全 文 ：第 3 2卷 第 4 期
中 阁 种 堂 (c 辑 )
S C IE N C E IN C I HN A ( S
e r
i
e sC ) 0 0 2 2年 8 月
黄瓜花叶病毒 Z a基因上的两个氨基酸共同决定
其在豆科植物上引发的过敏反应 *
陶小荣 周雪平 * 李桂新 于嘉林
(浙江大学生物技术研究所 , 杭州 3 10 0 2 9) (中国农业大学农业生物技术 国家重点实验室 , 北京 10 0 0 9 4)
摘要 过敏反应 (h y p er s en ist ive re s p on se , H )R 是植物对病原物侵染的一种抗性反应 .
对黄瓜花叶病毒 (C u c u m乡e : m o s a i。 : i r u s , e M v )在豆科植物上引发 H R 反应的相关因子
进行了研究 , 证明 CM v aZ 基因中的 24 3 个碱基决定了过敏反应 . 进一步对该区域进行
了分析和点突变研究, 用豆科系统侵染株系 c M v 一 lP 的 63 1 位氨基酸酪氨酸 (T yr )替换
豆科局部坏死株系 c M v 一nF y 的相应位点氨基酸苯丙氨酸 (P he )后得到的突变体 (F ny ~ F厅 )
在豆科植物上引发 H R 反应 , 但过敏枯斑能够向外扩展 ; 用 CM V 一lP 的 64 1位氨基酸丝
氨酸 (S e )r 替换 c M v 一 F n y 的相应位点氨基酸丙氨酸 (lA a) 得到的突变体 (F ny 一AI )S 在豆科
植物上引发的 H R 反应与 CM v 一 F n y 引发的症状没有差异 ; 当这两个位点同时被置换后
得到的突变体 (F n y 一 F A厅 )S 在豆科植物接种叶上就不再引发 H R 反应 , 而是产生系统侵
染 , 说明 C M v 在豆科植物上引发的过敏反应是由 C M v Z a 基因上的 6 31 和 6 41 位氨基
酸共同决定的 .
关键词 过敏反应 黄瓜花叶病毒 复制酶基因 豆科植物
过敏反应是广泛的植物抗性反应 , 在这一过程中 , 木质素与脐服质在细胞壁内沉积 , 植保
素产生 , 细胞程序化死亡 (p r o g r a m m e d e e l l d e a th , p C D )机制被活化及致病相关蛋白 ( p a th o g e n -
er l at ed rP ot ie n
,
P )R 诱导表达 1, 2] 细菌 、 真菌和病毒引发 的 H R 反应会激活广谱的抗性 反
应— 系统获得抗性 , 这种抗性是非特异性的 , 对很多种病原物都具有抗性 3[] . H R 反应通常把病原物限制在被侵染位点 .
黄瓜花叶病毒 ( C u c u m占e : m o s a ie v i r u s , C M v )为二十面体粒子 , 直径 2 8 n m . C M v 具有广泛
的寄主范围 , 能够侵染 85 科 3 65 属 1 0 0 0 多种植物 l4] , 它含有 5 个 o R E 分别位于 3 条基因组
R N A 上 . 本实验室鉴定分离了两个 c M v 株系 , 豆科局部坏死株系 (以 c M v- R B 和 CM V- nF y
为代表 )在 4 种豆科植物上引发 H R 反应 ; 豆科系统感染株系 (以 c M v- PI 为代表 )在这些植物上
为系统花叶 5[] . 我们曾通过 c M v- Fny 的全长 c D N A 侵染性克隆 p nF y 与 c M v- PI 进行重组分析
证明这两个株系在豆科植物上的致病性差异是 由 CM v R N A Z 上的 2a 复制酶基因中包含 G D D
保守区的 243 个碱基决定的 16] . 对这一区段内的碱基进一步进行了分析和点突变研究 , 发现
C M v 在豆科植物上引发的 H R 反应是由这一区段内的两个氨基酸共同决定的 .
2 0 0 1
一
12
一
0 3 收稿 , 20 0 2 一 0 2一 0 6 收修改稿
* 国家杰出青年基金 (批准号 : 3 0 1 2 50 3 2) 、 国家重点基础研究发展规划 (批准号 : G 2 0 0 0 0 1 6 20 4) 和教育部高等学校优秀
青年教学科研奖励基金资助项 目
, * 联系人 , E 一 m a i l : x z h o u @ m a i l .h z jz e n
中 国 科 学 (C 辑 ) 第 3 2 卷
1 材料与方法
L l 材料
e M- vPI 和 e M- vR B由本实验室分离鉴定 { 5], 并繁殖保存于心叶烟 (从 e o t i a n a g zu t i n o s a ) .
