全 文 ：植物学通报 2005, 22 (3): 302~306
Chinese Bulletin of Botany
① 国家自然科学基金项目(39525002, 39570067)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: rongguili@yahoo.com
收稿日期: 2005-01-21 接受日期: 2005-03-24 责任编辑: 于昕
研 究 论 文
蓝细菌 Anacystis nidulans R-2藻胆体中 43 kD
蛋白细胞定位的初步研究①
李荣贵② 汪靖超
(青岛大学生物系, 山东省天然色素重点实验室 青岛 266071)
摘要 高盐浓度条件下分离了蓝细菌Anacystis nidulans R-2的藻胆体, 藻胆体中存在一种43 kD的蛋
白。Western blotting 分析表明, 该蛋白能与蓝细菌Fd:NADP+氧还酶中FNR结构域的抗体发生反应, 解
聚的藻胆体具有FNR黄递酶的活性, 初步证明该43 kD蛋白就是Fd:NADP+氧还酶。TritonX-114分相
实验表明, 这种43 kD的蛋白不能进入TritonX-114相。对藻胆体的部分解聚合实验表明, 富含外周杆
的组分中不存在43 kD的蛋白。
关键词 Anacystis nidulans R-2; 藻胆体; Fd:NADP+氧化还原酶
Preliminary Studies on the 43-kD Protein in Phycobilisomes
of Cyanobacterium Anacystis nidulans R-2
LI Rong-Gui② WANG Jing-Chao
(Key Laboratory for Natural Pigment of Shandong Province, Department of Biology, Qingdao
University, Qingdao 266071)
Abstract Phycobilisomes, containing a 43-kD protein, were isolated from Anacystis nidulans
R-2. Dissociated phycobilisomes exhibited FNR diaphorase activity. Western blotting showed
that the 43-kD protein could react with antibodies raised against Fd:NADP+ oxidoreductase.
Analysis by Triton X-114 phase-partitioning indicated that the 43-kD protein could not enter
into the detergent phase. Partial dissociation of phycobilisomes revealed no 43-kD protein in the
fractions mainly containing rod components.
Key words Anacystis nidulans R-2, Phycobilisome, Fd:NADP+ oxidoreductase
F d : N A D P + 氧化还原酶( F d : N A D P +
Oxidoreductase, EC1.18.1.2, 简称FNR)是生物
体中广泛存在的一类黄素酶, 催化电子在分子
之间的传递。高等植物FNR具有两个结构域
(FNR-2D), 主要催化电子从Fd到NADP+的传
递。Karplus等(1991)最先报道了只含两个结
构域的菠菜FNR的晶体结构, 从空间结构上
看, 每个结构域约含有150个氨基酸残基, C-
末端的结构域结合NADP(H), N-末端结构
域容纳 FAD 辅基。
304 22(3)
与含两个结构域的高等植物 FNR不同,
Synechococcus sp. PCC 7002 FNR的 N末端
高度伸展, 组成FNR的第三个结构域(类CpcD
结构域), 因此蓝细菌 FNR又称为三结构域
FNR(FNR-3D)(Scluchter and Bryant, 1992;
Gomez-Lojero et al., 2003), 该结构域与藻胆体
(phycobilisome, PBS)中的连接多肽 CpcD有
78%的同源性(Schluchter and Bryant, 1992), 蓝
