缘花, 盖上盖玻片, 置于
Olympus Vanox复合显微镜的Nomarski干涉差装置下
观察并摄影。Raj slide载玻片的制作方法是: 用玻璃
胶将2个盖玻片粘在同一张载玻片上, 两盖玻片间相距
1 cm左右。如果材料较厚, 可将 2个盖玻片粘合在一
起后, 分别粘于载玻片上。
2 结果
2.1 番茄根中侧根原基的观察
侧根原基从根的中柱鞘细胞发生, 经过各个方向的分裂,
形成一团由分生组织细胞构成的紧密的细胞团, 这些细
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胞经过孚尔根染色后, 呈现红色。经甘油透明后, 侧根
原基的红色细胞团可以在解剖镜和显微镜下清晰地观
察到 (图 1 A, B)。通过统计主根上所有侧根原基数
量和密度, 可了解根系早期发育的情况、不同处理对
根系发生和发育的影响以及栽培措施对根系发育的调
控情况等。
2.2 加拿大一枝黄花和一枝黄花的亲和性反应
的观察
加拿大一枝黄花和一枝黄花都是菊科一枝黄花属植物,
493郝建华等: 整体透明技术在植物生物学中的应用实例及其剖析
前者是具有严重危害性的外来入侵种, 后者是不具有危
害性的本地种。通过对 2个种的亲和性识别反应的观
察, 可了解外来入侵种与本地种之间是否具有杂交潜能,
以及外来入侵种的基因漂流等方面的信息。
通过将柱头和花柱整体透明, 用脱色苯胺蓝对花粉
粒和花粉管中具有的胼胝质染色后, 借助荧光显微镜, 可
清楚地观察到一枝黄花的花粉在加拿大一枝黄花的柱头
上萌发并生长入花柱(图1 C)。但在进入柱头和子房后,
花粉管荧光与雌蕊维管束的自发荧光不易区别, 还需要
结合其它手段进行鉴别。
2.3 苏门白酒草有性生殖过程的观察
在加载有Nomarski干涉差装置的显微镜下, 运用100倍
油镜, 通过仔细调焦, 观察到了苏门白酒草透明后的盘花
和缘花中花药和胚珠的发育过程。胚珠方面, 观察到
苏门白酒草大多数胚珠中的孢原细胞、大孢子母细
胞(图 1 D)和四分体阶段。四分体中合点端的大孢子
经过液泡化阶段发育为单核胚囊(图1 E), 再经过3次
连续的有丝分裂, 发育为八核胚囊。用透明技术很容
易观察到合子发育为胚的过程(图 1 F)。花药方面,
利用透明技术观察到分别处于花粉母细胞、四分体
和单核花粉粒时期的花药, 表明其雄配子体的发育属
于有性生殖。
除了快速地观察到以上结果外, 整体透明技术在苏
门白酒草的研究中还显示出其它的优点, 如观察整个花
序中各个花的发育是否同步, 进行雌蕊和雄蕊的发育时
期的比较, 研究内部发育状态与外部性状的相关性等。
3 讨论
3 . 1 整体透明技术在植物生殖生物学研究中的
应用
目前整体透明技术应用最广的是植物生殖生物学领域。
Herr (1971)和Crane (1978) ①先后发明了“41/2”复合
透明剂和冬青油等观察整体胚珠中的胚囊。Stelly等
(1984)提出了“染色-透明”技术, 即先用梅氏苏木精明
矾染色, 再用冬青油透明, 之后在普通显微镜下观察。
在此基础上 , 我国著名的实验生殖生物学家杨弘远
(1986)建立了“爱氏苏木精短时间染色-冬青油透明”的
新方法。有关此前应用此法于植物生殖生物学研究的
① Crane CF (1978). Apomixis and crossing incompatibilities in some Zyphyrantheae. Ph. D. Thesis, University of Texas, Austin,
TX.
