全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(4)：287—291
Journal of Wuhan Botanical Research
鱼腥藻 PCC7120核膜连接蛋 白 ApcE体 内重组研究
贾丽莉，周 明 ，苏 平，赵开弘
(华中科技大学环境科学与工程学院，武汉 430074)
摘 要：为了研究鱼腥藻 PCC7120核．膜连接蛋白 ApcE(1-240)脱辅基蛋白与藻蓝胆素的连接机制，通过体内重组
方式得到色素蛋白PCB-ApcE(1-240)。吸收光谱、荧光光谱分析表明，核·膜连接蛋白 ApcE(1-240 )与藻蓝胆素进
行了正确的体内重组。ApcE(1-240)脱辅基蛋白可与藻蓝胆素体内自催化共价连接，获得的色素蛋白溶于含有
4 molfL尿素的磷酸钾缓冲体系中，并具有最大吸收峰( =660 am)和荧光发射峰( ～ =668 am)。
关键词：藻胆体；藻蓝胆素；ApcE；体内重组；自催化连接
中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2006)04-0287—05
／n vivo Reconstitution of Anabaena sp．PCC7120 Core-membrane
Linker Protein ApcE with Phycocyanobilin
JIA Li．Li，ZHOU Ming’，SU Ping，ZHAO Kai·Hong
(Colege ofEnvironmental Science and Engtneering，Huazhong Unitersity ofScience and Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：The deletion mutated core．membrane linker protein ApcE(1．240)from Anabaena sp．
PCC7 1 20 were overexpressed in E．coli．The activities of expressed proteins were studied through in vivo
reconstitution tests，where phycocyanobiJin·biosynthesizing gene(hol and pcyA)were transformed into E．
coli．Through the absorption and the fluorescence spectra，the resul~show ApcE(1·240)could bind cova·
lendy phycocyanobilin(PCB)in an autocatalytic reaction．The presence of 4 mol／L urea is necessary to
solubilize the resulting biliprotein，and it has absorption maxima( m =660 nm)and fluorescence maxi·
ma( ：668 nm)．
Key words：Phycobilisome；Phycocyanobilin；ApcE；In vivo reconstitution；Autocatalytic attachment
藻胆体(phycobilisome)是存在于蓝藻和红藻中
的一类捕光蛋白复合物，它 由藻胆蛋白(phycobili．
protein)和连接蛋白组成。藻胆蛋白是一类结构相
似的色素蛋白，它们是由藻胆色素与相应的脱辅基
蛋白中保守性半胱氨酸残基的巯基以硫醚键共价结
合而成的 。藻胆蛋白的体外重组，都需要在其它
裂合酶的作用下，才能完成脱辅基蛋白与四吡咯色
素的共价连接，藻胆蛋 白自身肽链内并不包含催化
连接裂合酶的结构域 J。根据它们的吸收光谱 ，藻
胆蛋白可分为藻蓝蛋白(phycocyanin，简称 PC)、藻
红蛋白(phycoerythrin，简称 PE)和别藻蓝蛋白(alo—
phycocyanin，简称 APC)，在某些没有藻红蛋白而具
有异形胞的蓝藻中，还有藻红蓝蛋 白(phycoerythro—
cyanin，简称 PEC)。
别藻蓝蛋白在连接多肽的协助下，构成了藻胆
体(PBS)的核心，在藻胆体能量传递过程中有着至
收稿日期：2006—01—16．修回日期 ：2006—03—30。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(30540070)。
