全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (1): 102-111, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-01-11; 接受日期: 2007-06-21
基金项目: 国家自然科学基金(No.30471413)
* 通讯作者。E-mail: yaguangzhan@126.com
.专题介绍.
植物 DNA甲基化及其研究策略
南楠 1 , 曾凡锁1, 詹亚光 2 *
1东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040; 2东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
摘要 DNA甲基化是表观遗传学研究的热点问题之一, 植物DNA甲基化的研究对植物研究领域的发展有着举足轻重的作用。
本文阐述了植物DNA甲基化的相关机制, 其中包括RdDM(RNA-dependent DNA m ethyla tion)、DNA 甲基化与组蛋白修饰
以及DNA 去甲基化等近几年研究的热点问题; 讨论了DNA甲基化在植物发育中的功能(包括基因组防御和调控基因表达)、
DNA甲基化与转基因沉默的关系以及其在表观遗传学中的地位。最后就目前国内外研究植物DNA甲基化所采取的常用策略,
即高效液相色谱法、亚硫酸盐测序法、甲基化敏感的限制性内切酶结合Southern杂交分析法和MSAP(methylation-s ensitive
am pli fied po lym orphis m)法进行了详尽的介绍和讨论。
关键词 DNA去甲基化, DNA甲基化, RdDM, 转基因沉默
南楠 , 曾凡锁 , 詹亚光 (2008). 植物DNA甲基化及其研究策略. 植物学通报 25, 102-111.
DNA 甲基化在植物基因组防御、调控基因表达以
及控制植物的生长和发育中起重要作用(Finnegan et al.,
2000; Chan et al., 2005), 对植物本身有着积极的意义。
在最近的几年里, DNA 甲基化和蛋白质甲基化联合机
制、RNA 干扰(RNAi)机制以及去甲基化机制的发现又
使 DN A 甲基化的研究受到广泛关注并获得新的飞跃
(Freitag and Selker, 2005)。同时在研究方法上也取
得了许多新的突破。本文对植物 DNA 甲基化的相关机
制、功能及研究策略进行了综述及讨论。
1 植物DNA甲基化的相关机制
1.1 DNA甲基化基本途径
DNA 甲基化是由 DNA 甲基转移酶(DNA methy lt ran-
sferase, DNA MTase)催化完成的(Finnegan and Kovac,
2000)。植物中至少有 3种胞嘧啶甲基转移酶, 主要包
括维持 DNA 甲基化转移酶(METI)家族、染色质甲基化
酶(CMT) 和结构域重新甲基化酶(DRM)家族(Finnegan
and Kovac, 2000)。它们在 DNA 甲基化过程中表现出
不同的活性, 通常分为2类: 重新甲基化酶(如DRM), 用
于产生新的甲基化; 维持甲基化酶(如METI和CMT)用来
维持甲基化。植物 DNA 在这些甲基化酶的作用下产生
新的甲基化并将其伴随细胞分裂传递下去。目前植物
DNA甲基化途径研究最为透彻的是拟南芥, 其 DNA 甲
基化分为mCpG和mCpNpG(N为任意碱基)2类(图 1)。
首先由小干扰 RNA(small interfering RNAs, siRNA)和
与 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)相关的蛋白质
(Dicer, DCL; RNA-dependent RNA polymerase, RDR)
引发主要的重新甲基化(de novo methylation), 之后分为
2条路径。其中一条路径是蛋白质(如: a rgonau t e ,
AGO; chromatin remodeling factor, DRD)与RNA-RNA
或RNA-DNA交互作用, 可能导致依赖RNA的DNA甲基
化酶 DRM 2 催化 CpN 的重新甲基化, 并通过CMT、
MET1和DDM1(chromatin remodeling ATPase)维持其
