全 文 ：简 寸及 第 4 7卷 第 2期 0 20 2年 1月 拼 考 屯 叙
黄瓜花叶病毒 RN Z A复制酶基因中的 24 3个碱基
决定其在豆科植物上的致病性
陶小 荣①
(①浙江大学生物技术研究所 , 杭州
周 雪平 工 ’ 李桂新① 于嘉林②
引0 2 ;9 ②中国农业大学农业生物技术国家重点实验室 , 北京
联系人 , E 一 m a i l : x z ho u @ m a i l上 z ZJ . e n )
摘要 黄瓜花叶病毒赤豆分离物 (C M v 一R )B 和豌豆分离物(C M V 一 lP )是两个 CM V 分离物 . 前者侵染蚕
豆 、 豌豆 、 更 豆和菜豆等植物产生局部坏死 , 后者使这 4 种豆科植物产生系统花叶 . 利用在豆科植物上
与 c M v 一R B 症状相似的 c M v 一 F n y 的全长侵染性克隆 , 对两株系致病性差异的决定因子进行 了研究 . 以
C M v
一
IP R N A Z 复制酶基因中包含甘氨酸 一天冬氨酸一天冬氨酸 (G D D )保守区的 24 3 个碱基片段置换
c M V
一
F ny R N A Z 全长侵染性克隆的相应区域 , 得到重组质粒 F P , 这一置换使 C MV 一 F ny 在 4 种豆科植
物上的症状从局部坏死转变为系统侵染 , 说明这一片段对 CM v 在豆科植物上的致病性有重要影响 .
关键词 黄瓜花叶病毒 豆科植物 复制酶基因 致病性
黄瓜花叶病毒 ( c u c u m 乡e : m o s a i e v i r u s , C M V )是
雀麦花 叶 病毒科 (B r o m o v i r i d a e )黄瓜 花 叶 病毒属
( e
u e u m o v i r u s )的典型成员 [ ’ ] . e M v 为单链 、 正义 R N A
病毒 , 含有 R N A I , R N A Z 和 R N A 3 三条基因组 R N A ,
R N A I 含有 l 个可读框 (O R F ) , 编码 I a 蛋 白: R N A Z
含有 2 个 O R F , 5 `端 O R F 编码 Z a 蛋白 , 3 `端 O R F 编
码 2b 曰 , l a 蛋 白和 Z a 蛋 白共同参与了病毒复制酶复
合体的形成 ; RN A 3 含有 2 个 O R E S ’端 O R F 编码移
动蛋白 , 3 ’端 O R F 编码外壳蛋白 (C )P , 但 C P 是从亚
基因组 R N A 4 翻译而来的 . 另外 , 有些 C M V 株系含
有 RN A S , 即卫星 R N A .
本实验室分离鉴定了两个 C M V 株系 , 即豆科系
统感染株系 (以 c M v 一 1P 为代表 )和豆科局部坏死株系
(以 e M琴 R B 和 e M v- F n y 为代表 ) , 这两个株系侵染
豆科植物产生的症状差异明显 , 前者产生系统症状 ,
后 者则产生局部坏死症状 我们 曾经对产生系统症
状的 C M v- IP 和产生局部枯斑症状的 CM V- R B 进行
了生物 学 、 血清 学 及 外壳蛋 白 比较 研 究 , 发 现
C M琴1P 和 CM V 一R B 均属于亚组 I , 初步试验证明 ,
CM v
一
1P 和 C M v 一 R B 的 C P 基因与这些分离物在豆科
植物上的致病性差异无关 3[] . 为进一步研究这两个株
系在豆科植物上致病性差异 的决定 因子 , 本实验利
用豆科局部坏死株系 C M琴F ny 的全长侵染性 c D N A
克隆 , 对两株系致病性差异的决定因子进行了研究 .
1 材料与方法
( i ) 材料 . CM v- P I 和 C M v- R B 由本实验室分
离鉴定 13 , 并繁殖保存于心叶烟中 . c M v- nF y RN A 全
长侵染性 e D N A 克隆 p F n y 一 10 9 ( R N A I ) , p F n y 一 20 9
( R N A Z )和 p F n y 一 3 0 9 (R N A 3 )由康奈尔大学 P a l u k a i t i s
教授惠赠 14] .
