全 文 ：植物学通报 2005, 22 (增刊): 43~49
Chinese Bulletin of Botany
①教育部博士点基金(20030284044)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zhangzhijun.student@sina.com
收稿日期: 2003-11-12 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 崔郁英, 于昕
实 验 简 报
油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生①
1张智俊② 2罗淑萍 2李亚玲 3毕方铖 3谭晓风
1(南京大学生命科学学院 南京 210093) 2(新疆农业大学农学院 乌鲁木齐 830052)
3(中南林学院生命科学院 长沙 412006)
摘要　以油茶优良无性系‘湘林4号’子叶为外植体, 采用附加不同种类激素的MS培养基对其进行组织培
养实验。研究结果表明: 子叶形成胚性愈伤组织的最适合培养基为MS+2.0 mg.L-1 2, 4-D+1.0 mg.L-1 KT;
经胚状体诱导产生不定芽分化的最适合培养基为MS+2.5 mg.L-1 6-BA+1.5 mg.L-1 IAA; 油茶优良无性
系的生根培养基以MS+7.0 mg.L-1 NAA最适; 通过对植株再生过程中各阶段的组培材料进行RAPD鉴定
分析表明, DNA水平上未发现变异, 说明通过组织培养建立的油茶优良无性系再生植株同原无性系无明
显差别, 最终获得的组培苗木能够保持原无性系的优良特性, 其遗传是稳定的。
关键词　油茶, 无性系, 体细胞胚, 组织培养
Plant Regeneration through Somatic Embryogenesis Formation
from Cotyledons of Camellia oleifera Clone
1ZHANG Zhi-Jun② 2LUO Shu-Ping 2LI Ya-Ling 3BI Fang-Cheng 3TAN Xiao-Feng
1(College of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093)
2(College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urmq 830052)
3(College of Life Science, Centre-south Forestry University, Changsha 412006)
Abstract Cotyledons of explants from ‘xianglin-4’ (XL-4), a Camellia oleifera clone, were cultured
in MS medium with different hormones. Results showed that the optimal medium for embryogenetic
callus formation was MS with 2.0 mg.L-1 2,4-D and 1.0 mg.L-1 KT; the optimal medium for shoot
development via embryos was MS with 2.5 mg.L-1 6-BA and 1.5 mg.L-1 IAA; the optimal medium
for root inducement was MS with 7.0 mg.L-1 NAA. Some materials from different processes of plantlet
regeneration were discriminated by RAPD analysis. However, no mutations or differentiation were
discovered. Therefore, it can be concluded that plantlets from tissue culture do not differ from quon-
dam clones and can maintain the hereditary consistency well.
Key words　Camellia oleifera, Clone, Somatic embryogenesis, Tissue culture
油茶(Camellia oleifera)是多年生常绿乔木,
属山茶属山茶科、虫媒异花授粉双子叶植物,
是世界四大木本油料之一。油茶的主要产品
茶油中含有90%左右的不饱和脂肪酸, 还富含