甲基化, 但目前还不清楚HDACs(HDA6和HDT1)参与维
持 CpG甲基化的详细情况。而另一途径中 CpNpG的重
新甲基化会伴随着组蛋白H3中赖氨酸-9和27的甲基化,
并通过染色质甲基化酶CMT3和 DDM1维持其甲基化
103南楠等: 植物DNA甲基化及其研究策略
(Freitag and Selker, 2005)。
1.2 RNA介导的DNA甲基化 (RdDM)
RdDM(RNA-dependent DNA methy lat ion)首先在植物
的类病毒复制中被发现。当外源基因转录水平过高时,
过剩的 RNA与同源的 DNA配对, 使外源基因甲基化或
异染色质化, 诱发转录水平基因沉默。Wassenegger
等(1994)在抗病毒转基因研究中发现, 在病毒 cDNA 转
化植株中, 只有在病毒 RNA复制时, 植物基因组中的外
源 cDNA才会发生甲基化沉默, 他认为这是植物中防止
基因过度转录的一种基因调控机制。Mette等(2000)证
明含有启动子序列的双链 RNA 可以引发启动子区的从
头甲基化, 产生转录水平上的基因沉默。RdDM 途径如
图 2 所示。
在植物基因组中, 维持性DNA甲基化优先发生在对
称的 CG序列的胞嘧啶上, 但在 CNG(N指任意核苷)序
列以及非对称序列中也有发生。相比之下, 在哺乳动物
基因组中几乎都发生在 CG序列上。RdDM的独特之处
在于它既包含了 CG序列的胞嘧啶甲基化, 又包含了非
CG序列的甲基化(Matzke et al. , 2004)。实验表明, 拟
南芥含有2种植物特有的DNA甲基化酶(DRM和CMT)。
当非CG序列发生甲基化时, DRM主要与RdDM的起始
有关, 并能使非对称的胞嘧啶甲基化(Bender, 2004)。
一般认为拟南芥中RNA沉默相关基因ARGONAUTE4Z
(A G O 4 )控制着相关基因 RdD M 的建立与维持, 但
Zilberman等(2004)关于 AGO4维持反向重复(inverted
repeats, IRs)引发 RdDM的研究表明, AGO4并不完全
控制 IRs 引发的DNA 甲基化, 还可以有其它方式。可
见 RdDM 的建立与维持可能有多种途径。
1.3 组蛋白修饰与DNA甲基化的关系
与哺乳动物和菌类类似, 植物DNA甲基化也与组蛋白质
修饰紧密相关。例如拟南芥的遗传实验表明, DDM1基
因(编码染色质重建因子 SWI2/SNF2相关蛋白)与 DNA
甲基化密切相关。目前对脉孢菌的相关研究更为深入,
研究表明DIM-5基因(编码一个SET域蛋白质)对 DNA
甲基化是必需的。SET域(Su(var)3-9, Enhancer-of-
zeste, Trithorax)蛋白质形成一个蛋白质家族, 能够通过
组蛋白甲基化影响基因表达。脉孢菌蛋白DIM-5 有组
蛋白甲基化酶(HMT)活性, 即促进组蛋白H3中赖氨酸 -
9的甲基化。DIM-5功能的缺失会阻碍DNA 和组蛋白
H3的甲基化。在拟南芥中也发现了一种类似的蛋白质,
既有 HMT活性, 又有非 CG序列 DNA 甲基化的维持功
能(Tariq and Paszkowskj, 2004; Loidl, 2004; Gendrel
and Colot , 2005)。也有研究发现拟南芥 CG 序列的
DNA甲基化会先于组蛋白H3中赖氨酸 -9的甲基化, 并
且指导它的完成(Vanyushin, 2005)。
另外, 有研究指出DNA甲基化与组蛋白脱乙酰作用
图 1 拟南芥DNA甲基化途径 (Freitag and Selker , 2005)
Figur e 1 DNA methylation pathw ay in Arabidops is (Freitag and Selker, 2005)
104 植物学通报 25(1) 2008
有关, 因为组蛋白脱乙酰酶基因是小RNA 指导的 DNA
甲基化的必备要素(Vanyushin, 2005)。而且各种组蛋
白修饰可以改变染色质结构, 一些组蛋白修饰, 例如甲基
化或去甲基化、乙酰化或去乙酰化(Bestor, 1998)、磷
酸化或去磷酸化等, 经常能预先决定基因的行为, 这可能
导致基因可遗传性的改变。也有许多特殊的非组蛋白
调节蛋白质形成复杂的 DNA-蛋白质复合物, 可引发转
录或致使基因沉默, 这些问题还有待于进一步的研究
(Vanyushin, 2005)。
