全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (4): 491-496, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.04.011
收稿日期 : 2008-07-28; 接受日期 : 2008-11-24
基金项目: 国家自然科学基金 (No.30670209)、四川省教育厅重大培育项目(No.07ZZ015)和四川省科技厅应用基础项目 (No.
05JY029-107)
*通讯作者。 E-mail: zxsu2008@163.com
.技术方法.
珍稀濒危植物珙桐胚的萌发与快速繁殖
余阿梅 1 , 苏智先 2* , 王立强 3 , 方志荣 4 , 邹利娟 1
1西华师范大学环境科学与生物多样性保护重点实验室, 南充 637002; 2绵阳师范学院 , 绵阳 621000
3西华师范大学生命科学学院, 南充 637002; 4西昌学院生化系 , 西昌 615003
摘要 首次采用均匀设计和回归分析方法对影响珙桐(David ia involucrata )胚萌发的3种因素(基本培养基、赤霉素和活性
炭)进行优化, 并利用萌发胚建立了珙桐的高效再生体系。 利用回归方程得出胚萌发的最优条件为: 在含有0.5 mg.L-1 IBA和
1 m g.L-1 6-BA的1/2MS培养基中添加2.85 m g.L-1 GA3和0.25 g.L-1活性炭。在验证实验中珙桐胚萌发率为87.72%, 与预测
值无显著差异。 最优的芽诱导与增殖条件为: 添加0.1 mg.L-1 NAA和2.0 mg.L-1 6-BA 的WPM培养基, 增殖系数为4.34。在
生根培养基中增殖的芽生根率高达90%, 移栽成活率为71%。
关键词 珙桐 , 胚 , 回归分析 , 均匀设计
余阿梅 , 苏智先 , 王立强 , 方志荣 , 邹利娟 (2009). 珍稀濒危植物珙桐胚的萌发与快速繁殖 . 植物学报 44, 491-496.
珙桐(Davidia involucrata)又名中国鸽子树 , 隶属
珙桐科(Davidiaceae)珙桐属(Davidia), 是我国特有的
一级保护植物 , 且是集人文、观赏和材用等多种价值
于一身的珍稀濒危物种。 珙桐以有性繁殖为主, 且繁
殖系数极低, 有千花一果之说 , 其种子败育现象十分
普遍。珙桐种子具有高休眠性, 因此发芽十分困难, 一
般需要 2-3年才能萌发。 近年来由于乱砍滥伐、过度
放牧、采摘珙桐种子和乱挖幼苗等人为因素, 使珙桐
的生态环境受到严重破坏, 珙桐的个体数量逐渐减少,
分布面积也逐渐缩小, 因此挽救和保护珙桐并扩大其
个体数量迫在眉睫。近年来, 研究者试图利用组织培
养技术解决珙桐繁殖困难的问题, 但是到目前为止, 相
关的报道多以冬芽、叶片和茎段等作为外植体进行研
究, 其结果不理想(分化率最高为 40%), 且存在变异
(Sato, 1996; 罗世家, 2003; 金晓玲等, 2007); 而以胚
的各部分(包括胚轴和子叶)为外植体进行珙桐快速繁
殖的研究在国内外尚未见报道。根据预实验结果, 本
研究采用均匀设计法对影响珙桐胚萌发的3种主要因
素(基本培养基、赤霉素和活性炭)进行优化, 获得了最
佳组合, 提高了胚的萌发率, 进而进行丛生芽的诱导与
增殖, 建立了较为稳定且高效的再生体系, 为珙桐的克
隆繁殖与保护奠定了基础。
1 植物材料
供试材料为 2006年 10月采自四川省眉山县的珙桐
(Davidia involucrata Baill)成熟果实, 去除外果皮和果
肉, 用水冲洗干净后保存于湿润的河沙中层积 1年。
剥去珙桐的骨质内果皮, 将珙桐种子放在蒸馏水
中洗净, 剥去胚乳, 在超净工作台上 , 用 75%乙醇灭
菌 30秒, 用无菌水冲洗 3-4次, 再用 0.1% 的 HgCl2
灭菌 1分钟, 无菌水冲洗至少 5次, 用无菌滤纸吸干
其表面的水分, 待用。
2 培养基成分与培养条件
2.1 培养基成分
采用均匀设计法对影响珙桐胚离体培养的 3种主要
因素: 基本培养基(X1)、赤霉素(gibberellic acid, GA3)
(X2)和活性炭(act ive carbon, AC)(X3)进行研究, 实验
492 植物学报 44(4) 2009
因素及水平排列组合见表1, 在以上培养基中均添加
有 0.5 mg.L-1 IBA和 1.0 mg.L-1 6-BA。接种后 30天
统计胚的萌发率, 实验中萌发的标准是幼根超过该胚
的长度。
萌发率 = (未污染萌动胚数 / 未污染总胚数 )
×100%
2.2 培养条件
