全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 459-464, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-07-04; 接受日期: 2007-01-07
基金项目: 辽宁省博士启动金(No. 20031080)
* 通讯作者。E-mail: xiaxiuying@yahoo.com.cn
.实验简报.
反义 4CL与 UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析
梁海泳, 夏秀英* , 高晓蓉, 苏乔
大连理工大学环境与生命学院, 大连 116026
摘要 构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)基因和4-香豆酸: 辅
酶A连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase, 4CL)反义基因的双价基因植物表达载体, 用热激法转化至根癌农杆菌LBA4404
中, 并用制备的农杆菌工程菌进行了烟草转化。PCR及Southern 杂交结果证实, 双价基因已成功整合到烟草基因组中。综纤
维素和硫酸木质素含量测定结果显示, 转基因烟草纤维素含量增加, 木质素含量减少, 表明双价基因能够有效表达。
关键词 纤维素, 辅酶A连接酶, 4-香豆酸, 木质素, 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶, 双价基因
梁海泳, 夏秀英, 高晓蓉, 苏乔 (2007). 反义 4CL与 UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析. 植物学通报 24, 459-464.
用基因工程技术调控纤维素及木质素的生物合成,
培育高纤维素和低木质素含量的植物新品种, 对造纸、
纺织和饲草等原料的生产具有重要意义(魏建华和宋艳
茹, 2002)。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glu-
cose pyrophosphorylase, UGPase)可催化形成尿苷二
磷酸 -D-葡萄糖(uridine diphosphate D-glucose,
UDPG), UDPG可作为葡萄糖基供体参与纤维素的合成
代谢。Xue等(1998)的研究表明, 转移细菌UGPase基
因, 可提高转基因烟草中的纤维素含量, 增加其生物量。
4-香豆酸: 辅酶 A连接酶(4-coumarate: coenzyme A
ligase, 4CL)是控制木质素生物合成的关键性限速酶, 主
要催化羟基苯乙酸到相应的硫脂的反应, 可利用不同的
底物(香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸等)来调节木
质素合成。已有研究表明, 抑制 4CL基因表达后, 转基
因植物的木质素含量普遍下降, 但转基因植物的生长、
发育及形态结构基本不受影响(Wei et al., 2005)。可见4CL
基因是理想的改良植物品质的目标基因。
本研究将来源于紫穗槐的UGPase基因和 4CL反
义基因共同连接到质粒载体pBI121上, 构建双价基因植
物表达载体; 采用根癌农杆菌介导法, 将双价基因转移至
烟草基因组中, 获得大量转基因植株, 为研究双价基因对
转基因植株纤维素及木质素合成的影响, 探索有效调控
植物木质素及纤维素生物合成、改良植物品质的方法
创造了条件。
1 材料与方法
1.1 植物材料
烟草(Nicotiana tabacum)品种NC89, 组培苗由本实验
室保存。
1.2 菌株和质粒
大肠杆菌DH5a、根癌农杆菌 LBA4404由本实验室保
存; 质粒 pBU和 pBa4CL分别含有来源于紫穗槐的
UGPase基因和 4CL反义基因, 由本实验室构建。
1.3 酶和试剂
SacI、EcoRI和 BamHI酶均购自宝生物(大连)有限公
司; DNA片段回收试剂盒购自北京鼎国生物工程公司;
Southern杂交试剂盒(DIG High Prime Labeling and
Detection Starter Kit II)购自 Roche生物公司。
1.4 双价基因植物表达载体构建
首先用引物 F1: 5 ATGCGAGCTCGATCGTTC-
460 植物学通报 24(4) 2007
AAACATTTGGCA3/F2: 5CGGGGAA ATTCGAGC-
TCGAATTCATCTTTCGCT3, 从载体pBa4CL上PCR
扩增含 NOS终止子、CaMV35S启动子及 anti4CL序
列的片断, 其中正向引物F1中设计了SacI酶切位点, 反