作者简介：贾丽莉(1981一)．女，硕士研究生，从事生物技术研究。
通讯联系人。
关重要的作用。此 APC核被核一膜连接多肽(phyco．
bilisome core．membrane linker protein，简称 LcM)偶联
于光合作用系统。k 是一类分子量很大的连接蛋
白，其脱辅基蛋白由apcE编码 ，它的 N端藻胆蛋白
结构域内有一个半胱氨酸(Cys)，与一分子藻蓝胆
素(PCB)连接 。
在血红素氧化酶 HO1的作用下，大肠杆菌
BL21中的血红素 Heme被氧化成胆绿素 Biliverdin，
而胆绿素还原酶 PcyA可以将胆绿素 Biliverdin还原
成我们需要的藻蓝胆素 PCB 。因此血红素氧化
酶和胆绿素还原酶的获得使体内重组成为可能。
缺失C端的4个连接蛋白结构域(892aa)后只剩下
N端的色素结构域(240aa)的基因片段 apcE(1—240)
已克隆表达，并已实现其相应的脱辅基蛋白的体外重
组 。将hol和pcyA连接到 pACYCDuet一1、pCDFDuet．
1、pETDuet．1，能分别得到质粒pACYCDuet—hol-peyA、
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pCDFDuet—hol-pcyA、pETDuet—hol-pcyA。在 此 基 础
上，本研究进一步将 pET30a—apcE(1-240)和上述 3
种新构建的质粒之一共同转化大肠杆菌，对 ApcE
(1-240)与 PCB的自催化体 内重组进行了详细研
究。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
大肠杆菌菌种 BL21(DE3)由本实验室保存。
质粒 pET30a．apcE(1—240)由本实验室构建。拷贝
数依次是 l0～l2，20～40和40的质粒 pACYCDuet一
1、pCDFDuet一1、pETDuet一1购 自 Novagen公司，pA—
CYCDuet—hol-pcya、 pCDFDuet—hol-pcya、 pETDuet—
hol-pcyA由本实验室构建。IPTG为 SABC产品，亲
和层析介质购自Amersham Pharmacia公司。
1．2 转化
按文献[6]的方法进行操作。pET30a—apcE(1—
240)和 pETDuet—hol-pcya转 化 大肠 杆 菌 BL21
(DE3)，用 氨苄青 霉素 和卡那 霉素平 板 筛选。
pET30a—apcE(1—240)和 pCDFDuet—hol-pcyA转化大
肠杆菌 BL2l(DE3)，用链霉素和卡那霉素平板筛
选。pET30a—apcE(1-240)和 pACYCDuet—hol-pcyA
转化大肠杆菌 BL21(DE3)，用氯霉素和卡那霉素平
板筛选。
1．3 重组蛋白的大量表达和超声破碎
含有表达质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)在等量
的 LB培养基中培养至 OD60o=0．5～0．6后，加入终
浓度为 1 mmol／L的IPTG，分别在20c【=、30c【=下诱导
表达 12 h后，离心收集细胞，双蒸水洗 2次，加入预
冷的重组缓冲液(4 mol／L尿素、20 mmol／L磷酸钾
缓冲液、0．5 mol／L NaC1，pH 7．2)重悬细胞，取 3组
相应等量的细胞测定激发荧光光谱，初步区别表达
效果。冰浴中超声7 min，4 c【=条件下离心 15 min，分
别获得上清液和沉淀。
1．4 上清和沉溶的光谱测定
按文献[5]确定表达蛋白的溶解性，根据超声
后的产物颜色进一步确定表达蛋白在上清液和沉淀
中的分布。
表达蛋白质有一部分以包涵体形式存在于沉淀
中，要将沉淀用双蒸水洗净，向其中加入等量体积的
缓冲液(8 mol／L尿素、20 mmol／L磷酸钾缓冲液、
l mol／L NaC1、5 mmol／L[3-巯基乙醇，pH 7．2)，4 c【=
条件下放置3～4 h至溶解。将沉淀溶解物用透析液
(4 mol／L尿素、0．2 mol／L蔗糖、20 mmol／L~酸钾缓
冲液、0．1 mol／L NaC1，pH 7．2)透析2次，10000 r／
min，4c【=条件下离心 15 rain，再次取相同上清(该上
清含有经尿素变性复性后的重组蛋 白，统称为沉
溶)备测光谱。
由表达载体 pET构建的重组质粒在大肠杆菌
中诱导表达得到的外源融合蛋白N端都带有 6个
组氨酸的亲和标记，简称 His·tag，故可采用金属螯