1.4 DNA去甲基化现象
在植物中, 有关胞嘧啶甲基化的建立和维持的报道较
多。然而, DNA去甲基化(DNA demethy lation)途径是
否存在一直有争议(Kapoor et al. , 2005a)。近来在植
物中发现一个被称为DNA糖基化酶的蛋白质家族, 它能
移除 DNA 甲基化并减轻目的基因沉默。本文以 ROS1
(REPRESSOR OF SILENCING 1)的研究为例说明去
甲基化机制。在胞嘧啶去甲基化过程中, ROS1识别甲
基化的胞嘧啶致使糖基酶从 DNA 骨架上移除甲基化的
胞嘧啶, 随后无嘌呤裂解酶(apurinic lyase, AP lyase)
使 DNA骨架在原甲基化位点处裂开, 最后 DNA 被未甲
基化的胞嘧啶修复(图3) (Chan et al., 2005; Kapoor et
al., 2005a)。目前, DNA 去甲基化也是一种用于研究
DNA 甲基化的有效手段。
2 植物DNA甲基化的功能
2.1 基因组防御
胞嘧啶甲基化通过抑制自身DNA(包括转座子)的活性来
保护基因组。最典型的实例来自于模式植物拟南芥, 研
究表明当DNA甲基化水平降低时, 转座子出现移动现象
(Chan et al., 2005)。大多数真核生物都含有DNA 甲
基化和(或)DNA 甲基化转移酶, 并以此进行基因组防
御。Chan 等(2004 )指出直接重复序列在RNA 干扰
(RNA i)的作用下发生了 DNA 甲基化。Zi lbe rman等
(2004)也对拟南芥中反向重复序列引发的DNA甲基化做
图 2 转录水平基因沉默中的RdDM路径 (Grant-dow nton and Dickinson, 2005)
Figur e 2 RdDM pathw ay in transcr iptional gene s ilencing(TGS)(Grant-dow nton and Dickinson, 2005)
105南楠等: 植物DNA甲基化及其研究策略
了相关研究。这些研究均指出, 当重复序列转入拟南芥
时能成为甲基化的目标, 同时也可导致转化株中同源序
列的甲基化, 起到自我保护的作用。
2.2 调控基因表达
DNA 甲基化可调控特定的内源基因表达。植物在基因
组印迹形成和传递以及调节重复基因家族的表达时都会
利用 DNA 甲基化(Stokes et al. , 2002; Scot t and
Spielman, 2004)。研究表明在核糖体RNA基因中包含
数百个拷贝, 这些拷贝表现随机沉默。进一步用能够抑
制 DNA 甲基化酶活性的 5-氮胞嘧啶处理, 可使沉默的
rRNA基因恢复功能, 说明 DNA甲基化抑制了 rRNA 基
因的表达(Chan et al. , 2005)。Stokes等(2002)研究发
现转基因拟南芥的复杂基因簇中的抗病基因 ball , 可在
实验室生长条件下通过DNA甲基化使之沉默, 在这个研
究中 DNA 甲基化控制了来自于重复基因家族全部基因
的表达。另外, 植物启动子区的DNA 甲基化通常抑制
转录, 但编码区的甲基化一般不会影响基因表达(Chan
et al., 2005)。也有一些基因例外, 例如 Chan等(2005)
推测SUPERMAN(SUP)和AGAMOUS(AG)基因的某些
重要调控元件的甲基化会使转录中途停止。
2.3 植物DNA甲基化与转基因沉默
转基因沉默(t ransgene silenc ing), 又称转基因失活, 即
当向生物体内导入外源基因时, 引起目的基因及其相应
序列的同源内源基因的表达被特异性抑制的一种基因调
控现象。通常转基因沉默只发生在转基因及与其同源
的内源基因之间, 不影响其它基因的表达。转基因与内
源基因经重组发生分离或减数分裂分离后, 沉默的转基
因表达得以恢复(Stem et al., 1997)。1990年, Napolir
和 Vander Krol 首先报道了转基因沉默现象, 他们将花
青素合成酶基因(CHSA)和二氢黄酮醇还原酶基因(DBF)
导入矮牵牛, 试图通过转基因的方式产生比天然紫色矮
牵牛花颜色更深的植株, 但是却意外地发现, 有些转基因
植株中紫色矮牵牛花的颜色变成白色或者花斑色, 这就
是转基因和同源的内源基因在转化植株中的表达同时受
到抑制的结果, 此后该现象在多种转基因植物中被发现
(Cogoni and Macine, 1997)。