2.2.1 胚萌发条件的优化
采用二次多项式逐步回归法进行建模分析, 回归模型
如下:
式中 Y为因变量, a0为常数项, a i、aii和 aij 为待估参
数, X i 是自变量项, X i2是自变量的二次项, XiXj是交
互作用项。该方程描述了不同自变量以及它们之间
的交互作用对(胚)萌发率的影响。所有的数据分析 ,
包括回归分析和最优值的确定, 均利用 DPS 数据处
理系统完成。
2.2.2 丛生芽的诱导与增殖
将已经萌发的胚(未长出真叶)去掉部分子叶 , 下胚轴
及胚根(图1)按原生长极性接种到诱导丛生芽的培养
基中培养, 增殖后的丛生芽 , 一部分接入新鲜的增殖
培养基中进行扩繁 , 另一部分则进行生根培养。
成活率 = (成活外植体总数 / 接种外植体总数)
×100%
增殖系数 =增殖后的芽体个数 /成活的接种外植
体数
2.2.3 生根培养
当丛生芽生长到 3 cm高时, 单株切下转至生根培养
基中, 30天后观察结果。
实验中每个比较均设 3 个重复, 所有培养基的
pH值均为 5.8-6.0, 并在 121°C高压下灭菌 20分钟。
萌发与诱导增殖培养基均添加浓度为 30 g.L-1 的蔗
糖。 生根培养基添加浓度为 20 g.L-1 的蔗糖, 并用
7 g.L-1的琼脂固化。培养温度为 22-25°C, 每天 12
小时光照培养, 光照强度为 32-43 mmol.m-2.s-1。
3 结果与讨论
3.1 种子结构与休眠原因
珙桐种子外被 1层黄白色相间的骨质化的内果皮(图
2A)。种子呈长瓜子形 , 先端较尖 , 另一端钝圆 (图
2B)。 种子由1层很薄的黄褐色种皮、胚和胚乳组成。
胚乳比较肥大 , 是种子的主要部分。胚相对较小, 包
埋于胚乳的中间 , 子叶明显, 2片子叶一端稍尖 , 另一
端钝圆, 钝圆处与胚轴相连 , 下胚轴较长, 呈白色(图
2C)。在自然条件下 , 珙桐种子需要 2-3年才能萌发。
对于引起珙桐种子高度休眠的具体原因, 目前还不十
分清楚。学者们结合休眠相关因子提出了不同的观
表 1 均匀设计实验因素与水平
Table 1 Exper imental factors and their levels for unif orm
design (UD)
Level Factor
　 X1 X2 (mg.L-1) X3 (g.L-1)
1 1/2MS 0 0
2 MS 1.0 1.0
3 - 2.0 2.0
4 - 3.0 3.0
X1、X2和 X3分别代表基本培养基、赤霉素和活性炭因子。1-4:
各因素的水平
X1, X2 and X3 represented factors for medium type, concentra-
t ion of gibberellic ac id (GA 3) and ac tive carbon (A C) ,
respectively. 1-4: The level of each f actor
图 1 取材示意图
(A) 珙桐胚 ; (B) 沿画线取材 ; (C) 外植体
Figur e 1 Schematic diagram of draw ing materials
(A) The embryo of Davidia involuc rata; (B) Draw ing materials
along marking; (C) Explants
493余阿梅等: 珍稀濒危植物珙桐胚的萌发与快速繁殖
点, 主要有 3种: (1)内果皮坚硬, 透水、透气性差以
及机械阻力造成了珙桐种子休眠(万朝琨, 1998); (2)
种胚形态后熟和生理后熟引起珙桐种子休眠(陈坤荣
等, 1988; 李卓杰等, 1989), 而生理后熟则引起珙桐
种子二度休眠 ; (3) 珙桐果实中含有大量抑制种子萌
发的物质, 引起了珙桐种子休眠(雷泞菲等, 2003)。有
研究表明, 从珙桐种子中分离出胚进行离体培养 , 可
以完全解除种皮和胚乳的抑制作用, 使胚很快萌发
(Raghavan, 2003); 然而在本研究中却发现 , 只有添
加适当浓度的赤霉素才能打破珙桐胚的休眠, 在未添
加赤霉素的培养基中, 胚则不能萌发, 说明除果肉、 内
果皮和胚乳外(雷泞菲等, 2003), 胚内也含有抑制其萌
发的物质, 这可能是引起珙桐种子二度休眠的原因。
3.2 组织培养添加物对胚萌发的影响
珙桐胚在适宜的培养基上进行光照培养, 接种 10天
后开始萌动, 闭合的 2片子叶逐渐分开。13-15天后,
胚根萌动并开始生长 ; 子叶展开, 并由白色开始变绿
(图 2D)。30天后, 子叶完全展开并变绿 ; 下胚轴有明