44 22(增刊)
脂溶性维生素 A、E、K等, 经常食用茶油可
预防心血管硬化, 并有降血压和血脂等功效(庄
瑞林, 1988)。因此, 茶油被公认为是一种理想
的营养保健食用油, 可以和橄榄油媲美。
油茶是我国特有树种之一, 同其他山茶属
植物一样, 其细胞不易诱导分化产生再生植株,
造成油茶组织培养的难度较大。目前, 国内外
相关报道很少, 隆振雄(1981)曾对油茶花药进行
培养获得绿芽点和根, 但未获得再生植株。在
实际生产中, 油茶优良无性系在低产油茶林改良
中起了非常关键的作用, 是提高油茶产量和品质
的重要保障。目前, 我国南方大面积油茶改良
急需优质种苗的供应, 而常规的扦插嫁接繁殖远
不能满足生产的需要。另外, 对油茶优良无性
系的进一步培育工作, 如对杂种后代的繁殖, 原
生质体培养, 外源基因的遗传转化等, 都需要依
靠组织培养的技术手段来解决这些问题。因
此, 开展油茶优良无性系的组织培养研究具有重
大的生产和科研价值。
1 材料和方法
1.1 实验材料
油茶优良无性系‘湘林4号’子叶, 由湖南林
业科学院长沙油茶优良无性系种质资源圃提供。
1.2 培养基制备
采用的基本培养基为 N6、MS、White、
改良ER, 加入适量的2,4-二氯萘氧基乙酸(2,4-
dichlorophenoxy, 2,4-D)、6-苄基氨基嘌呤(6-
Benzylaminopurine, 6-BA)、a-萘乙酸(a-Naph-
thalene acetic acid, NAA)和 6-糖氨基嘌呤(6-
Furfuryalmino purine, KT)等生理活性物质。按
照不同组合配制出诱导培养基和分化培养基。
蔗糖浓度为3%, 琼脂为1%, pH值调到5.6～
5.8左右, 1.1 kg.cm-2, 121 ℃下灭菌20分钟后,
避光保存备用。
1.3 外植体培养
在无菌条件下将萌发膨大的子叶小心切成
小块, 置于不同激素配比的体细胞胚诱导培养基
中。将接种好的各种材料置于培养室, 培养室
温度保持在25～28 ℃之间, 人工辅助光照16小
时 /天, 光照强度为 2 500 lx。每 7天继代 1次,
获得的丛生苗要及时分离, 转入含有不同生长激
素的MS培养基中, 诱导生根。定期观察生长
状态, 记录实验各项数据。
1.4 体细胞无性系的RAPD分析
分别选取培养过程中的不同阶段的愈伤组
织、体细胞胚、体细胞胚再生植株叶片、对
照子叶叶片各15份样品, 各自混合后提取基因
组DNA, 进行RAPD分析, 鉴定在体细胞胚植株
再生过程中, 外植体不同分化阶段遗传的稳定
性。所采用的 22条引物是从 300条引物中筛
选出来用于鉴定不同无性系的多态性引物(另文
发表), PCR反应程序为: 95 ℃预变性3分钟, 然
后94 ℃变性30秒, 38 ℃退火30秒, 72 ℃延伸
60秒, 35个循环后, 72 ℃延伸 5分钟。取PCR
产物5 mL进行琼脂糖凝胶电泳, Bio-Rad2000拍
照后, 观察记录数据。
2 实验结果与分析
2.1 不同的外源激素对子叶胚性愈伤组织
诱导的影响
将经消毒处理过的油茶子叶块接种于附加
不同种类外源激素的MS培养基上, 实验结果见
表 1。从表 1可知, 当外源激素为 2.0 mg.L-1
2,4-D+1.0 mg.L-1 KT时, 对胚性愈伤组织的
诱导最好, 诱导率可达76.67%, 说明2,4-D附
加适量的KT有利于胚性愈伤组织的形成; 当
2,4-D与6-BA搭配使用时, 愈伤组织的诱导率
也有一定程度地增高; 单独使用2,4-D或者6-
BA也可诱导产生胚性愈伤组织, 但效果不及
两种激素配合使用的效果。当培养基中不加
任何激素时, 产生愈伤组织很少, 且后期培养
不能产生体细胞胚, 这说明诱导胚性愈伤组织
中必须有激素的参与, 而且适当浓度的2,4-D
452005 张智俊等: 油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生
的诱导效果较 6-BA要好。
2.2 不同基本培养基对胚性愈伤组织诱导
的影响
将子叶接种在 N6、MS、White、改良
ER并附加了2.0 mg.L-1 2, 4-D+1.0 mg.L-1 KT
的 4种培养基上, 其间每隔 7天继代一次。培
养25天后, 各种不同基本培养基上都有愈伤组
织发生, 定时记录愈伤组织的培养状况。实验
结果见表 2。
由表2可知, MS为基本培养基的诱导效果
最好, 改良ER和White次之, N6诱导效果稍差。
但总体来看, N6、MS、改良 ER和White作
为培养基都可得到较好的效果, 诱导的胚性愈伤
组织结构紧密, 呈绿色、淡黄色或乳白色, 质
量较好(图1A)。综上所述, 子叶胚性愈伤组织