图 1 3种植物器官的整体透明图
(A, B) 番茄主根, 示侧根原基 (△所示), (A, 显微镜照片, Bar=200 mm; B, 解剖镜照片, Bar=1 mm);
(C) 一枝黄花的花粉粒和加拿大一枝黄花的柱头亲和性识别反应的荧光照片; 多个花粉粒 (△所示)在柱头上萌发并长入花柱中(Bar=100
mm);
(D-F) 苏门白酒草的子房整体透明照片, 示胚珠发育的不同时期, (D, 大孢子母细胞时期, Bar=10 mm; E, 单核胚囊时期, Bar=10 mm; F,
成熟胚时期, Bar=100 mm)。
MMC: 大孢子母细胞; In: 珠被; MNES: 单核胚囊; DM: 退化大孢子; Em: 胚
Figure 1 Photos of different organs after whole clearing
(A, B) Main root of tomato, showing the lateral root primordium, (A, Photographed by microscope, Bar=200 mm; B, Photographed by
dissecting microscope, Bar=1 mm);
(C) Fluorescence photo of compatibility recognizing between pollens of common goldenrod and stigma of goldenrod, showing the
pollens germinated on the stigma and grown into the style (Bar=100 mm);
(D-F) The photos of whole clearing ovaries of Conyza sumatrensis, showing the different stage of ovule development, (D, Stage
of megaspore mother cell, Bar=10 mm; E, Stage of mononucleus embryo sac, Bar=10 mm; F, Stage of mature embryo, Bar=100 mm);
MMC: megaspore mother cell; In: integument; MNES: mono-nucleus embryo sac; DM: degenerated megaspore; Em: embryo
®
494 植物学通报 24(4) 2007
文献资料可参见Johri和Ambegaokar (1984)及杨弘远
(1988)的论述。由于苏木精的染色程度不易控制, 致使
染色偏深、透光度受限和反差弱, 使整体染色透明的技
术只适用于较小的样本。Hodnett等(1997)利用Azure
C(亚甲基蓝的氧化物)的染色程度容易掌握的特点, 用其
代替苏木精染色, 再经过CCD对视频信号和图像的处理
过程来调节反差, 在观察厚达300 mm的海岛棉受精期的
胚珠时取得了满意的效果。
迄今为止, 已利用整体透明或整体染色透明技术观
察了多种被子植物的大、小孢子发生与雌、雄配子体
发育, 还用此技术进行了植物生殖方式的鉴定和实验胚
胎学的研究工作。Mariani等 (1993)利用梅氏苏木精染
色 -透明技术对紫苜蓿5个二倍体突变体的异常花粉和
多核大、小孢子的来源进行了研究, 发现其四核巨大花
粉 (jumbo pollen)是由于减数分裂后未进行胞质分裂的
结果, 二核或三核大孢子是由于减数分裂后未进行第一
次或第二次胞质分裂的结果。多核大孢子中的核可融
合为 2n核。Calderini和Mariani (1995)进一步利用梅
氏苏木精染色-透明技术对这些突变体的雌配子体发育
过程进行了研究, 发现所有的突变体胚囊中存在数目不
等的超数核 , 这些超数核由多核大孢子发育而成。
Liang和Herr (1994)利用“41/2”复合透明技术进行了裸
子植物杉木的胚胎学研究。
在无融合生殖方式的鉴定方面, 该技术已成为一种
重要的鉴定手段。如对蒺藜草属的 Cenchrus ciliaris
(Young et al., 1979)无孢子生殖的研究, 对雪白委陵菜
(Eriksen and Fredrikson, 2000)、南芥属的 Arabis
gunnisoniana (Task in et al. , 2004)、蒲公英属
(Taraxacum) (van Baarlen et al., 2002)和飞蓬属
(Erigeron)(Noyes and Allison, 2005)中的二倍体孢子生
殖种的鉴定等。
除了上述应用外, 此技术也被应用于转基因植物基
因表达的结构和发育方面的研究。Czako等 (1992)对
拟南芥和烟草的种子致死基因的分化机理进行了研究。