( il ) 生物学检测 . 按常规方法进行 .sl[
( i ) C M v- P I R N A Z 上包含 G D D 片段的克隆 .
rT iz ol 法抽取 CM V- IP 病毒基因组 R N A , 用 5 ’端引物
合成 c D N A 第 1 链 , 以此为模板进行 P C R 扩增 . 将
PC R 产物克隆至 -T e as y ve ct or , 阳性克隆经酶切鉴定
后由 iQ ag en ik t 纯化质粒 , 并测序 P C R 引物 : 5 `端为
5
` 一
AT A A C T A A G T G G T G G T G T G
一
3
`
(C MV- F n y R N A Z
的 17 2 2 一 17 4 0 碱基片段 ) ; 3 `端为 5 ` 一 C A G A C T T C T-T
o T A T T T C A A
一
3
’
(CM V- F n y R N A Z中 2 23 2 一 2 2 5 0碱基
片段的互补序列 ) .
( iv ) 重组克隆 F P 的构建 . 利用 C M V R N A Z 上
的单酶切位点 iH nd m 和 cE o R I 切下 C M v- PI 包含
G D D 的 2 4 3 个碱基的片段 , 置换 p F ny 一 2 09 上的相应
片段 , 酶切连接方法详见文献陌 ] .
( v ) 重组侵染性 c D N A 克隆体外转录 . 抽提纯
化重组克隆 F P 质粒 , 经 sP tl 酶切线性化并用 D N A
聚合酶 1 lK en o w 片段补平 . 以此为模板 , 按薛朝阳
等人 l6] 的方法进行体外转录 , 每次反应体系 (50 林)L
中 , 含 D N A 3 一 5 林g , D T 5 0 m m o比 , rAT P, r e T只
r T T P各 0 . 5 m m o z几 , r o T P 5 0 林m o l几 , m 7 e (5 ’ )二 ( 5 ` )G
0
.
5 m m o lL/
,
R N A a s e 抑制剂 5 0 U , R N A 聚合酶 4 0 U ,
3 7 ℃温育 1 h .
WW W
,
S C IC h i n a
.
O O m
科 考 五 叙 第 4 7卷 第 2期 20 0 2年 , 月 简 寺及
重组体 F P 的体外转录产物经无核糖核酸酶的水
等量稀释后 , 与侵染性克隆 p Fny 一 109 和 p F ny 一 3 09 的
转录产物混合 , 并按常规方法接种豌豆 (无须豆尖 ) 、
斑豆 (正更 9 9) 、 蚕豆 (杭 19 1) 和菜豆 (百花园豆 ) 4 种
豆科植物 .
( vi ) 重组体 F P 接种系统寄主烟草后的 E LI S A
检测 . 重组体 F P 定量接种三生烟 (iN co iat na t ab 。 -
c u m S a m s u n N N )
,
1
,
3
,
5
,
7
,
9
,
12
,
15
,
2 0
,
2 5及 3 0 d 后
分别采收接种叶和系统叶叶片 , 用 E LI S A 法检测病
毒在 系统寄主上 的复制 繁殖情况 . 测定 时以 CM V-
nF y 定量接种烟草作为对照 . 检测用的 c M v 单克隆抗
体由本实验室制备 , 检测方法参照青玲等人7[] 的方法 .
2 结果
2
.
1 CM V
·
p l
,
C M V
·
R B 和 C M v · F n y 的生物学检测
C M琴 p l , C M V- R B 和 C M V- F n y 在其他寄主上症
状都十分相似 , 但在蚕豆 、 豌豆 、 孤豆和菜豆上的症
状却有很大差异 , C M V 一 R B 和 CM琴F ny 在这些豆科
植物的接种叶上都为局部枯斑 , 不能系统侵染 , 而
C M V- PI 在 4 种豆科植物上能够发生系统侵染 (表 1) .
2
.