诱导的基本培养基可确定为MS+2.0 mg.L-1 2,
4-D+1.0 mg.L-1 KT。
2.3 不同激素浓度对体细胞胚产生不定芽
的影响
培养 25天后的胚性愈伤组织再经过一次
继代培养后, 绿色逐渐加深, 体积也逐渐膨大。
此时将绿色愈伤组织取出, 转至新鲜的不同激素
配比的器官分化培养基上, 培养1个月后, 在愈
伤组织表面及其周围有大量的体细胞胚发生, 体
细胞胚成小颗粒状、拳头状、花苞状、子叶
状等多种形状, 并相互重叠(图1B~D)。继续培
表 1 不同的外源激素对子叶胚性愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effects of various hormones concentration on the embryogenetic callus induction for cotyledon
Various hormones Number of explants Number of callus Percent of callus induction (%)
2.0 mg.L-1 2, 4-D+0.1 mg.L-1 KT 30 15 50.00
2.0 mg.L-1 2, 4-D+1.0 mg.L-1 KT 30 23 76.67
2.0 mg.L-1 2, 4-D+3.0 mg.L-1 KT 30 14 46.67
0.1 mg.L-1 2, 4-D 30 11 36.67
2.0 mg.L-1 2, 4-D 30 19 63.33
4.0 mg.L-1 2, 4-D 30 9 30.00
0.1 mg.L-1 6-BA 30 9 30.00
1.0 mg.L-1 6-BA 30 14 46.67
3.0 mg.L-1 6-BA 30 8 26.67
2.0 mg.L-1 2, 4-D+0.1 mg.L-1 6-BA 30 11 36.67
2.0 mg.L-1 2, 4-D+1.0 mg.L-1 6-BA 30 15 50.00
2.0 mg.L-1 2, 4-D+3.0 mg.L-1 6-BA 30 12 40.00
none 30 6 20.00
2, 4-D. 2,4-二氯苯基乙酸; KT. 激动素; 6-BA. 6-苄基氨基嘌呤
2, 4-D. 2,4-dichlorophenoxy; KT. kinetin; 6-BA, 6-benzylamino purine
表 2 基本培养基对胚性愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of Basic Medium on the embryogenetic callus Induction
Embryogenetic callus
Medium Number of explants
Number of callus Percent of callces induction (%) Color Growth status
N6 40 21 52.5 green, light yellow fast
MS 40 32 80.0 green, milk yellow fast
White 40 29 72.5 green, light yellow slow
Gailiang ER 40 30 75.0 green, milk white slow
46 22(增刊)
表 3 不同激素浓度对体细胞胚产生不定芽的影响
Table 3 Effects of various hormones concentration on the generation of embryos and shoots
Hormones concentration The embryogenetic The embryogenetic Percent of shoot
callus callus with shoots induction (%)
3.0 mg.L-1 6-BA+0.5 mg.L-1 IAA 40 29 72.50
3.0 mg.L-1 6-BA+1.0 mg.L-1 IAA 40 28 70.00
3.0 mg.L-1 6-BA+1.5 mg.L-1 IAA 40 31 77.50
2.5 mg.L-1 6-BA+1.5 mg.L-1 IAA 40 37 92.50
4.0 mg.L-1 6-BA+1.5 mg.L-1 IAA 40 27 67.5
3.0 mg.L-1 6-BA+0.01 mg.L-1 NAA 40 33 82.50
3.0 mg.L-1 6-BA+0.05 mg.L-1 NAA 40 38 95.00
3.0 mg.L-1 6-BA+1.0 mg.L-1 NAA 40 36 80.00
4.0 mg.L-1 6-BA+0.05 mg.L-1 NAA 40 33 82.5