Liedl等 (1993)利用透明技术对番茄花粉管和胚珠中的
GUS进行了组织化学定位。
3.2 整体透明技术在植物生物学应用中的优缺
点分析
整体透明技术在植物生物学的教学和研究中有着广泛的
用途。作为一种快速制样与观察的手段, 它不仅大大减
轻切片技术所需的人力和物力, 而且便于在观察时获得
三维图像, 在不破坏整体结构的条件下对所研究的目标
作原位的考察 (杨弘远, 1988)。Young等 (1979)经过
对透明法和切片法的比较研究, 认为前者简单易行, 花费
时间只有后者的 1/10。我们对整体透明技术在部分菊
科植物生殖过程的研究中的应用表明, 对形态微小的整
个花经过整体透明后, 不仅能在短时间内大量地观察雌
雄蕊的生殖过程, 而且能同时观察整个花序中各个花的
发育是否同步、比较雌蕊和雄蕊的发育时期以及内部
发育状态与外部性状的相关性等。对较大的材料, 将其
制成100 mm左右的厚切片, 经过透明后观察, 可避免同
一组织中的多个细胞分布在不同切片中的弊端, 也节省
了人力和物力。
但整体透明技术观察胚珠发育也有其不足之处, 如
在观察大孢子母细胞的减数分裂的细节方面效果不佳;
若没有较好的CCD或数字图像摄影系统, 不染色的材料
在摄影时的反差不足, 将不能达到理想的观察效果; 此
外, 需要观察者有一定的生殖过程的观察经验和知识积
累等。因此, 在需要研究某个特定时期的细微结构时,
将经过整体透明后的材料制作成石蜡切片或半薄切片再
进行观察, 可大大提高研究的效率和准确度。
3.3 透明剂的选择和使用
在本文所涉及的3类研究中, 分别利用常用的3种透明
剂, 即强碱 (NaOH或 KOH)、冬青油和甘油对不同的
材料进行处理, 都取得了良好的效果。除了以上透明剂
外, 常用的透明剂还有: “4 1/2”复合透明剂 (Herr ,
1971)、乳酸 - 苯酚、水合氯醛、二甲苯、氯仿、丁
香油、香柏油和苯胺油等 ( 錩郑国 和谷祝平, 1993; 李
正理, 1996)。如何选择适合的透明剂和透明时间, 尤其
是采用整体染色透明技术时的染色程序和时间等, 需根
据植物的器官性质和透明后所要观察的结构等进行摸
495郝建华等: 整体透明技术在植物生物学中的应用实例及其剖析
索。一般来说, NaOH等腐蚀性透明剂选择性地溶解细
胞或组织中的成分, 使某些或某种特定的细胞或结构显
示出来, 达到透明的效果。而“41/2”复合透明剂和冬青
油等光学性透明剂属于非损伤性透明剂, 它们不破坏或
能基本保留细胞或组织成分, 使细胞核和液泡等在不同
的光学平面上显示出来。有的材料直接透明效果不佳,
可在透明前采取各种预处理方法加以改善, 有关这方面
的详细情况, 可参见Gardner (1975)的综述。如要观察
维管束的结构, 就需要选择性地抽提掉细胞内的成分, 溶
解部分后含物, 使细胞壁中的纤维素和果胶质完好, 植物
材料保持其整体形态。Shih等 (1983)在对糖槭、芜
菁、西瓜和向日葵等油料种子和幼苗的透明观察中, 以
石油醚、氯仿和丙酮等处理后, 经过系列乙醇下降至
水, 再经过氢氧化钠、水合氯醛、氯化钠和沸腾的稀硫酸
处理, 用碱性品红染色观察维管束中导管, 用水溶性苯胺蓝
诱导荧光观察筛管, 取得了良好的效果。其中的石油醚、
氢氧化钠和水合氯醛以及稀硫酸分别起抽提脂类、蛋白质
以及其它的残留物质的作用, 便于维管束透明。
3.4 整体透明技术与显微镜的配合使用
整体透明技术处理后的材料, 特别是不经过染色的材料,
常需要经过一些特殊显微镜或显微镜中的特殊装置观
察。如George等 (1979, 1988)将大豆和绿豆胚珠透明
后经相差显微镜下观察其胚珠和雌配子体发育过程;
Aulbach-Smith和Herr (1984)用同样的方法对禾本科美
洲真穗草和 E.glauca的胚珠进行了类似研究。Herr
(1973)和Palser等 (1989, 1992)成功地用微分干涉差显
微镜对透明后的E. glauca胚珠进行了雌配子体发育和
花粉管生长的观察。Fredrikson等(1988)和Fredrikson
(1990, 1992)在兰科植物 Dactylorhiza maculata、角
盘兰和火烧兰属 (Epipactis)的胚胎学研究中, 应用激光
扫描共聚焦显微镜获得了良好的观察效果。杨弘远
(1986, 1988)在20世纪80年代从具体的材料和实验方
法方面, 对此技术在国内的植物生殖生物学中的推广应
用提供了极其宝贵的方法上的指导。由于当时国内只
有少数单位有相差显微镜或干涉差显微镜, 因此杨先生
的研究更偏重于先染色后透明的方法, 便于在普通显微
镜下也能进行观察。但遗憾的是, 此方法并未在国内的
植物生殖生物学研究中得到广泛应用, 尤其是未见到对
胚珠发育早期, 即从孢原细胞到八核胚囊时期以前的发
育过程的报道。
进入 21世纪以来, 随着各种特殊显微镜如相差、