向引物 F2中包含了载体中的 SacI酶切位点。然后用
SacI酶分别对PCR产物及质粒pBU进行酶切, 并将产
物进行连接, 转化大肠杆菌DH5a, 对获得的阳性菌落进
行酶切鉴定。最后用热激法将构建正确的载体转化进
根癌农杆菌LBA4404中, PCR筛选出含有双价基因表
达载体的阳性菌落, 用于后面烟草转化。
酶切、连接、转化及筛选均参考《分子克隆实验
指南》(Sambrook and Russell, 2002)。
1.5 烟草转化、筛选及检测
参照《植物基因工程》(王关林和方宏筠, 2002)。叶片
再生培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA,
抗性芽筛选培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·
L-1 NAA+50 mg·L-1 Km+250 mg·L-1 Cef, 生根筛选培
养基为MS+0.1 mg·L-1 NAA+50 mg·L-1 Km。
植物总 DNA提取采用 CTAB法。
根据 3 5 S 启动子序列设计正向引物 3 5 S :
5CTAACAGAACCGCCGTAAAGAC3, 再根据 anti-
4 C L 及 U G P a s e 基因序列设计反向引物 , A R :
5 C T T C C C T T C A C C T T A C T G C T T 3 及 U R :
5CGTAAGGCACAACCACTTCATCG3, 以35S/AR及
35S/UR为引物对抗性植株进行PCR检测, PCR反应条
件: 94℃ 5 分钟; 94℃ 30 秒、55℃ 30 秒、72℃ 1
分钟, 30个循环; 72℃ 7 分钟。
Southern 杂交检测按试剂盒所示方法进行, 烟草总
DNA用EcoRI进行酶切, 以引物 35S/AR和35S/UR分
别扩增质粒得到的 PCR产物为探针, 分别命名为 C-
probe和 U-probe。
1.6 木质素及综纤维素含量测定
选取PCR检测为阳性的抗性植株及未转基因植株, 移栽
至花盆中, 培养4个月后截取茎秆测定硫酸木质素与综
纤维素含量。每一株系和对照各取3株, 参照贾彩红等
(2004) 文中方法, 测定结果取平均值。
1.7 转基因植株细胞壁的显微镜观察
取转基因植株及未转基因植株相同部位的茎秆, 用冷冻
切片机横切成 5 µm厚的薄片, 放在 400倍显微镜下进
行观察。
2 结果与分析
2.1 双价基因植物表达载体的构建
用SacI对质粒pBU进行酶切, 回收并去磷酸化处理后,
与从质粒pBa4CL上PCR扩增并经SacI酶切的产物进
行连接, 电转化至大肠杆菌 DH5a中, 涂布平板过夜培
养。结果获得 8个阳性菌落。SacI和 BamHI酶切鉴
定结果显示, 其中4个菌落用SacI可以切出约10.3 Kb
和 2.5 Kb 的片段, 用BamHI可以切出约 9.6 Kb和 3.2
Kb 的片段, 与预计大小一致, 说明双价基因表达载体构
建成功, 将此载体命名为 pBU-a4CL。
对pBU-a4CL转化农杆菌LBA4404获得的阳性菌
落进行了 PCR鉴定, 结果显示, 以 35S/AR和 35S/UR
为引物, 阳性菌落可分别扩增出预期大小的 700 bp 和
1 100 bp的目的条带, 表明载体pBU-a4CL已导入农杆
菌中, 可以用于烟草转化。
2.2 烟草抗性植株的获得及PCR检测
经过连续筛选, 共获得52株可以在卡那霉素中生根的抗性
植株。分别以 35S/AR和 35S/UR为引物, PCR检测抗
性植株, 结果显示(图1), 其中41株可扩增到与质粒相同
的约700 bp 和1 100 bp的特异条带, 而非转基因植株没
有扩增产物出现。此结果初步表明, 反义4CL和UGPase
基因均已整合到烟草基因组中。本研究中PCR检测阳性
率约为 79%, 而且所有转化均为双价基因的共转化。
2.3 烟草抗性植株的Southern 杂交检测
以质粒pBU-a4CL为阳性对照, 未转基因植株为阴性对
照, 对PCR阳性植株进行Southern杂交检测。结果显
示(图2), 转化株T28用2种探针均检测出杂交信号, 表
461梁海泳等: 反义 4CL与 UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析
明UGPase基因及反义4CL基因已成功整合进烟草基
因组中。
2.4 木质素与综纤维素含量测定
测定了PCR检测呈阳性的部分转基因株系的木质素和
综纤维素含量(图3), 方差分析结果表明, 转基因株系综
纤维素含量与对照株间存在显著差异(F=2.96> F0.05(6,14)
=2.85), 转基因株系综纤维素含量平均升高5.7%, 其中
T28株系升高幅度最大, 约6.2%; 而对于木质素含量, 转
