全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (2): 168-172, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-06-21; 接受日期: 2006-08-16
基金项目: 黑龙江省自然科学基金(No.C0311)和黑龙江省教育厅海外学人科研资助项目(No.1055HQO26)
* 通讯作者。E-mail: qzw303@126.com
.实验简报.
黄瓜果瘤的遗传及 SSR标记
王桂玲 1,2, 秦智伟 1*, 周秀艳 1, 赵咫云 1
1东北农业大学园艺学院, 哈尔滨 150030; 2哈尔滨师范大学, 哈尔滨 150080
摘要 通过对以荷兰温室无瘤黄瓜(Cucumis sativus )品种Z1和Z3为母本(tutu), 有瘤黄瓜品系东农129为父本(TuTu)的杂
交后代F1和F2的统计分析, 结果表明: 在F1代, 2个组合果实都有果瘤, 有果瘤为显性; F2代果实有瘤与无瘤呈现分离, 其比例分
别是2.92:1和2.95:1, 表明Tu基因是独立遗传的, 即有瘤(Tu)对无瘤(tu)为显性。为了获得与黄瓜果瘤基因连锁的SSR(simple
sequence repeat)标记, 从129×Z3 F2群体中选取有瘤、无瘤单株的DNA各10个, 构建有瘤、无瘤近等基因池。用86对SSR
引物在亲本及DNA混合池之间进行筛选, 并对F2群体的75个单株进行验证。筛选得到了5对与果瘤相关的SSR引物, 经
MAPMAKER/EXP version 3.0b软件分析, 其中CSWGATT01B、CSWGATT01C、CSCT335和CSWGATT01A四个标记位于
同一连锁群上, Tu基因位于这4个标记构建的连锁群中, 具体位置为CSWGATT01C-Tu-CSCT335, 距离两侧标记的遗传距离
分别为20.0 cM和14.1 cM。
关键词 黄瓜, 遗传, 分子标记, SSR, 果瘤
王桂玲, 秦智伟, 周秀艳, 赵咫云 (2007). 黄瓜果瘤的遗传及 SSR标记. 植物学通报 24, 168-172.
黄瓜(Cucumis sativus )又称胡瓜、王瓜, 为葫芦
科甜瓜属一年生草本蔓生攀缘植物。黄瓜是重要的蔬
菜作物之一, 一年四季均可食用, 与大众生活密切相关。
随着人民生活水平的提高, 对黄瓜品质的要求越来越高,
首先关心的是外观品质, 外观品质是引起消费者购买欲
望的直接因素。外观品质包含果色深绿均匀、无黄色
条纹、平滑少刺、果柄短。外形光滑的黄瓜污染少,
清洗方便, 食用卫生, 是无公害蔬菜的理想品种。经检
测表明: 无瘤无刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低
27%, 果皮农药残留量低 18%, 同时耐运输、耐储藏。
黄瓜果皮有瘤一般是美国品种的性状, 是由Tu基因控制
的, 对欧洲品种光皮(tu)为显性(W ellington, 1913;
Strong, 1931; Poole, 1944; Andeweg and Debruyn,
1959) 。在黄瓜形态学基因连锁图上, Tu基因被定位在
第 4连锁组上(Pierce and Wehner, 1990) 。
然而, 在我国传统的黄瓜品质育种中, 对果瘤性状的
选择是通过表现型间接对基因型进行选择的, 这需要等
果实发育到成熟期才能进行。近年来, 分子生物学技术
的发展为植物遗传育种提供了基于DNA多态性的分子
标记, 利用分子标记不仅可以定位目标基因, 还可利用与
目标基因紧密连锁的分子标记追踪目标基因, 进行分子
标记辅助育种。本试验利用有果瘤和无果瘤的纯合材
料, 采用先进的SSR分子标记技术, 建立与黄瓜果瘤基
因Tu/tu紧密连锁的DNA分子标记, 从而可在苗期准确
筛选无果瘤的黄瓜材料, 缩短育种周期, 加快育种进程。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以荷兰温室黄瓜(Cucumis sativus )品种Z1和Z3为
母本, 东农黄瓜品系 129为父本, 亲本间亲缘关系较
远, 性状差异较大。于 2003年进行 2对组合的杂交
得到杂种F1, 2004年 2月种植F1单株自交得到F2代
种子。同年秋天在园艺站大棚内加代种植亲本、F1
和 F2后代, 亲本和 F1各 20株, F2代 2个群体分别为
158和 100株。
169王桂玲等: 黄瓜果瘤的遗传及SSR标记
1.2 群体构建
本实验用于SSR分子标记研究的是(Z3×129)的F2代分
离群体, 于同一日期摘取同一节位上的成熟商品瓜, 将黄
瓜纵切为 4 份 , 记录 1 / 4 瓜上的果瘤个数。参照
Michelmore等(1991) 的BSA法, 从F2群体中选取有瘤、
无瘤单株的DNA各 10个构建有瘤、无瘤近等基因池。
1.3 SSR分子标记筛选
黄瓜叶片总 DNA提取采用 SDS法(王关林和方宏筠,
2002)。用 86对 SSR引物首先对亲本进行筛选, 得到
18对有差异的引物; 再用这18对SSR引物对所建立的
DNA混合池筛选, 共得到 5对有差异的引物; 再用这 5
对SSR多态性引物对所有F2群体158个单株进行扩增
检测。本实验所用引物是根据国外文献上发表的 SSR
引物序列(Fazio et al., 2002) , 由上海生物工程公司合
成的, 对黄瓜整个基因组有较好的代表性。SSR反应
条件和试剂参见文献王桂玲(2005)①, 扩增产物在6％变
性聚丙烯酰胺凝胶中电泳、银染, 记录带型。
1.4 数据分析
检验所选择到的SSR标记在F2群体中的分离比例, 利
用MAPMAKER/EXP version 3.0b作图软件(Lander et
al., 1987)构建连锁群, LOD值最小为3.0, 最大遗传距
离为 50 cM。再利用MapChart 2.1版本软件绘制连锁
图谱。
2 结果与分析
2.1 黄瓜果瘤的遗传规律
在F1代2个组合果实都有果瘤, 有果瘤为显性; F2代果