细菌 Synechocystis FNR的类CpcD结构域与
该蓝细菌PBS的另一连接多肽CpcC的C-末
端有69%的同源性, 与核心杆(core)连接多肽
ApcC有 65%同源性(Gomez-Lojero et al.,
2003)。蓝细菌FNR的类CpcD结构域在最初
被发现的一段时间内人们并不知道它的作用,
李荣贵等(1998, 1999)曾将编码蓝细菌FNR的
petH基因以及删除类CpcD结构域编码区的
Δ petH基因在大肠杆菌中进行了表达, 经纯
化获得了重组FNR以及缺失类CpcD结构域的
FNRD。FNR与 FNRD的活性研究表明, 类
CpcD结构域对该酶的黄递酶活性及依赖于
CytC6的NADP+光还原活性没有影响, 二者在
最适温度、最适 pH值及催化效率等方面也
无明显差别。由于类CpcD结构域对 FNR的
催化活性没有影响, 因此推测该结构域可能与
蓝细菌 FNR的细胞定位有关。
Schluchter和Bryant(1992)等首次证明了
蓝细菌Synechococcus sp. PCC 7002的藻胆体
中存在FNR , 并推测FNR 可能通过类CpcD结
构域定位在藻胆体外周杆(Rod)的远离核心杆
的一端(远端)。Gomez-Lojero等(2003)进一步
用实验验证了这一推测,蓝细菌 Synechoc-
occus sp. PCC 7002每个藻胆体中平均含有
1.3个FNR分子。Nakajima等(2002)首次证明
了FNR与藻蓝蛋白(phycocyanin, PC)结合, 并
分离纯化了 FNR-PC复合体。至于 FNR与藻
胆体外周杆的具体结合部分, 不同来源的实验
结果并不一致, van Thor等(1999)认为在蓝细
菌 Synechocystis sp. PCC 6803的藻胆体中
FNR结合在外周杆靠近核心杆一端的 PC上,
但不会结合在通常为CpcD蛋白所占据的外周
杆的远端。Gomez-Lojero等(2003)用藻胆体
和FNR进行的体外重组实验表明, 尽管FNR-
3D体外确实可以和缺失CpcC的藻胆体外周
杆的近端结合, 但比较FNR与外周杆不同部位
PC六聚体的亲和力时发现, 在细胞内藻胆体
的组装过程中, FNR最有可能由其类CpcD结
构域取代CpcD蛋白而结合在外周杆远端, 只
有这样FNR才不至于影响外周杆PC对光能的
吸收与能量传递。到目前为止FNR在藻胆体
上的确切定位及其功能还不很清楚, 本文报道
了蓝细菌Anacystis nidulans R-2的藻胆体中
存在FNR, 并对藻胆体中 FNR的细胞定位进
行了初步的研究。
1 材料与方法
1.1 蓝细菌培养
蓝细菌Anacystis nidulans R-2接种于
Bg-11液体培养基中, 光照条件下, 28 ℃通
气(含 1%CO2的无菌空气)培养 , 48小时后
离心收集菌体。
1.2 蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体
的分离
藻胆体的分离参照Yamanaka等(1982)的
方法, 略有改动。1 L培养液培养的蓝细菌菌
体重悬于30 mL Na2KPO4缓冲溶液(1.0 mol·L-1,
pH7.5)中, 室温下用 French Pressure Cell
(15 000 psi)破碎细胞2次, 向细胞裂解液中加
入Triton X-100至终浓度为1.0%(V/V), 室温搅
拌30分钟, 18 ℃, 48 500g离心30分钟, 弃上
清液, 沉淀用 0.6 mol.L-1 Na2KPO4缓冲溶液
(pH7.5)悬浮, 匀浆后, 加入Triton X-100至终浓
度为 1.0%, 混匀, 室温放置 30分钟, 18 ℃,
48 500 g离心30分钟, 取上清液, 用Na2KPO4
缓冲溶液(1.0 mol.L-1, pH7.5)稀释10倍, 18 ℃,
48 500 g离心1小时, 沉淀重悬于Na2KPO4缓
冲溶液(1.0 mol.L-1, pH7.5), 即得藻胆体。
3052005 李荣贵等: 蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体中43 kD蛋白细胞定位的初步研究
1.3 藻胆体FNR 黄递酶活性的测定
F N R 黄递酶活性测定参照 M a s a k i 等
(1979)的方法, 略有改动。4.0 mL反应体系中
含Tris·Cl缓冲溶液(50 mmol.L-1, pH8.0), 50
mmo l . L-1 D C P I P ( 2 , 6 - d i c h l o r o p h e n o l
