全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 465-469, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-09-06; 接受日期: 2006-12-18
基金项目: 科技部农业科技成果转化项目(No. 05EFN217100432)、引进国际先进农业科学技术创新项目(No. 2006-4-75)、教育部
新世纪优秀人才支持计划(No. NCET-04-0316)、黑龙江省自然科学基金重点项目(No.ZJN04-03)、人事部回国人员科技活动择优资助
项目及黑龙江省博士后启动资金
* 通讯作者。E-mail: zygorl@vip.hl.cn
.实验简报.
东北红豆杉可再生部位紫杉醇含量时空动态变化规律
付玉杰, 孙蕊, 李双明, 张然, 祖元刚*
东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
摘要 利用ODS-C18反相高效液相色谱体系研究了东北红豆杉(Taxus cuspidata)叶、茎、果肉及种子中紫杉醇含量的时
空动态变化。结果表明, 东北红豆杉的4个部位均有紫杉醇存在, 但存在的时间和部位具有较大差异。紫杉醇的含量最大值为
0.043 mg.g-1 (FW)出现在10月份种子中, 最小值0.001 mg.g-1 (FW)出现在11月份果肉中。叶与茎中紫杉醇的含量变化较
为一致, 叶和茎中紫杉醇含量在7月份达到最高, 分别为0.032 mg.g-1 (FW)和0.029 mg.g-1 (FW), 在8月份降至最低, 分别为
0.011 mg.g-1 (FW)和0.010 mg.g-1 (FW)。在新叶萌发期, 老茎叶比新茎叶中紫杉醇的含量高约2.5倍。
关键词 紫杉醇, 积累规律, 东北红豆杉, 时空动态变化
付玉杰, 孙蕊, 李双明, 张然, 祖元刚 (2007). 东北红豆杉可再生部位紫杉醇含量时空动态变化规律. 植物学通报 24, 465-469.
紫杉醇(paclitaxel)(图1)是具有五甲基十五碳烯骨
架的二萜类化合物, 是最早从太平洋红豆杉(Taxus
brevifolia)树皮中提取出来的一种天然抗癌药物(Wani et
al., 1971)。它能与微管蛋白结合, 并促进其聚合, 抑制
癌细胞有丝分裂, 阻止癌细胞增殖(佘琨等, 20 01 ;
Kelling et al., 2003)。1992年紫杉醇被美国 FDA正
式批准为抗癌新药, 它对卵巢癌、乳腺癌、肺癌均有
较好的治疗作用。近年来研究表明, 紫杉醇对治疗其它
疾病也有一定潜力, 如恶性黑色素瘤(罗士德等, 1994)、
类风湿性关节炎(Oliver et al., 1994)和早老性痴呆
(Burke et al., 1994)等。随着国际市场上对紫杉醇需
求量的日益增长, 野生红豆杉资源遭到了毁灭性的破坏,
人工种植红豆杉已成为解决紫杉醇原料短缺的重要途径
(解雪梅和温远影, 1996; 张佐玉, 2000; 刘颖和肖艳,
2005)。但如果采用传统方法, 从红豆杉树皮中提取紫
杉醇, 资源消耗太大且人工种植周期长, 仍不能解决紫杉
醇的原料问题。鉴于此, 本文对东北红豆杉(Taxus
cuspidata)的可再生部分——叶、茎、果实等不同部
位在不同生长时期的紫杉醇含量进行了比较, 研究了紫
杉醇在植物中的分布规律, 不仅可以为红豆杉资源的保
护性开发提供指导, 还有助于阐明紫杉醇在植物体内的
生物合成途径和代谢规律。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
Jasco PU-980高效液相色谱仪; UV-975紫外吸收检测
器(日本); HiQ sil C18W色谱柱(4.6 mm × 250 mm)(KYA
图 1 紫杉醇的结构
Figure 1 Structure of paclitaxel
466 植物学通报 24(4) 2007
技术公司, 日本); 旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂);
KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限
公司); AB104电子天平(瑞士Mettletoledo公司)。