基因株系与对照株间的差异达到了极显著水平(F=5.54
图 1 部分抗性植株的 PCR检测结果(左: 35S/UR为引物; 右: 35S/AR为引物)
1-5: 抗性植株 T2、T7、T13、T15和 T28; 6: 阴性对照; 7: 质粒 pBU-a4CL; M: DL2000 marker
Figure 1 PCR analysis of putative transformants and untransformed plants (Left: primer 35S/UR; Right: primer 35S/AR)
1-5: resistant plants T2, T7, T13, T15 and T28; 6: negative control; 7: plasmid pBU-a4CL; M: DL2000 marker
图 2 转基因烟草 Southern检测
(A) 以 C-probe为探针;
(B) 以 U-probe为探针。
1-2: 抗性植株 T28和 T4; 3: 阴性对照; 4: 0.12-21.2 kb DNA分子量标准; 5: 质粒 pBU-a4CL
Figure 2 Southern analysis of transgenic tobacco
(A) C-probe;
(B) U-probe.
1-2: resistant plants T28 and T4; 3: negative control; 4: 0.12-21.2 kb DNA marker; 5: plasmid pBU-a4CL
462 植物学通报 24(4) 2007
>F0.01(6,14) =4.46), 转基因株系木质素平均降低38.4%,
T7株系降低幅度最大, 约 42.8%。
2.5 转基因植株细胞壁的观察
纤维素与半纤维素、果胶、木质素、伸展蛋白、壁
酶及其它结构蛋白等构成植物细胞的细胞壁(李雄彪和张
金忠, 1994; 林金安和贺新强, 2000)。 Taylor等(2003)
的研究结果表明, 纤维素含量与细胞壁厚度呈正相关。
本研究观察了纤维素含量增加最多的转基因株系T28与
未转基因植株细胞壁的厚度差异, 结果表明, T28株系的
细胞壁比未转基因的厚, 且细胞排列紧密(图 4)。由此
我们认为细胞壁的厚度变化也许与纤维素的含量变化相
图 3 综纤维素(A)和 Klason木质素(B)含量
1: 未转基因烟草; 2-7: 转基因株系 T28、T2、T13、T15、T7和 T23
Figure 3 Content of holocellulose (A) and Klason lignin (B)
1: untransgenic tobacco; 2-7: transgenic plants T28, T2, T13, T15, T7 and T23
图 4 细胞壁的检测
(A) 转基因烟草 T28;
(B) 对照烟草(bar=2.5 mm)
Figure 4 Analysis of cell wall
(A) transgenic tobacco T28;
(B) untransgenic tobacco (bar=2.5 mm)
463梁海泳等: 反义 4CL与 UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析
关, 或许可以通过测量细胞壁厚度来筛选转基因植株。
2.6 茎秆颜色的检测
Kajita等(1997)研究发现, 转4CL反义基因烟草的茎秆
呈现红褐色, 并认为是由于木质素中含有过多的羟基肉
桂酸造成的。Tsai等(1998)认为调控木质素生物合成中
的任何一个酶, 只要影响到松柏醛含量, 即可引起木质素
的颜色改变。贾彩红等(2004)在4CL基因表达受抑制的
转基因毛白杨中发现, 转基因植株的木质素含量与茎秆
的颜色深浅呈负相关。本研究也有类似现象。剥掉树
皮后, 木质素降低的转基因烟草茎秆可见红褐色的条带,
而未转基因烟草茎秆为乳白色, 没有褐色条带(图5); 红
褐色条带的数量及颜色深浅与木质素降低的程度成正比,
木质素降低越多, 茎秆颜色越深且褐色条带数量越多, 木
质素降低越少, 茎秆颜色越浅且条带数量越少。
3 讨论
目前植物的遗传转化多数是转入单一的外源基因, 但由
于单基因表达强度不够或作用机制单一, 不能获得理想
的转基因植株, 即使获得转基因植株, 有些也难以直接应
用于农业生产(王新发等, 2005)。利用双价或多价基因
植物表达载体, 2个以上基因可同时整合在受体染色体遗
传位点上, 比较容易获得多个基因都能稳定遗传的转基
因植物, 可以提高表达效果。本研究将尿苷二磷酸葡萄
糖焦磷酸化酶基因和4-香豆酸: 辅酶A连接酶反义基因
构建在同一载体上, 并通过1次转化同时将2个基因导
入烟草基因组中, PCR检测双基因的共转化率较高, 而
且转基因烟草木质素含量降低的同时, 纤维素含量有所