2.0 mg.L-1 6-BA+0.05 mg.L-1 NAA 40 34 85.00
养 2 ~ 3 周会有大量的不定芽的出现（图 1
E~G)。对不同水平的 6-BA和 IAA及NAA对
体细胞胚分化效果进行了比较, 结果见表 3。
从表中可以看出, 不同配比的 6-BA+IAA
和 6-BA+NAA均可诱导愈伤组织并经体细胞
胚产生不定芽, 但在诱导频率和不定芽产生数量
上差异明显。2.5 mg.L-1 6-BA+1.5 mg.L-1 IAA
和3.0 mg.L-1 6-BA+ 0.05 mg.L-1 NAA时效果
最好, 诱导频率均在 90%以上。
2.4 不同的激素对油茶苗生根的影响
将分化出的芽经过3次继代培养(7天继代
一次)后, 多形成芽丛。待丛生芽生长至长度为
2 cm左右时, 将2～3个小芽同愈伤组织一起从
芽丛中切下, 移入附加有相同浓度(5 mg.L-1)的
不同种类生长素的MS生根培养基中, 诱导生根
结果如表 4。
在以上3种生长素中, NAA诱根率最高, 达
到 73.33%, IBA和 IAA的诱根率则明显低于
NAA。NAA诱导出的根系粗壮, 出根快, 一般
培养15天左右开始出根, 且根多为一条, 无侧根
出现(图1H~J), 但仍可获得长势较好的再生小植
株(图 1K, L)。
2.5 不同浓度的NAA对油茶苗生根的影响
在MS培养基中加入不同浓度的生长素
NAA, 将油茶不定芽移入, 20天后观察不定芽的
生根情况, 结果见表5。从表中可以看出, 生长
素NAA浓度从3 mg.L-1递增到7 mg.L-1, 根的
诱导率也相应增加; 但当NAA用量超过 7 mg.
L-1时, 出根率反而降低; 当用量为 9 mg.L-1则
出现叶黄枯死的现象。因此对NAA来说, 最佳
诱导生根的浓度为 7 mg.L-1。
2.6 RAPD扩增结果
通过RAPD检测油茶优良无性系组培不同
时期材料的遗传变异情况。各供试材料以 22
条不同引物扩增的谱带之间不存在多态性(图
2)。可推断各供试材料在DNA水平上无差异,
即体细胞胚再生植株过程中没有检测到变异发
生, 说明再生植株能够保持遗传上的稳定性。
由体细胞胚再生的植株可保持优良无性系的优
良特性, 不会出现因大量变异问题导致产量下
降和品种的退化。
3 讨论
3.1 油茶优良无性系体细胞体细胞胚成苗
迄今, 已在数百种植物中观察到体细胞胚
的发生, 几乎所有活的组织和器官都可能被诱导
形成体细胞胚。但不同植物以及同一植物的
不同品种、不同类型、不同组织或器官诱导
472005 张智俊等: 油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生
体细胞胚形成的条件差异很大。在油茶子叶
体细胞胚形成过程中, 有许多因素影响体细胞胚
的形成, 如培养基、培养条件和激素等, 其中
激素的影响最大。实验中发现2,4-D对油茶胚
性愈伤组织的诱导有促进作用。
油茶优良无性系的生根培养获得的再生植
株多数只有一条主根, 通过提高生长素和变换不
同的生长素, 本实验在生根处理中使用生长素浓
度已高达7 mg.L-1, 仍然不能诱导更多的须根出
现(图1L)。通过降低生长素浓度或者在不含激
素的MS培养基培养外植体生根也多是一条根,
且生长缓慢, 可见油茶生根培养中对激素有一定
的要求, 但对于激素的浓度要求并不是很严格。
另外, 在实验中发现, 有少数胚性愈伤组织直接
形成的不定根具有很多绒毛状须根, 但生长较为
细弱, 主根现象自然明显(图1H), 但是较为细弱,
图 1 油茶优良无性系组织培养
A. 胚性愈伤组织; B~D. 体细胞胚; E~G.由体细胞胚再生的从芽; H~J. 由体细胞胚产生的不定根; K, L. 再
生植株
Fig.1 Tissue culture of Camellia oleifera clone
A. Embryogenetic callus; B~D. Embryo; E~G. Shoots from embryo; H~J. Roots from embryo; K, L. Regeneration
planets
48 22(增刊)
表 4 不同的激素对油茶苗生根的影响
Table 4 Effects of various hormones on the generation of roots
Auxin Concentration (mg.L-1) Number of explants Number of roots Percent of root induction (%)
NAA 5 30 22 73.33
IBA 5 30 14 46.67
IAA 5 30 7 23.33
在继代培养中易折断。针对油茶组培中生根培