2 C M V- p l R N A Z 包含 G n n 区域的克隆
对更豆上引发过敏反应的 CM V 的深人研究表明 ,
在 CM V R N A Z 上的 2a 基因编码的复制酶蛋白中 , 包
含 G D D 的区域是其诱发因子 18] . 因此 , 我们用 系统
侵染株系 C M v- PI R N A Z 复制酶基 因中含 G D D 的片
段置换局部坏死株系 CM V- Fny R N A 全长 c D N A 侵染
性克隆 p F ny 一 209 的相应区域 , 研究两 C M V 株系在豆
科植物上的致病性差异 , 并由此对 CM v- PI R N A Z上
含 G D D 区域的片段进行了克隆及序列分析 , 其片段
长度为 5 2 9 个碱基 ( G e n B a n k 登录号 : A J 3 19 6 6 5 ) , 与
CM V- nF y 的核昔酸序列同源性为 95 . 8 % , 氨基酸序列
同源性为 9 7 7% (图 l)
.2 3 重组体 F P 的构建
选择了在 e M从 P z 和 e M从 F n y R N A Z 上复制酶
基因 G D D 区域两侧的单酶切位点 刀动 d l 和 cE 口 R l ,
C M V
一
P l 4 0
C M V
一
F n y :
C M V
一
P l
工T 义W W C D F H R F S Y工 R D R R A G V G M P 工S F QR R TG D A F T Y F G N
{ } { 一 { { : 1 { { 曰 曰 ! 1 一曰 曰 { { 一 { 1 { { { 一 { 1 一 { ! 1 一 {
I T X W W C D F H R F S Y 工R D R R A G V G M P I S F QR R T G D A L T Y F G N 5 8 5
8 0
0
ù1气乙6产Ol洲卜
C M V
一
F n y
C M V
一
P I :
T I V T M A E F A W C Y D T D Q F E K L L F S G D D S L G F S QL P P V G D P S
} { 1 一 } { 一 { { } 曰 } I } 1 一 { } { 一曰 一曰 { } 一 { 1 一 { } 1 一一
T I V T M A E F A W C Y D T D Q F E K L L F S G D D S L G F S L L P P V G D F S 6 2 5
C M V
一
Fn y
C M V
一
P l :
K F T T L丫N H E A KV M E P S V P Y I C S K F L L S D E F G N T F S V P D P L
} { } 一 { 一 { } 1 一 { } ! 一曰 1 } l { } { { I { { { { } { } } ) } } 曰
K F T T L F N M E A K V M E P AV P Y I C S K F L L S D E F G N T F S V P D P L
C M V
一
Fn y :
C M V
一
P l
R EV Q R L G T K K I P Y S D N D E F L F A H F M S F V D R L K F L D R M S Q S
{ } { } { { { } } { } } { { } } { } ! } } ! } } { } J { J J } ! { j J ) { { } !
R EV Q R L G T K K I P Y S D N D E F L F A H F H S F V D R L K F L D R M S Q S
C M举F n y
C I D Q L S I F F E L K Y K K S
1 】 ! } { 1 ! } { } } 一 { { } }
C I D Q L S I F F E L K Y K K S
7 0 5
日 6
7 2 1
图 1 C M V- p 1 G D D 区域与 C M V- F n y 相应区域的氨基酸
序列同源性比较
以豆科系统侵染株系 c M v- PI R N A Z 上的包含 G D D
在内的 24 3个碱基的片段置换 PF ny 一20 9 的相应区域 (图
2)
, 得到的重组体命名为 F P 经部分序列测定证实 , 重
组体 F P 中 C M琴P I 的 24 3 个碱基已置换了 p F n y 一 2 0 9
的相应区域 .
G D D
iH
n d 1111 cE
o R I
CM V- F n yl ” ’ }
CM V- P I . . . . . . . . . . . . . . . . . . 口 l
F P L 一一— —— — 』 . 胜一一一一一一一二
图 2 重组体 F P 的构建
.2 4 重组体 F P 在豆科植物上的症状表现
重组克隆 F P 体外转录后 , 与侵染性克隆 p Fny -
109 和 p F n y 一 3 0 9 体外转录产物接种蚕豆 、 更豆 、 豌
豆和菜豆 . 蚕豆接种叶上 1 一 Z d 后出现褐色环斑 , 系
统叶在 4 一 s d后出现环斑 , 叶脉出现褐色 , 茎部也出
现维管束坏死 ; 虹豆接种叶上 5 一 6 d 后出现褪绿斑
点 , 系统叶出现花叶症状 ; 豌豆接种叶第 3天为明脉 ,
第 5 天叶片开始褪绿黄化 , 叶脉呈现褐色 , 系统叶在
第 7 天左右出现黄化 , 最后整株植株都黄化 ; 菜豆接
种叶上第 2天出现褪绿斑 , 系统叶 5 一 6 d 后出现轻花
叶 (图版 I , 附本刊后 .)
表 1 C M V- F n y , C M V- R B 和 e M v- P I 在 4 种豆科植物上的症状
分离物 蚕豆 ( vi
c i a af b a ) 豌豆 ( p i s u爪 s a t i v u m )
接种 叶 系统叶
弧豆 ( iV n g a u n g u i e u l a t a )
接种叶 系统叶
菜豆 (p h a s e o l u s v u zg a r i s )
接种叶 系统叶 系统叶
无无无无C M V 一 R B
C M琴 F n y
C M V
一
P I
枯斑
枯斑
环斑 褐色环斑
枯斑
枯斑
明脉 轻花叶
枯斑
枯斑
褪绿斑 轻花叶
接种叶
枯斑
枯斑
褪绿斑 轻花叶
1 2 8 W Ww
.