C M v- F
n y R N A 全长 e D N A 侵染性克隆 p F n y 一 1 0 9 (R N ^ l ) , p F n y 一 2 0 9 (R N A Z )和 p F n y 一 3 0 9 ( R N A 3 )
由 C o r n n e l 大学 R . P a lu k a i t i s 教授惠赠 [7 ] .
L Z 序列测定
对 c M v- R B 和 C M v 一 1P 的 G D D 区域进行了克隆 , 并测定 了序列 , 克隆和测序按文献 [8]
的方法进行 , 所用 引物 序列为 : 5 , 端引物为 5 ’ ~ A T A A c TA A G T G G T G G T G T G 一 3 , , 此引物与
CM V- F n y 株系 R N A Z 的 1 7 2 2一 17 4 0 位相同 : 3 ’ 端引物为 5 ’ 一C A G A C T T C T T G rl…A I…T T C A A 一 3 ’ , 此
引物与 CM V- F n y 株系 R N A Z 2 2 3 2一2 2 5 0 位互补 .
L 3 点突变体的构建
对 pnF y 一 2 09 的 63 1 位氨基酸 ( 19 7 8 位核昔酸 )和 6 41 位氨基酸 (2 0 07 位核昔酸 )进行单位点
或双位点突变 , 以此构建 3 个点突变体 : F n y 一 F /Y ( 6 3 1 位 ) , F n y 一 A / S (6 4 1位 )和 F n y 一FA / Y S ( 6 3 1
和 6 41 位 ) . 构建点突变体的方法是在相应位点的引物上引人突变碱基 , 采用 vo er lap ex t en s ion
cP R 的方法扩增 出点突变体片段 19 , 再利用点突变体片段和 pnF y 一 2 09 上的两个单酶切位点
iH nd l 和 尸st l 把点突变体片段置换人 pnF y 一 2 09 中 (图 1) . 用于 1 9 78 位核昔酸突变的引物序
列为 : 正链 : 5’ 一C A A C T C T T T鑫C A A C AT G G A A一 , 负链 : 5 ,一 T C c AT G T T G工A A A G A G T T G -T 3 ` ;
用于 2 0 0 7 位核昔酸突变 的引物序列为 : 正链 : 5 ’ 一G AT G G A A c c T IC c G TA c c AT A-T 3 ` , 负链 :
5
` 一
AT AT G G
AT
c G G鑫A G G T T c c AT c 一 3 ` ; 两个位点同时突变时则综合使用上面 4 个引物 . 用于
o v e r l a p e x t e n s i o n P e R 的另外两条引物序列为 : 5 ’端引物 : 5 ’ ~ A T A A e认 A G T e G T o o T o T o 一 3 ` ,
3
`端引物 : 5 ` 一A G C C T G C A G T G G T C T C C T T T T G 一 3 ` .
1
.
4 点突变体侵染性克隆的体外转录和接种测定
抽提纯化点突变体质粒 , 经 sP lt 酶切线性化 用 D N A 聚合酶 1 lK en o w 片段补平后 , 作
为体外转录的模板 . 体外转录按薛朝阳等人 〔’ ”〕的方法进行 , 每次反应 ( 50 林)L 的 D N A 用量为
3巧 此 , 另含 D竹 5 0 nu o比 , r A T P, cr T P, r T T P各 0 . 5 m o比 , r o T P 5 0 林m o比 , m7 o (5 ` ) , (5` ) G
0
.
5 m m o l /L
,
R N A a s e 抑制剂 S O U , R N A 聚合酶 4 O u , 3 7 ℃温育 1 h .
点突变体的体外转录产物经无核酸酶水等量稀释 , 并与侵染性克隆 p nF y 一 109 和 p nF y 一 3 09
的转录产物混合后 , 按常规方法接种心叶烟 (iN co iat na g lut ino sa ) , 烟草上 出现症状后从烟草上
分离病毒接种蚕 豆 (vi c i a fa 占a ) (杭 1 9 1) 、 更 豆 ( vi n g a u n g u i e u za t a ) (正 可 9 9 9 ) 、 豌 豆沪 i s u m
s a t i v u m ) (无须毛尖 )和菜豆沪人a s e o zu s v u zg a r is ) (百花 圆豆 ) 4 种豆科植物 , 接种植物置于防虫温
室 , 观察症状 , 无症状植物进行 E LI S A 检测 , 检测方法参照文献 [川 .