合亲和层析法提纯。将上清和沉溶通过镍离子螯合
亲和层析 法提纯，用 柱平衡 液 (4 mol／L尿 素、
0．2 mol／L蔗糖、0．1 mol／L NaC1、20 mmol／L磷酸钾
缓冲液，pH 7．2)洗 3个柱体积，用洗脱液(4 mol／L
尿素、0．2 mol／L蔗糖、0．1 mol／L NaC1、20 mmol／L
磷酸钾缓冲液、0．2 mol／L咪唑，pH 7．2)洗脱得到
提纯后的重组产物。对提纯后的重组产物定量再次
测定吸收光谱和荧光光谱。
吸收光谱用 Lambda 25型紫外可见光谱仪
(Perkin．Elmer)测定，紫外可见光谱扫描范围 300～
800 rim，扫描速度 960 nm／min，狭缝宽度 1．0 rim。
激发和荧光光谱测定采用 LS-45型荧光光谱仪
(Perkin．Elmer)，光谱扫描速度 500 nm／min，狭缝宽
度 10．0 nm／lO．0 rim。PCB—ApcE(1—240)的最大荧
光发射在668 nlTl，所以可以检测 670～700 rim的荧
光来测定此样品的激发光谱，为了避免激发光谱中
660 rim峰的干扰，采用检测 690 nlTl荧光测定激发
光谱。
1．5 色素蛋白质变性实验
为进一步确定重组产物中色素的种类和性质，
采用酸性尿素(8 mol／L，pH=2)使其变性，紫外可
见光谱检测变性后的色素蛋白质。这时蛋白质与色
素间的作用很弱，色素基本呈游离时的结构状态，色
素蛋白质的吸收光谱与游离色素的吸收光谱很相似，
因此从吸收峰最大值可以判断色素的种类和性质。
1．6 SDS-PAGE检测
取表达后的菌液 2 mL 10000 r／min离心收集
细胞及超声后的上清和沉溶，各加入 1 X上样缓冲
液和巯基乙醇 (9：1)，100c【=煮沸5 min，用 8％的分
离胶进行 SDS—PAGE分析 。
1．7 色素蛋白锌电泳
SDS—PAGE电泳完成后，电泳胶室温下经 1 mol／L
醋酸锌溶液浸泡 1 h，在280 la．n3紫外灯下检测。
2 结果和分析
2．1 体 内重组细胞激发荧光测定和分析
将 pET30a—apcE(1-240)与pACYCDuet一／tol-pcyA、
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pET30a．apcE(1-240)或 pCDFDuet-hol-pcyA分别转
化大肠杆菌 BL21(DE3)，得到了相应的单克隆细
胞。这些细胞培养后分别用激发光谱分析，发现在
660 rim附近有明显激发光谱峰，表明 PCB-ApcE(1-
240)已在大肠杆菌体内产生(图 1)。
2．2 体 内重组蛋 白的光谱测定和分析
体内重组后的细胞超声破碎离心后，取上清和
Wavelength(nm)
沉溶测定光谱发现，体内重组获得的色素蛋白上清
和沉溶，均具最大吸收峰( =660 nm)。不同的
激发波长下，最大荧光发射峰均为668 nm( =
668砌 )。通过镍离子螯合亲和层析法提纯等量的上
清液和沉溶的重组产物，再次测定吸收光谱和荧光光
谱，具有同样的最大吸收峰和荧光发射峰。表明PCB．
ApcE(1-240)已在大肠杆菌体内产生(图2，图3)。
Wavelength(nm)
点线：pET30a—o~cE(1-240)与 pACYCDuet·hol-／xyA转化的；虚线 ：pE130a-apcE(1-24O)与 pCDFDuet—hol-／xyA转化
的；实线：pET30a-apcE(1-240)与pETDuet—hol-pcyA转化的
Dot line：pET30a-apcE(1-240 )and pACYCDuet·hol-／xyA were transformed into E．coli；Dash line：pE1r3Oa叫)cE(1-
240)and pCDFDuet-hol-pcyA wel~transformed into E coli；Solid line：pE13Oa-apcE(1-240)and pETDuet·hol-peyA
were transfom ed into E．coli
图 1 3组体内重组 2o℃表达(a)和 3o℃表达(b)后细胞内的 PCB-ApcE(1-240)的
激发光谱(最大发射光波长690 nm)
Fig．1 Fluorescence excitation spectra of PCB—ApcE(1-240)that were expressed in 20％ and 30％
O
0
2
=
至0
苔
盖0
0
300 400 500 600 700 800
Wavelength(nm)
0 5
0 4
u