增加。可见双价或多价基因表达载体可以在基因工程
方法改良木材及饲草的纤维品质上应用。
研究中我们还发现, 转基因烟草与未转基因烟草在
生长量、生长速度、茎秆粗细及生长期上多数无明显
差别, 但也发现个别矮小、细弱植株, 出现这一现象是
由于转基因引起, 还是由于环境因素引起?这有待进一
步探讨。
在Hu等(1998)与Li等(2003)的研究中, 抑制颤杨
4CL1基因的表达, 转基因植株木质素含量下降45%, 同
时纤维素含量增加15%, 总的生物量没有变化, 由此他
们推测木质素含量下降可能带来纤维素含量的补偿性增
加, 4CL可能为碳水化合物与木质素合成代谢的调控节
点。我国杨学萍等(2003)将反义4CL1基因转化进烟草
中, 结果转基因烟草木质素含量比对照降低了 19.1%,
纤维素含量比对照升高了11.4%, 其结果为上述观点提
供了有力证据。但我国贾彩红等(2004)却得出相反的结
论, 她们抑制毛白杨中4CL基因的表达, 转基因植株中
的木质素含量下降了41.37%的同时, 其综纤维素含量
未见明显变化, 由此她们推测, 4CL可能并不是碳水化合
物与木质素合成代谢的调控节点。Anterola和 Lewis
(2002)也认为, Hu等(1998)与Li等(2003)的研究中纤维
素含量的增加并非由于纤维素合成的绝对增加, 而是纤
维素在整个干物质中因木质素减少带来的相对增加。
本研究中 , 转双价基因烟草的木质素含量大幅降低
(32.9%-42.8%)的同时, 纤维素含量提高了 5%-7%,
纤维素含量的增加是由于导入UGPase基因的作用呢,
还是由于抑制了4CL基因的表达而使纤维素补偿性增加
呢？这也有待于进一步研究。
图 5 转基因与未转基因植株茎秆颜色比较
(A) 转基因烟草;
(B) 对照烟草
Figure 5 Comparison of stem color of transformed to untransf-
ormed plants
(A) transgenic plants;
(B) untransgenic plants
464 植物学通报 24(4) 2007
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(责任编辑: 孙冬花)
Vector Construction with UGPase and anti4CL, and Their Expression
in Transgenic Tobacco
Haiyong Liang, Xiuying Xia*, Xiaorong Gao, Qiao Su
School of Environmental and Biological Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116026, China
Abstract W e descr ibe our construction of a plant expression vector, which contained an UDP-glucose
pyrophosphorylase gene and an anti-sense 4-coumarate: CoA ligase gene. The vector was transferred by use of
Agrobacterium tumefaciens into tobacco. Results of PCR and Southern blot analysis indicated that both genes were integrated
into the tobacco genome successfully. Holocellulose content was increased and Klason lignin content significantly reduced, which
illustrated that the two genes were expressed effectively in the tobacco genome.
Key words cellulose, CoA ligase, 4-coumarate, lignin, UDP-glucose pyrophosphorylase, vector with two genes
Liang HY, Xia XY, Gao XR, Su Q (2007). Vector construction with UGPase and anti4CL, and their expression in transgenic tobacco.
Chin Bull Bot 24, 459-464.
* Author for correspondence. E-mail: xiaxiuying@yahoo.com.cn