乙腈(色谱纯, 北京百灵威公司)、水(双重蒸馏
水)、乙醇、石油醚及三氯甲烷为分析纯。纯度为 97%
的紫杉醇(paclitaxel)对照品(购自 Sigma公司)。
1.2 植物材料
东北红豆杉(Taxus cuspidata)新鲜枝叶及果实采自东北
林业大学森林植物生态学教育部重点实验室种植园内,
由本实验室聂绍荃教授鉴定。将枝叶分为叶和茎两部
分, 果实分为果肉和种子两部分。
植物样品采样: 选取生长于种植园内高约1.5 m的
十年生东北红豆杉, 分别于2005年6月至2006年5月
每月的20日, 采集同一高度适量枝叶和果实等不同器官
或部位。
1.3 样品储藏
所有样品采集后3 小时内制样, 或将枝叶修剪成长约10
cm的小段, 放入冰箱内保存备用。
1.4 平行样
为确保测试样品的代表性与准确性, 每个实验选取3个
取样点, 采集后的样品经均匀混合后, 再准确称取3个平
行样, 结果取平行样的平均值。
1.5 样品制备与HPLC分析
1.5.1 样品溶液制备
分别称取东北红豆杉的叶、茎、果实、果肉及种子鲜
重各 20 g。各部位处理方法如下: 叶加入 80%乙醇匀
浆2 分钟; 茎和果肉用液氮研磨后, 加入80%乙醇超声
波振荡30 分钟; 种子碾碎后加入80%乙醇超声波振荡
30 分钟。分别过滤后, 在各部分滤渣中加入 80%乙醇
超声波振荡 30 分钟, 过滤(2个重复)。将 3次提取的滤
液合并、浓缩, 浓缩液经石油醚、三氯甲烷萃取后, 将
三氯甲烷相浓缩至干, 用 1 mL甲醇溶解, 微孔滤膜
(0.45 µm)过滤后得到样品溶液, 进行 HPLC分析。
1.5.2 HPLC分析
流动相乙腈: 水=45:55(v/v); 流速1 mL.min-1; 检测波
长 227 nm; 柱温 25°C; 进样量 10 µL。
对照品溶液制备: 精确称取紫杉醇对照品适量, 用甲
醇配成0.1 mg.mL-1的溶液, 作为对照品溶液。利用外
标法定量, 计算公式如下:
含量(mg.g-1, FW) = AX / (10AS×MX)
式中, AX为样品溶液峰面积; AS为标准品溶液峰面积;
MX为样品鲜重(g)。
2 结果与分析
2.1 紫杉醇在植株不同部位的空间分布
为研究紫杉醇在东北红豆杉中不同部位的空间分布规律,
分别取东北红豆杉 10月份不同部位的样品溶液进行
HPLC检测, 测定结果见表 1。从表 1可以看出, 种子
中的紫杉醇含量最大, 为0.043 4 mg.g-1 (FW), 其它部
位的含量从大到小依次是: 叶>茎>果肉。紫杉醇在以上
几个部位均有分布, 说明紫杉醇的产生并不具有组织特
异性, 各个正常组织都可以产生; 但各组织器官中紫杉醇
的积累特性不同, 紫杉醇更容易在种子、叶和茎等组织
中积累。
2.2 紫杉醇在叶和茎中的时间分布
不同时间东北红豆杉叶和茎中紫杉醇含量的动态变化见
图 2。东北红豆杉在其果期(9、10和 11月)不同部位
中紫杉醇含量的动态变化见图 3。结果显示, 供试样品
中的紫杉醇含量在一定程度上受季节影响, 具有不同时
间积累的特点。如图2所示, 在东北红豆杉叶和茎中紫
表 1 东北红豆杉不同部位的样品中紫杉醇含量(n=3, FW)
Table 1 The contents of paclitaxel in different parts of Taxus
cuspidata (n=3)
Samples Content (mg.g-1 FW)
Relative standard
deviation (%)
Needles 0.021 6 1.07
Stems 0.019 4 0.95
Pulp 0.001 3 1.13
Seeds 0.043 4 1.56
467付玉杰等: 东北红豆杉可再生部位紫杉醇含量时空动态变化规律
杉醇含量呈现出不规则波动性的变化, 叶中紫杉醇含量
分别在2、7和11月出现极值, 在7月达到最高点0.032
mg.g-1 (FW), 而在 8月含量急剧下降, 出现了最低点
0.011 mg.g-1 (FW); 茎中紫杉醇含量在7月和11月也
分别出现了高峰, 与叶中紫杉醇含量的变化基本一致, 即
也在 7月达到最大值 0.029 mg.g-1 (FW), 在 8月出现
最低值 0.010 mg.g-1 (FW)。
随着春季温度回升, 光照时间延长, 植株上的休眠芽
开始萌发生长, 低温休眠后的东北红豆杉中紫杉醇的含
量逐渐增加; 随着春季休眠芽萌发的结束, 紫杉醇的含量