U
i O 3
七
2 0 2
《
0 1
0．0
l200
900
600
300
300 400 500 600 7O0 8O0
w 。1。“g h(nm) b
O
600
300
200
l00
O
650 700 750 800
Wavelength(nm)
6OO 700 800
Wavelength(nm)
t清提纯 ；b：沉溶提纯。点线：pET30a-．apcE(1-240)与 pACYCDuet-hol-pcyA转化的；虚线：pE130a-apcE(1-240)
与 pCDFDuet-／tol-pcyA转化的；实线：pE130a-apcE(1-24O)与pETDuet—hol-pcyA转化的
a：Purified solution；b：Pu ed and renatured sample from the precipitate．Dot line：pE1r3Oa E(1-24O)and pACYCD—
uet-hol-peyA were transformed into E．coli；Dash line：pE1r3Oa (1-240)and pCDFDuet—hol-pcyA were transformed in—
to E coli；Solid line：pET30a—apcE(1-240 )and pETDuet—hol-pcyA were transformed into E．coli
图 2 3组体内重组2o℃表达后生成 PCB-ApcE(1-240)的紫外可见光谱和
荧光发射光谱(荧光均为 600 nm激发)
Fig．2 Absorption and fluorescence emission spectra of PCB—ApeE(1-240)that were expressed in 20％
(The fluorescence spectra were obtained with excitation at 600 nm)
l^ culu_uucuu∞ 0j=
二 C2 三 uuCu 2 0：=
一_譬 u c_ uu uu∞u 0：一
a culu_ uu uu∞u 0三
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O 2
g O l
暑
专0 1
兰
《 O 0
O O
3OO 4O0 500 600 700 800 600
w 。l。ng h(“ ) a
0 3
2
=
至 0 2
言
盖 0 1
0 O
300 400 500 600 700 800
Wavelength(am)
700 800
Wavelength(am)
O
a：上清提纯；b：沉溶提纯。点线：pET30a·apcE(1-240)与 pACYCDuet—tol-pcyA转化的；虚线：pET30a-．apcE(1-240)
与pCDFDuet—hol-pcyA转化的；实线：pET30a-．apcE(1-240)与 pETDuet—tol-pcyA转化的
a：Putifed solution；b：Purifted and rcnatured sample from the precipitate．Dot line：pET30a—apcE(1-240 )and pACYCD—
uel-hol-p~yA were transformed into E．coli；Dash line：pET30a-．apcE(1-240)and pCDFDuet—tol-pcyA Wel~transformed in-
to E．coli；Solid line：pET30a—apcE(1-240 )and pETDuet·hol-peyA were transformed into E．eoli
图3 3组体内重组3o℃表达后生成 PCB·ApcE(1-240)的紫外可见光谱和
荧光发射光谱(荧光均为 6O0 am激发)
Fig．3 Absorption and fluorescence emission spec~a of PCB．ApcE(1．240 1 that were expressed in 30℃
(The fluorescence spectra were obtained with excitation at 60o am)
2．3 体内重组蛋白尿素酸性变性的光谱测定和分析
体内重组后的细胞超声破碎离心后，上清提纯
得到的色 素蛋 白在暗处变性后，最大吸收峰在
O 3
： 0 2
=
碍
{
0
兰 0 1
《
0．0
300 400 500 600 700 800
Wavelength(am)
664 nm处，表明体内重组产物中的色素为 PCB。表