显的伸长、变弯, 并开始转成淡绿色(图 2E), 胚根生
图 2 珙桐胚的萌发与快速繁殖
(A) 果实(Bar=1.5 cm) ; (B) 种子(Bar=1.5 cm) ; (C) 胚(Bar=1.5 cm) ; (D) 子叶展开 , 变绿(Bar=1.5 cm) ; (E) 下胚轴伸长 , 弯曲 (Bar=
1.5 cm); (F) 诱导丛生芽(Bar=1.5 cm); (G) 丛生芽的伸长 (Bar=2.0 cm); (H) 生根(Bar=1.5 cm); (I) 试管苗移栽(Bar=1.5 cm)
Figur e 2 The germination of embryo and micropropagation of Davidia involucrata
(A) Fruit (Bar=1.5 cm) ; (B) Seed (Bar=1.5 cm); (C) Embryo (Bar=1.5 cm); (D) Cotyledon expansion, turning green (Bar=1.5 cm); (E)
Hypocoty l elongation, blending (Bar=1.5 cm); (F) Propagation of multiple-shoot (Bar=1.5 cm); (G) Elongation of the mult iple-shoot
(Bar=2.0 cm); (H) Rooting (Bar=1.5 cm); (I) Transplantation of the tube plants (Bar=1.5 cm)
494 植物学报 44(4) 2009
长。对各处理的萌发率进行统计, 结果见表2。以MS
为基本培养基的处理 , 胚的萌发率相对较低, 而且有
的胚轴会发生纵裂, 子叶展开却不能进一步正常生长
变绿, 这可能是由于 MS 培养基中大量元素浓度过
高, 不适合珙桐胚的萌发与生长(张惠君和罗凤霞,
2003; Viloria et al., 2005; 尚旭凤等, 2007)。 在添加
低浓度赤霉素的培养基上, 胚的萌发率随着赤霉素浓
度的增加而升高 , 但当赤霉素增加到一定浓度时 , 胚
的萌发率又开始降低; 而在未添加赤霉素的培养基
上, 珙桐胚不能萌发 , 可见赤霉素是影响胚萌发的关
键因素。在本研究中, 赤霉素虽然能够有效打破珙桐
种子的休眠, 但其作用并不与浓度呈正相关 , 而是有
一个临界值, 这与林松明等(2006)在解除丹凤(Paeo-
nia suffruticosa)种子上胚轴休眠的研究中得出的结论
一致。唐德瑞等(2006)在研究白皮松(Pinus bunge-
ana)胚萌发时发现 , 在培养基中加入活性炭 , 胚根生
长且胚生长速度加快。在本实验中, 也发现了类似现
象, 这可能与活性炭能够吸附胚中一定量的抑制其萌
发的物质有关。
3.3 胚萌发条件的优化
均匀设计最初是中国数学家方开泰和王元(1994)将数
论与多元统计相结合, 在正交设计的基础上创立的一
种先进的且适用于多因素、多水平的实验设计方法。
该方法在实验范围内通过实验点均匀散布以求通过
最少的实验次数来获取尽可能多的信息, 实验次数比
正交设计明显减少 , 可节约大量的人力和物力(方开
泰和王元, 1994; 刘永才, 2002)。但此方法的不足在
于被分析的组合是有限的且是不连续的 (齐力旺等 ,
2001)。 在珙桐组织培养中 , 我们首次采用了均匀设
计法对影响珙桐胚萌发的 3种因素进行了研究 , 为了
弥补均匀设计法的不足, 利用二次多项式逐步回归法
进行数学建模 , 得到回归方程 : Y ﹦ 5.488+67.601
X2-5.795X12-11.162X22-3.991X32-5.252X1X2+8.439
X1X3-1.248X2X3 。从而使组合变为连续。
对该方程进行显著性检验(F=39.186 3, P=0.001
6, R=0.992 8), 方程达极显著水平 , 表明其具有很好
的模拟与预测能力。由方程可知, 赤霉素对应项的系
数最大(分别为+67.601, -11.162, 正负号表示因素的
作用方式), 而且赤霉素与其它因素的交互作用较小
(系数分别为 -5.252, -1.248)。上述结果表明 , 赤霉
素对珙桐胚萌发率的影响最大 , 是3个因素中最重要
的因素; 改良MS培养基和活性炭浓度间的交互作用
有利于提高胚萌发率, 但两者分别与赤霉素的交互作
用却不利于胚萌发率的提高 , 不过此影响相对较弱。
对方程优化后, 求得实验范围内各个因素的最佳
组合为: 1/2MS培养基、2.85 mg.L-1 GA3和 0.25 g.