转基因沉默可以分为 2类: 转录水平上的基因沉默
(t ranscriptional gene silenc ing, TGS)和转录后水平上
的基因沉默(post -t ranscri pt ional gene s i lenc ing,
PTGS)。研究表明, 转录水平的基因沉默与位置效应、
DNA高度甲基化及启动子的失活相关。其中 DNA甲基
化对基因沉默影响很大。DNA 甲基化过程发生在 DNA
合成之后, 通常以半保留方式进行 DNA修饰, 仅对新合
成链的相应位点胞嘧啶残基逐一进行甲基化修饰
(Elmavan et al., 2005)。现在发现, 几乎所有的转基
因沉默现象均与转基因及其启动子的甲基化有关。例
如 Kumpatla 等(1997)研究转基因水稻中 bar 基因的沉
默时发现,发生在转录水平上的转基因沉默是由于bar 基
因及控制bar 基因转录的ubiquitin启动子高度甲基化所
引起, 而且启动子的 5非翻译区也发生了甲基化。目前
的研究显示, 发生在转基因启动子 5端的甲基化是造成
转录水平基因沉默的主要原因, 虽然甲基化可延伸至转
基因的 3端, 但甲基化过程均是从启动子区域开始的。
图 3 DNA去甲基化机制(Chan et al., 2005)
Figur e 3 Mechanism of DNA demethy lation by a DNA
glycosylase/lyase(Chan et al., 2005)
106 植物学通报 25(1) 2008
而且 Bestor(1998)也提出: 甲基化的基因序列通过抑制
其与MecP2 蛋白(甲基化DNA 结合蛋白)的结合来诱导
转录抑制的发生。MecP2 蛋白结合了包含协同抑制蛋
白mSin3A、组蛋白去乙酰基酶 HDAC1和 HDAC2 在
内的多蛋白抑制复合物。去乙酰基酶与协同抑制蛋白
mSin3A 共同通过对组蛋白 H3 和 H4 的去乙酰基化作
用, 阻碍转基因启动子与转录因子的接触, 从而引起转录
抑制。这就是为什么当转基因重复拷贝或转基因与内
源基因存在同源序列时, 都会伴随着剧烈的甲基化现象
(包括非对称序列)致使基因沉默( B u r y a no v an d
Shevchuk, 2005)。
2.4 DNA甲基化与表观遗传学
表观遗传学是研究在基因组DNA序列未变化的情况下,
通过基因修饰、蛋白质与蛋白质、DNA 和其它分子的
相互作用来影响和调节基因的功能和特性, 并且通过细
胞分裂和增殖影响表型性状的遗传(Bird, 2002)。表观
遗传学的研究内容主要包括 DNA 甲基化、染色质重塑
和基因组印迹等方面, 其中对DNA甲基化的研究最为重
要(Ann, 2003)。因为染色质重塑、组蛋白修饰以及组
蛋白 H3的特殊甲基化都能调节 DNA甲基化的信号, 从
而改变表型性状的遗传(Freitag and Selker, 2005)。不
仅如此, DNA甲基化还在基因组印迹的分子机理中充当
重要角色。对开花植物和哺乳动物的对比研究表明, 它
们的基因组印迹都以DNA甲基化作为表观遗传标记, 只
是控制DN A 甲基化完成基因组印迹的方式不同而已
(Scot t and Spielman, 2004)。
3 DNA甲基化的研究策略
前文已经论述植物DNA 甲基化的相关机制、重要功能
及其在植物研究领域中的重要地位。那么如何对植物
DNA甲基化水平进行精确分析, 如何确定转基因植物中
外源基因的甲基化状态及明确其对基因表达的影响是至
关重要的。目前对于植物 DNA 甲基化分析的常用方法
主要有如下几种。
3.1 高效液相色谱法
高效液相色谱法( h i g h p e r f o rm a n c e l i q u i d
chromatography, HPLC)是用酸或酶将DNA裂解为5类
单核苷酸(A、T、C、G 和 5mC, 即腺嘌呤、胸腺嘧
啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和 5甲基化胞嘧啶), 因 5类核苷
酸在极性溶液中的溶解度不同, 在经过非极性的过滤柱
分离时, 出峰时间也会不同, 用波长260 nm的紫外光测
定流出液的吸收峰并定量, 就可以确定这段DNA的总体
甲基化程度。此法灵敏度可达到单个碱基水平, 一直被
广泛应用于哺乳动物和微生物的研究中。Johnston等
(2005) 藨用该方法对茶 子基因组中 5mC含量进行了分