出现降低趋势。随着夏季光照的增强和时间延长, 紫杉
醇含量又开始增加, 并在7月达到最大值, 但在8月没有
继续增加反而降至最低点, 这可能是因为在光合作用最
强阶段, 紫杉醇以结合态糖基化紫杉醇为贮存形式存于
植物体内, 造成了植物体内游离态的紫杉醇含量骤减。
但任何有机体自身都是一个平衡的独立体, 其体内的次
生代谢产物也是如此, 也存在一个平衡。紫杉醇含量的
骤减打破了这种平衡, 必然会引起红豆杉机体作出应激
反应, 刺激或者激活一些紫杉醇生物合成酶, 如苯丙氨酸
转氨酶(Fleming et al., 1993), 来合成新的紫杉醇, 从而
保持这种平衡。因此, 在随后的几个月内紫杉醇含量又
逐渐增加。
从图3中可以看出, 在果期, 种子中紫杉醇的含量最
高, 为 0.043 mg.g-1 (FW), 远远高于枝叶中的含量。
紫杉醇含量的最低值出现在包囊种子的果肉中, 为0.001
mg.g-1 (FW), 两者相差 40多倍。这是由于植物的果
肉中含有大量的水分, 而紫杉醇的水溶性很小, 所以紫杉
醇在果肉中的相对含量较低, 而种子中水分含量相对较
低, 因此紫杉醇在种子中的相对含量最高, 叶和茎次之。
2.3 东北红豆杉新叶萌发期新、老叶及茎中紫
杉醇的分布
为探讨紫杉醇在东北红豆杉新叶萌发期的空间分布规律,
分别取东北红豆杉 5月中旬的叶和茎, 测定紫杉醇含
量。结果(图 4)显示, 刚萌发出的新叶已经具备了产生
紫杉醇的能力, 可以看作是产生紫杉醇的“源”。但萌
发期萌发出的新叶和茎中的紫杉醇含量与老叶和茎相比,
要低很多, 平均相差约2.5倍, 说明红豆杉枝叶中的紫杉
醇是随着枝叶的成熟而逐渐累积的。
2.4 紫杉醇的时空分布
紫杉醇在植株中的合成与贮存部位至今尚无定论。
Smith等(1997)通过紫杉醇抗体结合免疫金标记技术处
理红豆杉的培养细胞时发现, 紫杉醇的生物合成主要在
质体中, 后被质体蛋白抑制实验证实。另外细胞壁上检
测有大量的紫杉醇积累(Roberts et al., 2003)。在植株
图 2 东北红豆杉叶和茎中紫杉醇含量的动态变化
Figure 2 The dynamic variation of the contents of paclitaxel
in needles and stems from Taxus cuspidata
图 3 东北红豆杉不同部位紫杉醇含量的动态变化
Figure 3 The dynamic variation of the contents of paclitaxel
in different parts of Taxus cuspidata
468 植物学通报 24(4) 2007
水平, 幼茎韧皮部、维管束形成层以及木质部细胞的细
胞壁也检测有大量的紫杉醇(Smith et al., 1997)。这
些结果表明紫杉醇最终积累在细胞壁中, 紫杉醇如何从
质体运输到细胞壁, 以及叶与茎之间是否存在供其转移
的通道及机制还不清楚。结合实验结果, 我们推测植物
中的紫杉醇主要在叶中合成, 然后运输到茎部特化的组
织或细胞中贮存。这是因为紫杉醇的水溶性很小, 难以
大量贮存在液泡中, 过多的紫杉醇对植物细胞同样会产
生维管稳定作用, 而使细胞中毒。为使细胞在合成了紫
杉醇毒素后得以正常的存活, 必须将这些毒素运出, 那么
叶片部位就是紫杉醇的“源”, 茎部某些区域如“韧皮部
或次生木质部”就是“库 ”。综上所述, 叶片是合成紫
杉醇的重要器官, 而茎可能更有利于紫杉醇的贮藏。植
株中紫杉醇的合成与转运机制可能是影响紫杉醇时空分
布的又一个重要因素。
紫杉醇是红豆杉属植物的特有次生代谢产物, 化学
防御和信号分子作用是植物次生代谢物的一个重要生理
功能。植物无法靠移动来躲避其它生物的侵害, 只能依
靠自身产生毒素来抗御其它生物的侵害, 许多次生物质
被证明参与植物的防御系统。人类从几千年的观察实
践中发现, 红豆杉的木材很少腐烂或受虫蛀, 它的枝叶很
少受病虫侵害, 说明紫杉烷类二萜化合物是红豆杉不受
图 4 新叶萌发期新、老叶及茎中紫杉醇的含量变化
Figure 4 The variation of the contents of paclitaxel in young
needles and stems, old needles and stems during the germinat-
ing of bud