实有瘤与无瘤呈现分离, 其比例分别是 2 .92∶1 和
2.95∶1, 表明 Tu基因是独立遗传的, 即有瘤(Tu)对无
瘤(tu)为显性。
2.2 亲本的SSR多态性分析
选用86对SSR引物对父本129和母本Z3进行分析, 结
果75对引物具有扩增产物, 其中18对引物在双亲间表
现多态性, 多态性频率为 24％。进一步对基因池筛选,
得到 5 个 S S R 多态性标记 C S W G A T T 0 1 A、
CSWGATT01B、CSWGATT01C、CSWTA04和
CSCT335(图 1)。
2.3 连锁群的构建与果瘤基因的SSR标记
利用5个在基因池间有多态性的引物对黄瓜F2群体进行
SSR分析(图2), 结果5个SSR标记在F2群体中的分离
均符合 1∶2∶1的分离比例(表 2), 因此该群体可用于
构建连锁图谱。在分析果瘤基因与SSR标记之间的连
锁关系时, 将果瘤性状的表形数字化, 其方法与上述标记
带型的统计方法一致。
连锁分析表明, 5个多态性标记中的4个位于同一连
锁群上, Tu基因位于这4个标记构建的连锁群中, 具体
位置为CSWGATT01C-Tu-CSCT335, 距离两侧标记的
①王桂玲 (2005). 黄瓜果瘤与果柄基因 SSR标记. 博士论文. 哈尔滨:东北农业大学. pp. 29-30.
表 1 亲本及 F1和 F2群体果瘤分离情况
Table 1 Tu segregation of three inbred lines and their F1 and F2
Population Tuberculate No tuberculate Total plants Expect ratio Fact ratio x2Chi-square
Parents 129 20 20
Z1 20 20
Z3 20 20
F1 129× Z1 20 20
129× Z3 20 20
F2 129× Z1 38 13 51 3 : 1 2.92 : 1 0.0021
129× Z3 56 19 75 3 : 1 2.95 : 1 0.0008
Х 20.05, 1＝ 3.841, Х 20.01, 1＝ 6.635
170 植物学通报 24(2) 2007
图 1 SSR引物在亲本中的多态性
6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,图上数字为引物编号; M: DL2000DNA标准
Figure 1 Polymorphisms of SSR markers in their parents
Detecting in 6% denaturing polyacrylamid, number repents primer; M: DL2000DNA marker
图 2 引物CSWGATT01B在F2群体中SSR扩增产生的带型
M: DL2000DNA标准; 1-21: F2群体
Figure 2 SSR profiles generated by primer CSWGATT01B in the F2 population
M: DL2000DNA marker; 1-21: F2 lines
表 2 F2群体 SSR标记数据分析
Table 2 Analysis of SSR data form F2 population
Genotype
Marker A H B - Total x2Chi-square
CSWGATT01A 21 31 21 2 73 1.658
CSWGATT01B 21 34 20 0 75 0.680
CSWGATT01C 20 37 16 2 73 0.452
CSW TA04 20 37 17 1 74 0.243
CSCT335 19 35 18 3 72 0.083
A: 父本基因型; H: 杂合型; B: 母本基因型。Х 20.05, 2＝ 5.991; Х 20.01, 2＝ 9.210
A: father genotype; H: hater genotype; B: mother genotype. Х 20.05, 2＝ 5.991; Х 20.01, 2＝ 9.210
171王桂玲等: 黄瓜果瘤的遗传及SSR标记
遗传距离分别为20.0 cM和14.1 cM, 连锁图谱见图3。
3 讨论
亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建
图谱的适用范围。用于作图的两亲本间必须具有较高
的多态性。黄瓜是异花授粉作物, 遗传背景较窄(张海英
等, 1998; Horejsi and Staub, 1999), 品种之间或不同
材料之间很难表现出分子多态性, 但2个品种之间杂种
的分子多态性就丰富得多, 这就是许多研究者在黄瓜分
子遗传作图或分子标记研究时, 实验材料多采用杂种的
原因所在。但亲本间差异不能过大, 否则会导致连锁座
位间的重组率偏低, 并导致严重的偏分离现象, 甚至不能
作图。华北型黄瓜和欧洲温室型黄瓜都是我国主要的
黄瓜栽培品种, 均具有 2n＝14条染色体。本研究采用
华北型和欧洲温室型2个黄瓜亲本构建75个单株的F2
分离群体, 这 2个亲本的外观品质性状差异较大, SSR
引物在亲本间的多态性频率为24％; 5个多态性SSR标
记在F2群体中的分离数据均符合 1∶2∶1的分离规律,
未发生偏分离。实验结果找到了与果瘤基因(Tu)连锁的
SSR 标记: CSW GATT01C-(20.0)Tu-(14.1)-
CSCT335, 进一步说明两亲本选配的正确性。
SSR数量丰富, 覆盖整个基因组, 信息含量高, 表现
为共显性遗传, 可用 PCR进行分析, 且重复性好。总
之, SSR兼具RFLP和RAPD的优点, 并克服了它们的
图 3 新建黄瓜部分连锁群
Figure 3 New instructive cucumber partial linkage group
不足, 成为目前分子标记技术的热点(Senior and Heun,