析, 表明HPLC方法可满足对植物DNA甲基化数量的精
确分析。同时该方法也是目前测定基因组DNA中5mC
总量最标准的方法。它的缺点是不能确定甲基化的位
置和状态信息且对 DNA 纯度要求较高。
3.2 亚硫酸盐测序法
亚硫酸盐测序法(bisulphite sequenc ing)首先用亚硫酸氢
钠处理 DNA, 经亚硫酸氢盐修饰后, 胞嘧啶转变成尿嘧
啶(C-U),而 5m C则在修饰前后保持不变, 随后利用
DNA测序技术对 5mC进行特异性分析, 可获得该DNA
的全部甲基化信息。但测序对DNA 片段浓度的要求较
高, 因此测序前要对目的片段进行扩增。此法在对植物
基因表达调控与DNA 甲基化导致的基因沉默研究中都
有应用。例如 F i n ne g an 等( 20 05 )利用该法研究
FLOWERING LOCUS C(FLC)基因在植物中的表达状
况, 结果表明低水平的 DNA 甲基化就能抑制 FLC基因
的表达, 导致提早开花, 并推测这种甲基化调节可能是通
过控制 FLC调控元件间接调节 FLC的表达。Kapoor等
(2005b)在研究拟南芥突变体(ros1)转录水平沉默时, 也
采用了该方法, 结果揭示35S启动子甲基化程度的增强
不能引发NPTII (nopaline phospotransferase II )基因的
沉默。该法是检测基因组中胞嘧啶单核苷酸甲基化的
相对高效的方法, 而且通过测序可获得样品DNA中特定
序列的全部甲基化信息。但是要注意亚硫酸氢钠处理
DNA应充分, 而且利用该方法时需要大量的PCR和测
107南楠等: 植物DNA甲基化及其研究策略
序操作, 较为繁琐且费用昂贵。
3.3 甲基化敏感的限制性内切酶结合Southern
杂交分析法
甲基化敏感的限制性内切酶结合Southern杂交分析法
(restrict ion enzyme digestion and Southern blot analy-
sis of genomic DNA)是测定特定序列的DNA甲基化的
经典方法, 现在仍广泛应用于植物 DNA 甲基化的检测
中。它常用于对小麦转基因表达稳定性和基因沉默
(Anand et al. , 2003)、拟南芥种子(Nakabayashi et
al., 2005)及水稻DNA 甲基化模型(Long et al. , 2006)
等的研究中。
此法主要是应用2种对甲基化敏感度不同的限制性
内切酶(同裂酶 HpaII和MspI)消化待检 DNA, 酶切处理
后的产物经电泳分离后, 用标记的探针对目的片段做
Southern杂交, 根据酶切图谱的变化情况, 确定识别序
列是否有甲基化发生。对甲基化敏感的限制性内切酶
可使未甲基化的 DNA序列酶解; 而甲基化的 DNA 虽然
碱基序列与限制性内切酶的识别序列一致, 但因序列上
存在甲基而不能被酶切。对甲基化不敏感的限制性内
切酶无论 DNA 序列甲基化与否都能被消化。根据上述
原理, 将样品DNA分为2组,分别用不同类型酶处理, 用
对甲基化不敏感的限制性内切酶处理作为平行对照, 根
据杂交条带位置差异判断该位点的甲基化情况。当
DNA存在部分甲基化时, 会见到大小混杂的片段, 其相
对密度与甲基化的程度呈正比。该方法的优点是简便
且成本低, 能通过内切酶的识别位点来反映甲基化的精
确位置。但此法需要较多的样品, 只能检测有限的含酶
切位点的DNA甲基化, 且有可能因为酶切反应的不完全
而产生假阳性。用 PCR扩增消化后的DNA 模板可改
良上述方法,大大增加该方法的敏感性。
3.4 MSAP法
MSAP(methylation-sens itive amplified polymorphism)
法近年来被广泛用于水稻(Ashikawa, 2001)、棉花(Liu
et al. , 2001)、苹果(Xu et al. ,2000)和拟南芥(Cervera
et al., 2002)等基因组的胞嘧啶甲基化评定, 以及对香蕉
(Peraza-Echeverria et al. , 2001)、油棕(Mat thes et
al., 2001)、马铃薯(Law and Sut tle, 2002; Joyce and
Cassells , 2002)、葡萄树(Popescu et al., 2002)、拟
南芥(Bardini et al. , 2003)和胡椒(Portis et al. , 2004)