L S 点突变体在系统寄主烟草上的病毒积累
3 个点突变体定量接种三生烟 , 观察症状变化 , 采收接种后第 3 , 5 , 7 , 9 , 12 , 巧 , 20 , 25 天的
系统叶样品进行 E LI s A 检测 , 同时以 CM V- nF y 定量接种三生烟作为对照 . 检测所用的 c M v
单克隆抗体由本实验室制备 , 检测方法同上 .
第 4 期 陶小荣等: C MV aZ 基因上的两个氨基酸共同决定其在豆科植物上引发的过敏反应 3巧
靶 D N A 片段
- . 一产` - 叫卜二二二二二二二二二二 . . . . 1〔门户一广` 一
引物 A 5’ ,塑炙一 l -一 ~
_ {
” C R
一 - - - - - - 一 , 3 , 3 ’ , - 一 - - - - - 一 5
引物 B 1 P C R P C R 引物 C 口 , I
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图 1 点突变体的构建过程
2 结果
.2 1 决定 C M V 在豆科植物上引发 H R 反应的 C M V aZ 基因中 2 43 个碱基的序列分析
我们曾通过豆科局部坏死株系 c M v- F ny 与豆科系统感染株系 c M v- PI 之间的重组发现 ,
CM V 引发 4 种豆科植物的 H R 反应是由 a2 复制酶基因中的两个单酶切位点 iH dn l 和 E co R I
之间的 2 43 个碱基决定的 , 这一区段编码部分的 Za 复制酶蛋白 , 包括依赖于 R N A 的 R N A 聚
合酶的高度保守 的 G D D 核心序列 . 对 C M V- PI 和 C M琴 R B 的这一区段进行了序列测定
(o
e n B a n k登录号 : A J3 19 6 6 5和 AJ 3 19 66 6 ) , 序列比较表明 , CM V- F n y , C MV- R B (豆科上为过敏枯斑 )
中 国 科 学 ( C 辑 ) 第 3 2 卷
与 C M v- I P(豆科上为系统侵染 )在这一区段内只有 6 1 7, 6 31 和 6 41 位 3 处氨基酸有差异 . 通过
与 G en B an k 中报道的 C M v 各分离物在这 3个位点的氨基酸 比较发现 , 6 17 位氨基酸对在豆科
植物上表现同种症状类型的 C M v 是不保守的 (表 l) , 表明这个位点并不影响 C M V 在豆科植物
上引发 H R 反应 . 在豆科植物上引发 H R 反应的 C M V 株系在 6 31 和 6 41 位氨基酸都是相同的 ,
这些 CM v 株系 63 1 位为苯丙氨酸 (P he ) , 6 41 位为丙氨酸 ( lA a) , 而能够系统侵染豆科植物的
C M V 株系在 6 31 和 6 41 位氨基酸上也是保守的 , 其中 6 31 位为酪氨酸 (乃 )r , 6 41 位为丝氨酸
(S er )( 表 l) , 这表明 63 1 和 64 1 位氨基酸可能对 c M v 在豆科植物上引发 H R 反应起决定作用 .
表 1 豆科植物上致病性不同的 C M v 株系的相应核昔酸位点和氨基酸位点的比较
e M v 株系 · 〕 一 -一- -— 一 一 一-圣缪 i燮通 i燮乳一一一一 - 一一— - .6 1 7 ( 19 3 6 ) 6 3 1 ( 19 7 8 ) 64 1 (2 0 0 7 )
F n y L e u ( C U G ) P h
e
( U U C ) A ]
a ( G C C )
R B V a l ( G U A ) P h
e
( U U C ) A l
a
( G C C )
0 L e u (C U G ) P h
e ( U U C ) A l
a ( G C C )
P 1 G l n ( C A G ) 巧 r (U A C ) S e r (U C A )
B G l n ( C A G ) T y
r
(U A C ) S
e r
(U C A )
L L e u ( C U G ) yT
r
(U A C ) S
e r
(U C A )
a) C M v
一
nF y
,
C M v
一
R B 和 C M V 一 o 在豆科植物上为过敏枯斑 , C M v 一 lP , c M v 一 B 和 c M 琴 L 在豆科植物上为系统侵染 . 各
C M V 株系在基因库里的登录号分别为 C M V 一 F n y : D o 0 3 5 5 , C M琴 R B : A J 3 19 6 6 6 , C M从 0 : D 10 2 0 9 , CM v 一 P x : A J3 19 6 6 5 , e M丫 B :
U 5 9 7 4 0
,
C M V
一
L : D 16 4 0 6
.2 2 点突变体的构建
为 了搞清 C M V Z a 基因的 63 1 和 6 41 位氨基酸中的哪个位点或是否由两个位点共同决定其
在豆科植物上引发的 H R 反应 , 我们在 63 1位 ( 19 7 8 位核普酸 )和 6 41 位 ( 2 0 07 位核昔酸 )氨基酸
单位点和双位点引人了突变碱基 , 用 c M v- PI 的相应氨基酸位点替换 p F ny 一 2 09 上的位点 .