养只有主根而很少产生侧根或须根的原因, 可能
同油茶的主根性有关, 但具体的原因还有待进一
步的研究。
3.2 体细胞胚无性系再生植株的 RAPD分
析
一般认为, 体细胞胚只起源于一个细胞,
由体细胞胚形成的再生植株各部分的遗传组
成应当是一致的, 不存在嵌合现象(崔凯荣,
1993), 但在培养过程中也可能会带来变异。
对组培中产生的这些变异株在外观上很难分
辨, 所以需要使用RAPD等方法进行变异的快
速检测(肖顺元和Freerick, 1995; 张开春和覃
兰英, 2000; Atienzar et al. , 2002)。尽管在
本实验中油茶无性系再生植株经RAPD分析
未发现变异现象, 但仍然不能完全排除变异再
生植株的出现。为了降低变异发生的频率,
在组培过程中激素的用量应尽可能减小, 以免
在长期的培养过程中细胞分裂不正常, 如染色
体倍数发生变化等, 从而影响无性系后代的优
良遗传性状。
本实验成功地通过油茶无性系体细胞胚获
得了再生植株, 该研究可以作为油茶种质保存、
原生质体培养及基因转导等相关研究的理想实
验体系, 因而在苗木繁殖及树种改良等方面都具
有广阔的应用前景。
表 5 不同浓度的NAA对油茶生根的影响
Table 5 Effects of NAA on the generation of roots
NAA Number of Number of Percent of root
(mg.L-1) explants roots induction (%)
3 30 11 36.67
4 30 15 50.00
5 30 22 73.33
6 30 25 83.33
7 30 28 93.33
8 30 24 80.00
9 30 16 53.33
图 2 利用 RAPD技术检测油茶优良无性系组培
苗的遗传稳定性
1-4. S1469 引物扩增结果, 模板分别来自于: 1. 胚
性愈伤组织; 2.胚状体; 3. 胚状体再生植株叶片; 4.
对照 4号叶片DNA。5-8. S1127引物扩增结果,
模板分别来自于: 5. 腋芽再生植株; 6. 胚状体; 7. 胚
状体再生植株叶片; 8. 对照叶片 4号DNA。M. 标
准分子量DL2000
Fig.2 Detection of genetic variability in regeneration
plants from tissue culture of Camellia oleifera clones
by RAPD.
Line 1-4 is the amplification results by primer s1469
their templates are the followings: line 1, regenera-
tion plants from axillary buds; line2, embryo; line 3,
regeneration plants from embryos; line 4, CK. Line
5-8 is the amplification results by primer s1127
their templates are the followings: line 5, regenera-
tion plants from axillary bud; line 6, embryo; line 7,
regeneration plants from embryos; line 8. CK. M.
DL2000 marker
492005 张智俊等: 油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生
参 考 文 献
崔凯荣 (1993) 植物体细胞胚胎发生研究的某些现状. 植
物学通讯, 10: 14-20
隆振雄 (1981) 油茶花药培养获得绿芽点和根. 林业科
技通讯, 5: 6-9
肖顺元, Freerick G (1995) RAPD分析 -鉴定柑橘体细
胞杂种的快速方法. 遗传, 17(4): 40-42
张开春, 覃兰英 (2000) 樱桃小茎尖培养后的早熟变异
与 RAPD鉴定. 果树科学, 17: 225-227
庄瑞林 (1988) 中国油茶. 国林业出版社, 北京, 1-5
Atienzar FA, Evenden AJ, Jha AN, Depledge MH (2002)
Use of the random amplified polymorphic DNA
(RAPD) assay for the detection of DNA damage and
mutations: possible implications of confounding factors.
Biomarkers, 7: 94-101