S C IC h i n 日 , C O m
简 手及 第 4 7卷 第 2期 0 20 2年 1月 科 考 立 叙
. 2 5重组体 P F和 cM - vFn y在系统寄主烟草上的病
毒积累
cM v
一
n F y和重组体 P F接种三生烟后产生的症状
相似 , 接种叶和系统叶均在第 5 一 7 天出现褪绿花叶
症状 , 后产生严重花叶 . 两次重复 E LI S A 测定结果表
明 , 重组体 F P 和 c M v 一 Fny 侵染烟草后 , 病毒浓度变
化没有明显差异 (图 3) , 这与烟草症状观察的结果相
符 , 说明置换后不影响 CM V- nF y 在系统寄主烟草上
的致病性 .
刊卜 F n y
州口卜 F P
n甘ù、0
工ICU,山1In
恻弋
1 3 5 7 9 12 15 2 0 2 5 3 0
接种时间 d/
2
.
0
1
.
5
恻 1 0
嗽
0 5
0
一今一 F n y
-口一 F P
3 5 7 9 12 15 2 0 2 5 30
接种时间 d/
图 3 重组体 F P 和 C M v 在系统寄主三生烟上的 E IL S A 检测
(a) 接种叶 , ( b) 系统叶
3 讨论
近年来 , 对植物病毒的基 因组研究 已经取得了
很大的进展 . 在此基础上 , 植物病毒的工作重心已转
移至病毒与植物互作机理方面9[] . 对 c M v 致病性研
究 已经有一些报道 . C M v- s ny 不能系统侵染葫芦科
植物 , 而 CM V- nF y 则可以 , 重组实验发现 , R N A 3 上
的移动蛋白基因决定 了这一抗性反应 [ ’ “」. c M从M 不
能系统侵染南瓜 , 当 C M v- M C P 中的 1 2 9 位或 2 14 位
氨基酸被 C M V- nF y 的相应位点氨基酸所代替后就能
在南瓜上产生系统侵染 [” ] . CM v- M 不能侵染玉米 ,
但 C M V- F ny 可以 , 侵染性克隆的重组研究证明这是
由 R N A 3 的 e P 基因决定的 l ` ’ ] . e M v- F n y 在更豆上的
过敏反应是 由 R N A Z 上的 Z a 复制酶基因介导 18] . 国
内这方面的报道还很少 .
我们将豆科系统侵染株系 c M v- PI R N A Z 上包
含 G D D 在 内的 2 43 个碱基片段置换豆科局部坏死株
系 c M v- F n y 的相应区域后 , 得到了重组体 F .P 生物
学观察及 E LI S A 检测表明 , 重组体 F P 在其他寄主植
物上与 C M V- nF y 没有区别 . 但是在豆科植物上 , 重
组体 F P 引起的症状从局部枯斑变为系统侵染 , 说明
R N A Z 复制酶基因包含 G D D 区域的 2 43 个碱基片段
对 CM V 在这些豆科植物上的致病性有重要影响 . 这
一致病性改变的机理可以解释为 , CM V- Fny 的 Z a 复
制酶蛋 白是诱发豆科植物过敏反应的因子 l8] , 而用
CM V- IP 24 3 个碱基片段置换后可能使这个复制酶蛋
白结构发生关键性 的改变 , 从而使其与植物的互作
也发生了变化 .
我们正进一步对该区域进行点突变研究 , 以确定
哪些位点决定了两 C M V 株系在豆科植物上的致病性差
异 .
致谢 本工 作 为 国家 重点基础研 究发展 规划 (批 准号 :
G 2 0 0 16 204 )
、 教育部 “ 高等学校优秀青年教学科研奖励基
金” 及国家杰出青年科学基金 (批准号: 301 25 03 2) 资助项 目 .
参 考 文 献
1 K a pe r J M
,
W
a et wr
o rt h H E
.
C u c u m o v i r u s
.
l n : K u r s akt E
,
e d
·
H an db o o k o f P lan t V i ru s In fe c t i o n s
,
C o m P ar at i v e s D i a g n o s i s
.
A m s t e卜
d a ll l : E l s e v z e r /N o rt h
一
H o l lan d B i o m e d i e a l rP e s s
,
19 8 1
.