C M v- F n y Z a 基因的 6 3一位氨基酸为 p h e , C M V- p l 为两 r , 把 e M v- F n y Z a 基因的 6 3一位氨
基酸 hP e 替换为 C M v- PI 相应位点氨基酸 yT r , 得到的突变体命名为 nF y 一 F/ ;Y 将 C M琴 nF y aZ
基因的 6 41 位氨基酸 lA a 替换为 c M v- PI 上的 s er , 得到的突变体命名为 nF y 一AI ;S 将 c M v 一 nF y
2a 基因的 6 31 位氨基酸 P he 和 6 41 位氨基酸 lA a 同时突变为 yT r 和 S er , 得到的突变体命名为
nF y
一队 lY (S 图 2) , 构建方法见图 1 .
歌豆接种叶上症状
]9 7一 A c U C U U U月f A A C A U G G A A G C LJA人 G ( ; t J( , A UG G A A C C U幻二至G U A C C A U八 U A U U一 20 2〔〕 过敏枯斑
刁书 r L e u P ll e A s ll M e t G I毛. A lu [今, 5 钧 1 M e t G IL一 l》 r o ^ l a 钧 1 P r o 升r l} e
一 一 ~ 一 一 A 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一A妇二么一 一 一 一 一 一 一 一
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r S e r
一 一 一 一 一 A 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 _ 一 一 一
褪绿斑点
过敏枯斑
过敏枯斑
l
一 tl \ 一 i认 / Y S
- - 一 - 一 ~ - — 一 - 一 一 - - - - — 一 - - 一 一 - - . -
S e r
一 一 一 一 一 A 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ~ 一T ~ 褪绿斑点
图 2 突变体 F n y 一 F / Y (6 3 1 位 ) , F n y 一 A zs (64 1 位 )和 F n y 一队 zy s ( 63 一和 6 4 1位 ) 的构建及在
更豆接种叶上的症状
.2 3 点突变体在豆科植物上的症状表现
3 个突变体 F n y 一 F /Y (6 3 1 位氨基酸 ) , F n y 一 A / S (6 4 一位氨基酸 )和 F n y 一队 zy s ( 6 3 1 和 6 4 1 位
氨基酸 )体外转录后连同侵染性克隆 p F n y 一 109 和 p F ny 309 的体外转录产物分别接种心叶烟 , 然


第 4期 陶小荣等 : C MV a Z基因上的两个氨基酸共同决定其在豆科植物上引发的过敏反应 319
H R 反应 L` “」, 而 T M v 的复制酶基因则能诱导带 N 基因烟草的 H R 反应〔’ 3」; c M v 可在觅色黎上
引发 H R 反应 , 通过对 C M v 的移动蛋白基 因 (M )P 和 C P 的缺失及互补实验表明 , 如果病毒被
限制在最初侵染的细胞就不能引发 H R , 当病毒移出最初受侵染的细胞才能引发 H R[ ’ 4 ;] c M v
卫星 R N A 一D 能够在番茄上诱导细胞程序化死亡 [’ 5 ] , 通过马铃薯 x 病毒 (P ot at 口 、 i r u ; x , P v X)
表达卫星 R N A 一 D 的负义链也能在番茄上诱导类似的细胞死亡 t ’ “ ;] 对更豆上产生 H R 反应的
C M v
一
Y 和可豆上系统侵染的 C M v- L 两个株系之间氨基酸的相互置换发现 , C M v aZ 基因上单
个氨基酸的改变就能改变其在更豆上的表现型 L’ 7〕.