病虫侵染的主要防御成分。植物次生代谢物的产生还
与抵抗动物的掠食有关。Ballero等(2003)研究发现所
有被羊咀嚼过枝叶的树木中紫杉烷的含量变化显著, 揭
示了紫杉烷的生物合成与生态环境有很大的关系。
3 结论
本文研究了东北红豆杉不同时间、不同组织器官中紫
杉醇含量的动态变化。在同一时间(10月份)、不同部
位中均有紫杉醇的存在, 且紫杉醇的合成无明显组织(器
官)特异性, 但其含量存在较大差异; 在不同时间、不同
部位中, 紫杉醇的含量变化与空间分布和季节变化有关;
在新叶萌发期, 红豆杉中紫杉醇是随着枝叶的成熟而逐
渐累积的。本文从植物生物体系的整体性和动态性特
点出发, 为研究东北红豆杉中紫杉醇的代谢、积累规律
提供了依据, 不但有助于阐明紫杉醇的生物合成的关键
步骤及调控的生理机制, 而且对红豆杉人工栽培的标准
操作规程的制定和资源的深度开发具有指导意义。
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(责任编辑: 白羽红)
Dynamic Space-time Variation of the Content of Paclitaxel in
Renewable Parts of Taxus cuspidata
Yujie Fu, Rui Sun, Shuangming Li, Ran Zhang, Yuangang Zu*
Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract The present study examined time and space variation of paclitaxel content in needles, stems, pulp and seeds of Taxus
cuspidata by use of ODS-C18 RP-HPLC; this article describes the accumulation and metabolism of paclitaxel in T. cuspidata.
Although paclitaxel was in all of four organs of T. cuspidata, its level was highest during development and differed among organs.
Maximal fresh-weight paclitaxel content was 0.043 mg.g-1 in seeds in October, and minimal content was 0.001 mg.g-1 in pulp in
November. Needles and stems showed a similar pattern of paclitaxel content: the maximal content in needles and stems was 0.032
mg.g-1 and 0.029 mg.g-1, respectively, in July, and the content decreased to 0.011 mg.g-1 and 0.010 mg.g-1, respectively, in
August. During growth, the content in the old needles and stems was approximately 2.5-fold that in young needles and stems.
Key words paclitaxel, rule of accumulation, Taxus cuspidata, time-space variation
Fu YJ, Sun R, Li SM, Zhang R, Zu YG (2007). Dynamic space-time variation of the content of paclitaxel in renewable parts of Taxus
cuspidata. Chin Bull Bot 24, 465-469.
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* Author for correspondence. E-mail: zygorl@vip.hl.cn