L-1 AC, 珙桐胚的萌发率可达 87.7%。对最优条件下
的因素组合进行验证 , 验证值为87.72%, 与预测值无
显著差异(a=0.05), 从而获得珙桐胚萌发的最佳培养
基为 1/2MS + 2.85 mg.L-1 GA3+ 0.25 g.L-1 AC + 0.5
mg.L-1 IBA + 1 mg.L-1 6-BA。研究结果表明 , 均匀
设计及二次多项式逐步回归法对选择最佳珙桐胚离
体培养实验方案是有效的 , 不仅可减少实验次数, 而
且准确性好。
3.4 不同激素组合对丛生芽诱导与增殖的影响
木本植物在组织培养过程中普遍存在褐化现象(陈正
华, 1986)。因为高浓度的无机盐增加了酚类的合成
表 2 U12 (12×24)均匀设计实验方案及结果
Table 2 Exper imental plan and result of uniform design U1 2
(12×24)
Run Variable level Germination rate ±SE (%)
number X1 X2 X3
1 2 3 2 66.16±0.93　
2 2 1 4 0.00±0.00
3 1 3 4 60.67±0.69
4 1 1 3 0.00±0.00
5 1 3 2 86.80±1.13
6 1 4 3 77.50±0.65
7 2 4 4 58.80±0.72
8 2 4 1 50.50±0.68　
9 2 2 3 35.13±0.83
10 2 2 1 30.23±0.84
11 1 1 1 0.00±0.00
12 1 2 2 52.47±0.87　
表中结果为平均值±标准误。X1、X2和 X3 : 同表 1
Every row of the results obtained w ere means ±SE. X1, X2 and
X3: See Table 1
495余阿梅等: 珍稀濒危植物珙桐胚的萌发与快速繁殖
与氧化酶的活性, 氧化酶又进一步促进了酚类合成与
氧化(姚红军等, 1999)。为了防止珙桐在丛生芽的诱
导与增殖培养中发生褐化 , 本研究使用了低盐的
WPM培养基。外植体在以WPM为基本培养基的培
养基组合中培养 10天后, 基部开始轻微膨胀, 30天
后在外植体的顶端长出小芽 , 形成丛芽(图 2F)。当丛
芽长至 3 cm时, 将其分割为单芽转入新鲜培养基进
行扩繁(图 2G)。同时, 研究发现, 珙桐胚在萌发初期
生长迅速且生长势强; 但在丛生芽阶段生长速度变慢
且生长势弱, 这与林松明等(2006)对丹凤种子上胚轴
的研究结果相似, 推测可能与早期赤霉素处理有关 ,
具体原因有待进一步研究。
不同浓度的 6-BA 对丛生芽的诱导明显不同(表
3), 当6-BA的浓度从0.5 mg.L-1增加到2.0 mg.L-1时,
丛生芽的增殖系数明显增加 ; 但当 6-B A 的浓度从
2.0 mg.L-1增加到 4.0 mg.L-1时, 丛生芽的增殖系数
又明显减少。 细胞分裂素与生长素的比例决定着外植
体的分化再生方向, 较高的比例将诱导外植体分化成
芽(Skoog and Miller, 1957)。本研究结果表明 , 当 6-
BA与NAA的比例增高时 , 丛生芽的增殖系数也随之
增大, 但它们的比例也不宜过高 , 过高则会抑制丛生
芽的增殖 , 外植体的成活率也呈现出相同的变化趋
势, 这与熊友华等 (2005 )对圆瓣姜花(Herdychi um
forresti i)种子胚的研究结论相似。本实验中最佳诱导
增殖培养基为 WPM + 0.1 mg.L-1 NAA + 2.0 mg.