等 DNA甲基化状况的研究。此方法的原理(图4)是用同
裂酶 HpaII 和MspI代替 AFLP(ampli fied fragment
length polymorphism)中的MseI作为高频切割酶, 其它
遵循标准的 AFLP 分析。利用同裂酶(如 HpaII和MspI)
对识别序列的甲基化敏感性的不同, 可产生不同的DNA
切割片段来揭示甲基化位点。5-CCGG 4核苷酸序列
是 HpaII和MspI共同的识别序列, 但是它们的作用受到
甲基化状况的影响。HpaII对全甲基化(2条链都被甲基
化)没有作用, 但却可以切开半甲基化的序列(只有 1条
链被甲基化); 然而, MspI能酶切半甲基化或全甲基化
的 C5mCGG 序列, 而不能切割 5m CCGG。再根据
需要设计 PCR引物扩增被消化了的DNA 片段, 进行
琼脂糖凝胶电泳分析, 从扩增片段的差异来确定甲基
化发生与否。
除了以上几种常用的方法外, 还有一些方法也比较
常见, 例如依赖于亚硫酸氢盐修饰的甲基化特异性单核
苷引物延伸(methylation-sens it ive s ingle nuc leot ide
primer extens ion, Ms-SNuPE)(Gonzalgo and Jones,
1 99 7 )、重亚硫酸盐限制酶组合分析( c o m b i n e d
bisulphate restrict ion analys is , COBRA)(Xiong and
Laird, 1997)、Methy light(Eads et al., 2005)和DHPLC
(Baumer et al. , 2001)等。还有依赖于 PCR技术的甲
基化特异性 PCR(methy lation spec ific PCR, MSP)
(Herman et al., 1996)以及应用在基因组水平分析未知
序列的甲基化水平的限制性标记基因组扫描(rest riction
landmark genome scanning, RLGS)(Rush and Plass,
2002)和 DNA 甲基化微阵列技术(Cogoni and Macino,
1997; Yan et al. , 2001)等方法。另外, 植物 DNA 甲
基化具有其自身的特性, 在不同的物种、植株、部位
甚至不同时期都可能存在差异; 而且有些植物因富含多
糖和酚类等物质(尤其是木本植物)而难于提取。这些因
素都可能会给植物 DNA甲基化的检测带来困难。因此,
研究者还要根据所研究的对象和具体的需要选择适当的
108 植物学通报 25(1) 2008
研究策略。
4 研究展望
DNA甲基化现象广泛地存在于植物细胞中, 它影响DNA
的许多重要生物学功能, 包括 DNA 复制起始、突变、
限制修饰系统、基因表达调控及组织分化等。它参与
植物基因的表达调控, 在植物的生长发育过程中起着非
常重要的作用。基因表达调控是一个复杂的过程, 并且
现有的研究结果表明DNA 甲基化也同样十分复杂。另
外, 由于 DNA甲基化是可遗传的, 而且主动的去甲基化
现象很少, 因此有些研究者认为DNA 甲基化是建立表观
遗传的多种机制中特别稳定的一种(Freitag and Selker,
2005 )。其与染色质、蛋白质(尤其是组蛋白)、基因
图 4 MSA P法实例图(Portis et al., 2004)
(A) 当完全甲基化同时发生在外部和内部的胞嘧啶上时, MspI和HpaII 酶切产生大片段(同样也发生在完全甲基化仅存在于外部的胞嘧
啶上时);
(B) 当HpaII/MspI限制酶切位点未被甲基化时, MspI和HpaII都能酶切, 产生小片段(同样也发生在内部的胞嘧啶被半甲基化时)
Figur e 4 Example of the MSAP(Por tis et al., 2004)
(A) When f ull methylation occurs at both external and internal cytosines, ‘large’ fragments are or iginated w ith both MspI and HpaI
(the same s ituation occours w hen full methylation is present only at the ex ternal cy tos ine);