indophenol), 100 mmol.L-1 NADPH, 20 mL藻胆
体溶液(10 mg.mL-1), 以加入20 mL Na2KPO4缓
冲溶液(1.0 mol.L-1, pH7.5)的反应体系为对
照。反应温度为 25 ℃ , 反应以加入 NADPH
开始, 每隔1分钟测定OD620, DCPIP的毫摩尔
淬灭系数按 20计算, 酶的催化活性以每毫克
蛋白每分钟催化 DCPIP 还原量表示(单位:
nmol.mgpr-1.min-1)。
1.4 兔抗Synechcoccus sp. PCC 7002 FNRD
抗血清的制备及Western blotting 分析
重组FNRD的制备参照李荣贵等(1999)的
方法进行, 兔抗FNRD抗血清的制备及West-
ern blotting 分析参照Sambrook等(1989)的方
法进行。
1.5 蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体
的TritonX-114分相研究
离心得到的藻胆体沉淀用Tris·Cl缓冲溶
液(50 mmol.L-1, pH7.5,10 mmol.L-1 EDTA)悬
浮, 冰浴放置 5分钟。加入等体积的冰冷的
Triton X-114缓冲溶液(20 mmol.L-1 Tris.Cl,
pH7.5, 0.2 mol.L-1 NaCl, 1.0%Triton X-114), 混
匀后冰浴放置5分钟, 再室温放置10分钟, 使
分相发生。室温条件下, 12 000 g离心5分钟。
水相与Triton X-114相分别加入等体积的冰冷
的丙酮, 混匀, 冰浴放置15分钟。4 ℃, 12 000 g
离心 10分钟, 沉淀加入适量的蒸馏水及等体
积的蛋白电泳载样缓冲溶液, 进行SDS-PAGE
和Western blotting分析。
1.6 藻胆体的部分解聚合研究
参照 Yamanaka等(1982)的方法略有改
动。溶解在 0.8 mol.L-1Na2SO4(用 50 mmol.L-1
Tris.Cl, pH7.5配置)的藻胆体溶液, 加入2倍体
积浓度为60%的PEG4000, 混匀, 17 000 g离
心20分钟, 沉淀重新悬浮于Tricine缓冲溶液
(50 mmol.L-1 Tricine, 5 mmol.L-1 CaCl2, 10%
甘油, pH7.8)至蛋白浓度为1 mg.mL-1, 室温放
置1小时, 取0.5 mL样品进行0.2~1.0 mol.L-1
的连续蔗糖梯度离心, 18 ℃, 143 000 g离心17
小时,收集中间的蓝色部分, 进行 SDS-PAGE
和Western blotting分析。
1.7 其他方法
SDS-PAGE参照Laemmli(1970)的方法进
行, 凝胶用考马斯亮蓝 R250染色。
2 结果与讨论
2.1 蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体
的分离
高盐浓度条件下, 高速离心分离得到了
蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体, SDS-
PAGE分析表明, 利用该法分离的藻胆体的电
泳 谱 带 与 已 报 道 藻 胆 体 的 谱 带 相 同
(Yamanaka et al., 1982), 说明在分离过程中
藻胆体未发生解聚合, 且纯度很高, 未有其他
杂蛋白的污染, 从图中也可以看出在43 kD的
位置有一明显条带。
2.2 藻胆体FNR黄递酶活性的测定
反应体系中加入藻胆体后, 随着时间延长,
DCPIP被还原, 溶液的颜色逐渐变浅, OD620逐
渐变小, 说明藻胆体具有黄递酶活性。经过计
算藻胆体黄递酶活性是44 nmol.mgpr-1.min-1。
2.3 藻胆体中43 kD蛋白的Western blot-
ting分析
利用制备的兔抗 FNRD抗血清对所分离
藻胆体中的蛋白进行免疫分析, 结果表明, 组
成藻胆体的各种蛋白中, 只有43 kD的蛋白能
与抗FNRD的抗体反应(图1), 特异性高, 且解
聚合的藻胆体具有 FNR黄递酶活性, 说明该
43 kD的蛋白是 FNR。由于已有的研究表明,
蓝细菌 Synechococcus sp. PCC 7002 FNR的
N末端与藻胆体中的连接蛋白 CpcD、CpcC
及ApcC具有较高的同源性, 因此实验时以删
306 22(3)
特异性有明显提高, 对于研究藻胆体中的FNR
具有明显的优越性。