L-16-BA。
3.5 生根及移栽
关于珙桐幼苗诱导生根已有文献报道 (金晓玲等 ,
2007), 研究表明 1/2MS培养基对植物生根具有促进
作用(谭文澄和戴策刚 , 1991)。本研究在前人工作的
基础上结合预实验结果, 选用 1/2MS + 1.5 mg.L-1
IBA + 1.0 g.L-1 AC + 20 g.L-1蔗糖为生根培养基 , 培
养 30天后, 生根率达 90%, 在珙桐幼苗的基部周围
长出了白色肉质的根 , 直径为1 mm左右并向四周呈
辐射状(图 2H), 不经过愈伤组织 , 直接从茎的基部诱
导出根, 有利于炼苗的成功 ; 生根 30天后, 将培养罐
盖子旋开, 在自然光照下炼苗 7天, 选取根长为4 cm
左右且具有 4条根以上的幼苗移栽至已消毒的河沙
基质中(图 2I), 以1/10MS为营养液喷洒幼苗后 , 用烧
杯罩住以保温保湿 , 4周左右便可见到叶片和根有明
显的增长, 新叶萌发, 移栽成活率达 71%。
致谢 西华师范大学生命科学学院的杨军副研究员
和王立强同学对本研究及本文的撰写提供了很大帮
助。在此表示感谢！
参考文献
陈坤荣 (1988). 珙桐种子休眠原因研究初报 . 植物生理学通讯
25(3), 24-28.
陈坤荣 , 李桐森, 田广红 , 陈玉惠, 叶如欣 (1988). 珙桐繁殖的
生物学特性 . 西南林学院学报 18(2), 68-73.
陈正华 (1986). 木本植物组织培养及其应用 . 北京 : 高等教育
表 3 不同激素组合对丛生芽诱导与增殖的影响
Table 3 Ef fec ts of dif ferent hormone combinations on the shoot induction and proliferation
Number Hormone concentration Propagation Surviving rate Situation of c lustering grow th
(mg.L-1) index of explants
6-BA NA A (means±SE) (means±SE) (%)
1 0.5 0.1 1.43±0.01 e 81.53±0.52 c The buds are very thick and s low grow ing
2 1 0.1 2.46±0.02 b 84.47±0.43 b The buds are quite thick and s low grow ing
3 2 0.1 4.34±0.02 a 90.47±0.38 a The buds are quite thick and f ast grow ing
4 3 0.1 2.32±0.01 c 84.33±0.32 b The buds are f ine and f ast grow ing
5 4 0.1 1.58±0.01 d 81.40±0.32 c The buds are very f ine and f ast grow ing
表中计算结果为平均值 ±标准误 , 并采用 Tukey 法进行多重比较 (a=0.05).
Every row of the results obtained w ere means ± SE, and w ere processed by the Tukey multi-compar ison at 95% probability level.
496 植物学报 44(4) 2009
Embryo Germination and Rapid Propagation of Rare and
Endangered Plant Davidia involucrata
Amei Yu1, Zhixian Su2*, Liqiang Wang3, Zhirong Fang4, Lijuan Zou1
1Ke y L aborato ry of Envi ron men tal and Bi odi versity Co nse rvat ion , Chin a We st Normal Uni versit y, Nanchon g 6 370 02, Chi na
2Mi anyang Normal Co lleg e, Mia nyan g 6 210 00, Chi na; 3Co lle ge o f L ife Scien ces, Ch ina We st Normal Uni versity, Nanchon g 63 700 2,
Ch ina ; 4Bi och emistry De partmen t, Xichang Co lle ge, Xichan g 6 150 03, Chi na
Abstract Three f ac tors (media type, gibberellic acid [GA3] and ac tive carbon) aff ec ting the embryo germination of Davi di a
invol uc rata w ere optimized by use of a uniform design and analyzed by regression analysis . Then a system f or micropropagating
D. invol ucrata w as es tablished f rom the embryos . From regress ion equations, the optimal condit ions for embryo germination w ere
the addition of 2.85 mg.L-1 GA3 and 0.25 g.L-1 ac tivated carbon to 1/2 MS medium containing 0.5 mg.L-1 IBA and 1 mg.L-1 6-BA. The
germination rate of embryo w as 87.72%, w ithout s ignif icant deviation to the predic ted value. The optimal conditions for shoot
induction and multiplication w ere WPM medium supplemented w ith 0.1 mg.L-1 NAA and 2.0 mg.L-1 6-BA; the mean shoots obtained
per explant w as 4.34. An amount of 90% of shoots rooted on rooting medium, and 71% plants survived af ter transplanting.