微分干涉差、荧光或激光扫描共聚焦显微镜等的普遍
使用, 极大地促进了此技术的应用。其中近年来较受关
注, 应用最成功的是结合微分干涉差显微镜和激光扫描
共聚焦显微镜的应用。如微分干涉差显微镜被用于南
芥属的 Arabis gunnisoniana (Taskin et al., 2004)、
蒲公英属 (van Baarlen et al., 2002)和飞蓬属 (Noyes
and Allison, 2005)的雌配子体发育, 以及同源四倍体水
稻的受精和胚胎形成过程的研究(张华华等, 2006); 激光
扫描共聚焦显微镜则被用于雪白委陵菜(Eriksen and
Fredrikson, 2000)、水稻的胚囊形成和发育、同源四
倍体水稻的受精和胚胎形成过程(张华华等, 2003, 2006;
郭海滨等, 2006)以及裸子植物花粉发育等(李国平和黄
群策, 2005; 李国平等, 2006)的研究。但目前此方法仅
对裸子植物离体花粉管中的发育过程进行了观察。相
信随着研究的深入, 还应当能对生活状况下裸子和被子
植物的花粉管在雌蕊、尤其是在花柱和胚囊中的动态
发育过程进行追踪和观察。
目前国内很多单位已购买了微分干涉差显微镜或复
合显微镜中的微分干涉差装置, 激光扫描共聚焦显微镜
的使用也日益普遍, 这为整体透明技术的广泛应用奠定
了基础, 也为植物生物学的研究提供了更加灵活、多样
的手段和方法。
致谢 南京农业大学生命科学学院生物技术33班
李昕同学帮助制作图版, 在此表示感谢。
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497郝建华等: 整体透明技术在植物生物学中的应用实例及其剖析
The Examples and Analysis of Wholemount Clearing Techniques
in Plant Biology
Jianhua Hao 1,2, Sheng Qiang 1 *
1Weed Research Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
2Department of Biology, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China
Abstract The application of wholemount clearing techniques with different clearing agents and clearing methods in plant biology
are illustrated by three examples: measuring lateral root primordium number in tomato (Lycopersicon esculentum), recognizing
compatibility between pollen of common goldenrod (Solidago decurens) and the stigma of goldenrod (S. canadensis), and observ-
ing the development of the ovule of Conyza sumatrensis. This article reviews applications in plant biology research, especially of
plant reproduction biology, and advantages and disadvantages of the whole clearing techniques. Some technique details such as
the choice and use of clearing agents and association with specific microscopes are discussed.
Key words microtechnique, plant biology, plant reproductive biology, wholemount clearing techniques
Hao JH, Qiang S (2007). The examples and analysis of wholemount clearing techniques in plant biology. Chin Bull Bot 24, 490-497.
(责任编辑: 孙冬花)
* Author for correspondence. E-mail: wrl@njau.edu.cn
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