2 5 7 一 3 32
2 D i n g S W
,
A n d e r s o n B J
,
H a a s e H R
,
e t a l
·
N e w o v e r l a P P i n g g e n e
e n c o d e d b y t h e C u e u机 b e r m o s a i c v i r u s g e n o m e . V i r o l o g y , 1 99 4 ,
19 8
·
59 3 一 6 0 1
3 周雪平 , 刘勇 , 薛朝 阳 , 等 . 黄瓜花叶病毒两株系的生物学 、 血
清学及外壳 蛋白基 因序列 比较 . 自然科学进展 , 19 9 9 , 9 ( 12) (增
刊 )门 25 4 一 12 6 1
4 R i z z o T M
,
P a l u k a i r i s P C o n s t r u e t i o n o f f u l l
一
l e n g t h e D N A e l o n e s
o f C u c u州 b e r m o s a i e v l r u s R N A s l , 2 a n d 3 : G e n e r a t i o n o f i n fe e t -
i o u s R N A t r a n s c r iP t s
.
M o l G e n G e n e t
,
19 9 0
,
2 22 : 2 49 一 25 6
5 S a m b r o o k J
,
F r l t e h E F, M a n i a t i s T
.
M 0 l e e u l a r C l o n i n g
,
A
L a b o r a t o r y M a n u a l
.
Z n d e d
.
N e w
OY
r k : C o l d S P r i n g H a r b o r
L a b o r a t o r y P r e s s
,
19 8 9
6 薛朝阳 , 周雪平 , 陈青 , 等 . 一种病毒侵染性 全长 。 D N A 克隆的
快速构建 方法 . 生物化学与生物物理学报 , 2以H〕, 32 : 27 0 ~ 274
7 青玲 , 吴建祥 , 戚益军 , 等 . 蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体制备及检
测应用 . 微生物学报 , 20 0 0 , 如: 16 一 172
8 K im C H
,
P a l u k a i t i s P T h e P l a n t d e fe n s e r e s P o n s e t o C u e u m b e r
川 o s a i e v i r u s i n e o w P e a 15 e l i e i t e d b y t h e v i r a l p o l y m e r a s e g e n e
a n d a
fe
e r s v i r u s a c e u m u l a t i o n i n s i n g l e e e l l s
.
EM B O J
,
19 9 7
,
] 6 :
4 0 6 0 ~ 4 0 6 8
9 v a n R e g e n m o r t a l M H V E m P h
a s l s s h i ft i n g fr o m g e n o m i c s t o
v i r u s
一
h o s t i n t e r a e t i o n s
.
A SM N
e w s
,
19 9 8
,
6 4 : 6 8 3 一 6 8 8
10 K a Pl a n I B
,
G a l o n A
,
P a l u k a i t i s P C h a r a c te r i z a t i o n o f C u c u 州 b e r
m o s a i e v i r u s
.
3
.
l o e a l i z a t i o n o f s e q u e n e e s i n t h e m o v e m e n t P r o t e in
e o n t r o l l i n g s y s t e m i e i n fe c t i o n i n e u e u r b i t s
.
V i r o l o g y
,
19 9 7
,
2 3 0 :
34 3
~
34 9
1 1 Wo n g S M
,
T h i o 5 S C
,
S h i n t a k u M H
,
e t a l
.
T h e r a t e o f c e l l
一
t o
-
e e l l m o v e m e n t i n s q u a sh o f C u e u m b e r m o s a i e V i r u s 1 5 a fe
e t e d b y
s e q u e n e e s o f t h e e a P s i d P r o t e i n
.
M
o l P l a n t
一
M i
e r o b e In
,
19 9 9
,
1 2 :
6 2 8 ~ 6 32
12 Ry u K H
,
K im C H
,
P a l u k a i t i s P T h e e o a t P r o t e in o f C u c u m b e r
m o s a f e v i r u s 15 a h o s t r a n g e d e r e r m l n a n t fo r i n fe e t i o n o f m a i z e
.
M
o l P l a n t
一
M i e r o b e I n
,
19 9 8
,
11 : 3 5 1 一 3 5 7
( 2 0 0 1
一
0 7
一
10 收稿 , 2 00 1一 1 1一 2 2 收修改稿 )
WWW
.
S 0 iC h i n s
.
O O m 12 9
陶小荣等 黄瓜花叶病毒 R N A Z复制酶基因中的 2 4 3个碱基决定其在豆科植物上的致病性 图版 I
重组体 F P在蚕豆 和班豆系统叶上 的症状
l示蚕豆 , 2 示 盯豆