明 PCB·ApeE(1·240)已在 大肠 杆 菌 体 内 产 生
(图4)。
0 0
0．0
星
0
差0．0
0．0
Wavelength(nm)
O
a：20~；b：30~E。点线：pET30a—apcE(1-240 )与pACYCDuet—tol-pcyA转化的；虚线：pET30a—apcE(1-240 )与 pCDFDuet-
hol-pcyA转化的；实线：pET30a-．apcE(1-240)与pETDuet—hoI-pcyA转化的
a：20~C；b：30~C．Dot line：pET30a-apcE(1-240)and pACYCDuet—hol-pcyA we／e transformed into E．coli；Dash line：pET30a—
apcE(I-240)and pCDFDuet·hol-pcyA were transformed into E．coli；Solid line：pET30a-．apcE(1-240)and pETDuet-hol-pcyA
were transformed into E．coli
图4 3组体内重组生成 PCB-ApcE(1-240)在暗处经 8 mol／L尿素(pH=2)变性后的紫外可见光谱
Fig．4 Absorption spectra ofdenatured PCB—ApeE(1-240)by urea(8 mol／L，pH=2)in the dark
2．4 SDS-PAGE和锌荧光检测
取体内重组后的细胞、上清、沉溶做 SDS—PAGE
和锌荧光检测，在 29kD处有明显的目标带。表明
PCB—ApcE(1．240)已在大肠杆菌体内产生(图5)。
3 结论
鱼腥藻 PCC7120核一膜连接蛋白 ApcE除具有
连接多肽的功能外，还具有与 PCB共价偶联 的能
∞ 加 鲫 ∞ O
三 lu一 甚 u占nl
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l 2 3 M kD
— l】6
— — 66
— 45
一
一 35
缸
·——25
}一 l 8
l ÷一 l4
a b
a：重组产物的锌荧光。1：细胞；2：上清；3：沉溶。b：重组产物
考马斯亮蓝染色电泳图。1：细胞；2：上清；3：沉溶；M：蛋白质
标准分子量
a：Zn“ 一induced fluorescence ofPCB—ApeE(1—240)．1：Cel：2：So—
lution；3：Purified and renatured sample from the precipitate． b：
Same trace eoomassie—stained ． 1：Cell；2：Solution；3：Purifted an d
renatured sample from the precipitate；M：Marker proteins
图 5 重组产物的锌荧光和考马斯亮蓝染色电泳图
Fig．5 Zn“ ．induced fluorescence and 8arfle trace
coomassie—stained of PCB—ApcE(1．240)
力，其色素结合位点是Cys—l96。笔者以鱼腥藻藻胆
体的核膜连接蛋白ApcE(1-240)为研究对象，将其
与血红素氧化酶 HOI和胆绿素还原酶PcyA在大肠
杆菌中共同表达，实现了 ApcE的脱辅基蛋 白与
PCB体内自催化连接。通过荧光光谱、吸收光谱和
锌电泳可知．色素蛋白同时存在上清和沉淀中，所以
收集蛋白时不能忽视沉淀中色素蛋白的收集。通过
3组 定量 的对 比实 验 可知，20℃ 低温 表达 时．
pET30a—ApcE(1-240)和拷 贝数为 40的 pETDeut—
HOI—PcyA体内重组产率最高，上清中的色素蛋白
量最大，易于收集．效果最好；pET30a—ApcE(1-240)
和拷贝数为 1O～12的 pACYCDeut—HOI—PcyA体内
重组效果最差。相应的30℃表达效果由好到差的顺
序依次是pC DFDeut—HO I—PcyA、pETDeut—HO I—PcyA、
pACYCDeut—HOI—PcyA，这 可 能 与 pCDFDeut—HOI—
PcyA拷贝数的不稳定有关。总体来看 20℃表达无
论是产率还是稳定性都比30℃效果好。本研究设
计 的体 内重 组实验不仅 不需要 提取藻蓝 胆素
(PCB)，而且可以获得比较稳定的色素蛋白。本研
究为进一步研究膜连接蛋白 ApcE的结构和功能提
供了重要信息。
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