1993; Yang et al., 1994; Roder et al., 1998) 。目前,
SSR技术被认为是构建真核生物高度饱和遗传图谱的标
准分子标记(Beckman and Soller, 1990; Katzir et al.,
1996), 是基因组遗传图谱和物理图谱的理想界标(刘榜
等, 1997) , 被公认为是分析遗传多样性、确定品种间
亲缘关系以及个体识别的最理想分子标记。目前, SSR
在图谱构建上还未得到充分利用, 这主要是因为其引物
开发成本太高。不过, 许多物种已有现成的商品化的
SSR引物, 利用GenBank提供的信息也可以设计获得
大量的引物。对一般实验室而言 , 只需利用现成的
SSR引物进行PCR扩增, 即可进行多态性分析和图谱
构建工作。所以, SSR非常适合用于图谱构建。
与其它作物相比, 黄瓜已开发的 SSR引物数量较
少, 目前所能查到的不超过150对, 对黄瓜整个基因组的
覆盖不完整。此外, 黄瓜的遗传背景狭窄, 多态性较差,
高密度的黄瓜遗传图谱还没有完成, 各个相关图谱还没
有整合在一起, 给标记基因带来一定的难度。现有黄瓜
遗传图谱上仅有 14个 SSR标记位点(Danin et al.,
2000; Fazio et al., 2003) , 图谱上现有的标记多为
RFLP标记和 RAPD标记, 前者操作复杂, 后者稳定性
差, 已定位的分子标记多还没有和表型性状相关联。关
于标记与目标性状的连锁程度, 应以小于5 cM为最佳距
离, 而本试验得到的2个SSR标记与黄瓜果瘤基因连锁
的距离分别为14.1 cM 和20.0 cM, 距离较远的原因与
引物数量太少有关。因此, 应加大引物密度, 进一步筛
选引物, 找到与目标性状紧密连锁的标记。
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Genetic Analysis and SSR Markers of Tuberculate Trait
in Cucumis sativus
Guiling Wang1,2, Zhiwei Qin1*, Xiuyan Zhou1, Zhiyun Zhao1
1Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2Harbin Normal University, Harbin 150080, China
Abstract To analyze the heredity of tuberculate trait in Cucumis sativus, we constructed 2 populations. Female parents were 2
varieties without tuberculate, Z1 and Z3, derived from Dutch species, and planted in a greenhouse. The male parent was Dongnong
129, a variety with tuberculate. The fruit of the F1 family from the 2 crosses had tuberculate, which indicated that the tuberculate
trait was dominant. The tuberculate trait and no tuberculate trait segregated in the F2 family. The segregation ratios were 2.92 : 1
and 2.95 : 1 for the 2 families, respectively, which revealed that the gene Tu played a role in independent inheritance. A total of 86
pairs of simple sequence repeat primers were screened in 2 near-isogenic pools created by mixing DNA of 10 individuals randomly
chosen from the F2 family according to tuberculate or no tuberculate trait. Five separate amplification products obtained by use of
5 pairs of the primers and 4 products — CSWGATT01B, CSWGATT01C, CSCT335, and CSWGATT01A — were mapped to the same
linkage group by use of MAPMAKER/EXP, version 3.0b. Tu in the linkage group located between CSWGATT01C and CSCT335 at
20.0 cM and 14.1 cM from the markers, respectively.
Key words Cucumis sativus, inheritance, molecular marker, SSR, tuberculate
Wang GL, Qin ZW, Zhou XY, Zhao ZY (2007). Genetic analysis and SSR markers of tuberculate trait in Cucumis sativus. Chin Bull Bot
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* Author for correspondence. E-mail: qzw303@126.com
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(责任编辑: 白羽红)