我们以前的研究表明 , CM v 在豆科植物上引发的 H R 反应与 2a 基因上包含 G D D 的 2 43
个碱基密切相关 . 进一步的氨基酸突变研究发现 , 当 C M v- F ny aZ 基因的的 63 1位氨基酸 Phe
被替换成 c M v- PI 上的相应位点 yT f后 , 突变体 Fny 一FI Y 在豆科植物接种叶上引发 H R 反应 , 但
过敏枯斑大且能扩展 , 而在系统叶上并没有观察到任何症状 ; CM v- nF y aZ 基因上的 6 41 位氨
基酸 lA a 被替换成 CM V- PI 上的 eS r 后症状没有变化 , 说明这个位点的改变并不足以改变 H R
反应 ; 而当两个位点同时被替换成 c M v- PI 上 的相应位点时 , 突变体 nF y 一FA Y/ s 在豆科植物上
就不再引发 H R 反应 , 并且产生系统侵染 , 表明 C M v aZ 复制酶基因上的这两个氨基酸对引发
豆科植物上的 H R 反应起着决定作用 . 借助蛋 白分析软件对 nF y 和 nF y 一FA Y/ 5 R N A Z上的蛋白
结构进行分析 , nF y aZ 蛋白上的 hP e 与 lA a 被 yT r 与 S er 置换后虽然在 a 一螺旋 、 p一折叠 、 p一转
角和卷曲区域都有一些变化 , 但对于 a2 蛋白的整体结构却没有发生根本性的改变 . yT r 与 s er
都含有经基基团 , 它们的换人可能改变 Z a 复制酶的疏水环境或更利于磷酸化 , 从而改变整个
Z a 复制酶的根本性质 , 因此推测是这两个氨基酸的极性因素改变了 a2 蛋 白的结构和性质 .
虽然这 3 个突变体在豆科植物上的症状有很大差异 , 而在烟草上几乎与 c M v- nF y 没有什
么差异 , 说明 2a 复制酶基因的突变并没有改变突变体在系统寄主烟草上的病毒积累状况 .
在近一二十年植物病毒基 因组结构的研究基础之上 , 病毒学研究的中心逐渐从基因组研
究转 向病毒与寄主互作的研究〔’ “」. H R 反应是一种典型的植物对病原物的抗性反应 , 并且它是
植物新陈代谢积极参与的一种抗性反应 , 明确了 H R 的植物病毒诱发子 , 将有助于进一步对
C M v 引发 H R 反应的植物作用因子进行探索与研究 .
参 考 文 献
G r e e n b e gr J T
.
P r o g r a m m e d c e l l d e a th i n P l a n t
一
Pa t h o g e n i l l t e r a c t i o n
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3 6 : 3 9 3礴 14
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0 2 3中 国 科 学 (C 辑 ) 第 2 3卷
8
9
l 0
l1 2
l 3
l 4
l 5
l 6
l 7
l 8
Q i YJ
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Z h o u X P, L i D B
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C o m P l e te n u e l e o t id e s e q u e n c e a n d i n fe e t i o u s e D N A e l o n e o f th e R N A I o f a C h i n e s e i s o l a t e o f
B or a d B e a n 渐 l r iV ur s 2 . V i r u s G e n e , 2 0 0 0 , 2 0 : 2 0 1~2 0 7
H ig u e hi R
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K r u m m e l B
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S a i ki R K
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A g e n e r a l m e th o d o f i n v i rro P r e P a r a t i o n a n d s P e e i if e m u t a g e n e s i s o f D N A fr a g m e n t s :
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iN
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M o l P l a n t M i e r o b e I n t e r a e t
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P a d g e t t H S
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B e a e h y R N
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A n a iy s i s o f a oT ba e e o m o s a i e v i r u s s t r a i n e a P a b l e o f o v e r e o m i n g N g e n e
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T h e
P lan t C e l l
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e n
op
o d i u m a 水 a r a n l i e o lo r r e q u i r e s V i r u s
m o v e m e n t o u t s i de t h e i n i t i a l ly i n fe e t e d e e l l
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V i r o l o g y
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2 00 0
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12 : 10 7 9 ~ 10 9 2
aT l i
a n s k y M E
,
R y ab o v E v, ROb i
n s o n D J
,
e t a l
.
oT m
a t o e e l l d e a t h m e d i a t e d b y e o m P l e m e n t a r y P l a n t v i r a l s a t e l l i r e R N A
s e q u e n e e s
.
M
o l P l a n t
一
M i
e r o b e In t e r a e t
,
199 8
,
1 1 : 12 14 ~ 12 2 2
K a r a s a w a A
,
o k a d a l
,
A k a sh i K
,
e t a l
.
O n e a m i n o a e id e h a n g e i n C u e u m b e r 爪 o s a i c v i r u s R N A P o ly m e r a s e d e t e rm i n e s
v i r u l e n t / a v i r u l e n t P h e n o t y P e s o n e o w P e a
.
P h y t o P a th o l o g y
,
19 9 9
,
8 9 : 1 18 6一 119 2
v a n R e g e n m o rt a l M H V E m P h
a s i s sh i ft i n g ft o m g e n o m i e t o v i r u s
一
h o s t in t e r a e t i o n s
.
A SM N
e w s
,
19 9 8
,
64 : 6 8 3拓8 8