(B) When the HpaII/MspI restr ic tion s ite is unmethylated, both MspI and HpaII can cut and originate ‘shor t’ fragments (the same
situation occurs in case of hemi-methy lation at the internal cytosine)
109南楠等: 植物DNA甲基化及其研究策略
组印迹和非编码RNA 调控等几个方面的相关研究也是
目前表观遗传学研究的热点问题。T a r i g 和
Paszkowsk i (2004)在分析植物中 DNA 甲基化与组蛋
白甲基化时就指出: 植物研究强调 DNA 甲基化与组蛋
白甲基化的相互影响, 一般不认为是单向的信号流程,
而是互补效应。这种相互影响对表观遗传来说可能是
至关重要的。
在转基因植物基因沉默的研究中, 现已明确大部分
基因沉默与DNA甲基化有关, 但如何通过甲基化的改变
活化基因表达的研究尚处于起步阶段。其中 RNA 的作
用备受关注, 比如 s iRNAs 对 PTGS 的介导、miRNAs
(m icroRNAs )对基因沉默的介导以及 s i RNA 指导的
DNA甲基化与组蛋白共同作用对TGS的介导等(Bisaro,
2005)。虽然具体机制还不十分清楚, 但对转基因沉默
的研究均有着重要的意义。
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1Co lle ge o f L ife Science, Northe ast Forest ry University, Ha rbi n 1 500 40, Chi na
2Ke y L abo rato ry of Forest ry Tre e Ge net ic Imp roveme nt, Min ist ry of Edu cat ion, No rth east Fore stry Un ive rsi ty, Ha rbi n 1 5004 0, Chi na
Abstr act DNA methy lation is one of the most important issues in epigenetics and plays a key role in plant research. This review
introduces the progress of research into the mechanisms of DNA methylation, such as histone methylation, RNA -dependent DNA
methylation, and demethylation, and discusses the func tions of DNA methylation in plants , including defending the genome against
transposons and regulating gene expression. The role of DNA methylation in transgene silencing and epigenetics is covered, as is
approaches to s tudy DNA methylation in plants, inc luding high per formance liquid chromatography, bisulphite sequenc ing, methy-
lation-sens itive amplif ied polymorphisms , restric tion enzyme digestion and Southern blot analysis.
Ke y w ords DNA d eme thyl ati on, DNA m eth ylat ion , RdDM , t ran sge ne sile nci ng
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(责任编辑: 白羽红)
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