2.4 蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体
的TritonX-114分相研究
在低盐浓度的条件下, 藻胆体解聚合, 组成
藻胆体的各种蛋白从复合体中游离出来。
Triton X-114 进行分相时, 疏水的连接蛋白(分
子量分别为67、33和27 kD)可以进入去垢剂
相(图2 2,7泳道), 这与这些蛋白疏水性的特点
相符合, 而分子量为43 kD的FNR仍然留在水
相(图 2 1,6泳道)。这一方面说明所分离藻胆
体中的FNR不是分离过程中污染的光合膜上
的蛋白, 另一方面也说明存在于藻胆体中的
FNR并未发生脂酰化。以前的研究结果表明,
Synechoc-occus sp. PCC 7002中的部分 FNR
发生脂酰化修饰, 因而分相研究时可进入Tri-
ton X-114相 (Schluchter et al., 1992)。
2.5 藻胆体的部分解聚合研究
在实验条件下, 藻胆体可以解离出富含外
周杆的组分。由于 Synechococus sp. PCC
7002 FNR与Anabaena sp. PCC 7119 FNR 的
N-末端都具有类CpcD区, 与藻胆体外周杆中
图1 Anacystis nidulans R-2藻胆体及其FNR的
Western blotting分析
1. 藻胆体FNR的Western blotting 分析; 2. 藻胆体
全蛋白; 3. 标准蛋白
Fig.1 Phycobilisomes of Anacystis nidulans R-2
and Western blotting analysis of its FNR
1 . W e s t e r n b l o t t i n g a n a l y s i s o f F N R i n
phycobilisomes; 2. Total proteins of phycobilisome;
3. Protein marker
图 2 Anacystis nidulans R-2藻胆体的 Triton X-
114 分相后各组分的 SDS-PAGE(A)和Western
blotting(B) 分析
1,6. 上清; 2,7. Triton X-114相; 3,4,8. 藻胆体; 5.
标准蛋白
Fig.2 SDS-PAGE(A) and Western blotting(B)
analysis of components of phycobilisomes from
Anacystis nidulans R-2 after Triton X-114 phase
partition
1,6. Supernatant; 2,7. Triton X-114 pellet; 3,4,8.
phycobilisomes; 5. Protein marker
图3 部分解聚合藻胆体的SDS-PAGE(A)及West-
ern blotting(B) 分析
1,4. 部分解聚合藻胆体; 2,5. 完整藻胆体; 3. 标准
蛋白
Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B)
analysis of partially dissociated phycobilisomes
1,4. Partially dissociated phycobilisomes; 2,5.
Phycobilisomes; 3. Protein markers
除N-末端类CpcD结构域的FNR(FNRD)作为
抗原来制备抗体, 所得抗体比FNR全酶抗体的
3072005 李荣贵等: 蓝细菌Anacystis nidulans R-2藻胆体中43 kD蛋白细胞定位的初步研究
的 CpcD蛋白有较高的同源性, Schluchter等
(1992)推测FNR可以定位在外周杆CpcD蛋白
所在的位置, Gomez-Lojero等(2003)体外研究
结果表明, 在细胞内藻胆体的组装过程中,
FNR-3D最有可能由其类 CpcD结构域取代
CpcD蛋白而结合在外周杆远端。但van Thor
等(1999)认为在蓝细菌Synechocystis sp. PCC
6803的藻胆体中FNR结合在外周杆靠近核心
杆一端的PC上。 本研究所得富含藻胆体外周
杆的组分却不含FNR(图3 1,4泳道), FNR是否
定位在外周杆靠近核心杆一端, 在藻胆体部分
解聚合时, 因暴露某些位点而被蛋白酶水解, 则
需更多的工作来证明。
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