Ke y words Davidi a i nvo lucrata, emb ryo , re gre ssi on ana lysis, uni form d esi gn
Yu AM , Su ZX , Wang LQ, Fang ZR, Zou LJ (2009 ). Embryo germina tio n an d rapid propa gati on of rare and en dan gere d p lant Davi dia
in volu crata. Ch in Bull Bo t 44 , 49 1-49 6.
* Author for correspondence. E-mail: zxsu2008@163.com
(责任编辑: 孙冬花)
出版社 . pp. 456-466.
方开泰 , 王元 (1994). 均匀设计与均匀设计表 . 北京 : 科学出版
社 . pp. 12-15.
金晓玲 , 吴安湘 , 沈守云 , 章怀云 (2007). 珍稀濒危植物珙桐
离体快繁技术初步研究 . 园艺学报 34, 1327-1328.
李卓杰 , 陈润泽 , 傅家瑞 , 陈坤荣 (1989). 珙桐种子休眠和萌
发中酸性磷酸酶同工酶的研究. 西南林学院学报 9(1), 8-
13.
刘永才 (2002). 均匀设计及其应用 . 战术导弹技术 1, 58-61.
罗世家 (2003). 珙桐组织培养研究 . 林业科技 31(4), 4-6.
雷泞菲 , 苏智先 , 郭家洪 (2003). 珍稀濒危植物珙桐果实中的
萌发抑制物质 . 应用与环境生物学报 9, 607-610.
林松明 , 徐迎春 , 蔡志仁 , 程明 (2006). 打破丹凤种子上胚轴
休眠的研究 . 江苏农业科学 (1), 84-86.
齐力旺 , 李玲 , 韩一凡 , 韩素英 (2001). 落叶松胚性愈伤组织
诱导培养基中激素的311-A最优回归设计筛选 . 林业科学研
究 14, 251-257.
尚旭凤 , 徐锡增 , 方升佐 (2007). 青钱柳离体胚的培养及快速
繁殖 . 南京林业大学学报(自然科学版) 31, 101-105.
谭文澄 , 戴策刚 (1991). 观赏植物组织培养技术 . 北京 : 中国林
业出版社 . pp. 99-199.
唐德瑞 , 李林 , 李科友 (2006). 白皮松成熟胚的离体培养研究 .
西北植物学报 26, 1346-1350.
万朝琨 (1998). 珙桐种子休眠的解剖学研究 . 中南林学院学报
8, 35-39.
熊友华 , 马国华 , 刘念 , 黄邦海 (2005). 圆瓣姜花种子胚的组
织培养与快速繁殖 . 广西植物 25, 241-244.
姚红军 , 罗晓芳 , 田砚亭 (1999). 植物组织培养外植体褐变的
研究进展 . 北京林业大学学报 21(3), 78-84.
张惠君 , 罗凤霞 (2003). 水曲柳未成熟胚的离体培养研究 . 林
业科学 39(3), 63-69.
Raghavan V (2003). One hundred years of zygotic embryo cul-
ture investigations. In Vi tro Cell Dev Biol Plant 39, 437-442.
Sato T (1996). Mic ropropagation of hankachinoki (Davi di a
involucrata). J Jpn For Soc 78, 309-311.
Skoog F, Miller CO (1957). Chemical regulation of grow th and
organ formation in plant tissue culture in vi tro. Symp Soc Exp
Biol 11, 118-131.
Vilor ia Z, Gr oss er JW, Bracho B (2005) . Immature embryo
rescue, culture and seedlings development of acid citrus fruit
derived from interploid hybridization. Plant Cell T issue Organ
Cult 82, 159-167.