全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 579-584, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-01-11; 接受日期: 2008-04-23
基金项目: 吉林省教育厅项目(No. 2006JY T08)
* 通讯作者。E-mail: chinese_hxx@yahoo.com.cn
.实验简报.
人参愈伤组织的 PSY基因遗传转化
何秀霞, 于源华 *, 张勇
长春理工大学生命科学技术学院, 长春 130022
摘要 将八氢番茄红素合成酶基因(PSY)重组于植物双元表达载体pBin438, 得到重组质粒pBin438-PSY。用冻融法将其导
入农杆菌EHA101中, 采用叶盘法转化人参愈伤组织, 对所获得的抗性细胞系进行PCR和Southern检测, 并对表达产物进行
了薄层层析(TLC)、光谱分析、高效液相色谱(HPLC)检测及含量测定。结果表明PSY基因已成功导入人参愈伤组织细胞基因
组, 并已得到高效表达, 表达产物b-胡萝卜素含量为143 mg.g-1人参细胞干重。本研究利用转基因方法在人参愈伤组织细胞中
成功地表达了八氢番茄红素合成酶基因, 为进一步提高人参的营养价值奠定了基础。
关键词 人参愈伤组织, 八氢番茄红素合成酶基因, 遗传转化
何秀霞 , 于源华 , 张勇 (2008). 人参愈伤组织的PSY基因遗传转化. 植物学通报 25, 579-584.
八氢番茄红素合成酶(PSY)是类胡萝卜素生物合成
途径中的关键酶, 其基因在 1987年由 Ray 等从番茄中
获得(Ray et al., 1987), 并于 1991年由 Bramley 等证
实(Bird et al. , 1991)。PSY 基因全长 3.2-6.0 kb, 其
cDNA长1.3-1.6 kb, 编码409-423个氨基酸(Yamano
et al., 1994)。PSY的酶促反应产物类胡萝卜素是一类
营养元素, 具有前维生素A 活性, 被人体摄取后可转变
为维生素A (Omenn et al., 1996), 能清除自由基, 具有
抗衰老、增强机体免疫力、防癌和抗癌功能(朱秀灵等,
2004), 可减少因缺乏维生素A 而引起的夜盲症、幼儿
弱视等一系列眼病。人体自身不能合成类胡萝卜素, 主
要依赖饮食供应(陶俊等, 2002)。已有将该基因成功转
化烟草、生菜、洋桔梗、大豆等植物的报道。目前
利用人参作为转基因植物受体的研究还不多见, 只有汪
春义等(2007) 将人胰岛素基因、任琦等(2006)将人干
扰素基因、刘丹等(2005)将乙肝表面抗原基因和赵寿
经等(2004)将诱导人参发根的 rolC基因成功转化到人参
中的报道。如果将 PSY 基因转化到人参植株中, 不仅
有很高的药用价值, 而且可以提高类胡萝卜素含量, 从而
使人参的营养价值得到提高。因此本研究为提高药用
植物的营养价值奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料　
激素自养型人参愈伤组织细胞株由长春生物制品研究所
提供, 培养在 67-V固体培养基上, 并在培养基中添加腐
殖酸钠母液。
1.1.2 质粒和菌株　
植物表达载体 pBin438、含有 PSY 基因的 pMD-PSY
质粒以及大肠杆菌 DH5a、农杆菌 EHA101由本实验
室保存。
1.1.3 主要试剂　
限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶和
尼龙膜等均购自鼎国生物工程公司。其它常规试剂均
为国产分析纯或化学纯产品。
1.1.4 PCR引物　
上游引物: 5-GA ATTCA TG TCTATTTGTA CG CT-
A TG G G TTG TT-3 ; 下游引物: 5 -G CG G CCG C-
580 植物学通报 25(5) 2008
TCATGTTTGGGGTATCATAAAAGA-3。
1.1.5 培养基组成
67-V 固体培养基(1 L): 组织培养用大量元素母液 100
mL; 微量元素母液 1 mL; 维生素母液 1 mL; 铁盐母液
2.5 mL; 肌醇母液 10 mL; 腐殖酸钠母液 0.5 mL; 补充
物母液 1 mL; 蔗糖 30 g; 乳清蛋白 1 g; 琼脂粉 8 g。
用于农杆菌EHA101重悬的AB培养基组成成分见任琦
等(2006)的文章。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体的构建　
按常规碱裂解法提取质粒 pBin438和 pMD-PSY, 分别
用BamHI和SalI双酶切, 回收目的基因PSY和pBin438
载体大片段, 用 T4 DNA 连接酶连接。连接产物转化大
肠杆菌DH5a感受态细胞, 将菌液均匀涂布于含50 mg.
L-1卡那霉素(Kan)的 LB 平板上, 37°C倒置培养过夜。
挑选 Kan抗性菌落培养, 提取质粒, PCR、酶切检测,
筛选阳性克隆。通过冻融法(王关林和方宏筠, 2002)将
重组质粒导入农杆菌 EHA101。
1.2.2　人参的遗传转化　
将含有重组质粒 pBin438-PSY的农杆菌 EHA101接种
于含 30 mg.L-1 Kan和 100 mg.L-1壮观霉素(Spec)的
YEB液体培养基中, 28°C、160 rpm振荡培养至OD600
值为 0.6-0.8, 收集菌体用等量的 AB培养基重悬, 加入
终浓度为 100 m mol.L-1 的乙酰丁香酮(AS), 28°C、
200 rpm培养4小时, 收集菌体用等量的67-V液体培养
基重悬, 加入终浓度为 100 mmol.L-1 的 AS, 28°C、
200 rpm培养 2小时。将人参愈伤组织接种于经过上述
处理的 67-V-AS农杆菌液体培养基中, 28°C、200 rpm
培养 2小时, 使细胞团分散于培养基中, 倒入无菌漏斗
中过滤。然后将细胞团转移到含 67-V 固体培养基的三
角瓶中, 暗培养2天。再将67-V-头孢霉素Cef(400 mg.
L-1)洗涤液倒入三角瓶至适量(以刚没过侵染过的人参愈
伤组织细胞为宜) , 20 分钟后, 倒入无菌漏斗中过滤。
将侵染过的人参愈伤组织细胞用无菌药勺转移到含 67-
V-Cef (400 mg.L-1)固体培养基的三角瓶中, 暗培养 1
周。之后再转移到 67-V-Cef(400 mg.L-1)-潮霉素 Hyg
(30 mg.L-1)筛选培养基上, 培养 2周后, 逐步降低Cef
和 Hyg浓度继代培养(邓馨和胡文玉, 2000)。
1.2.3 人参愈伤组织转化的检测　
按常规的CTAB法提取人参愈伤组织总DNA, 进行PCR
扩增和 Southern杂交检测。(1) PCR扩增反应条件为:
94°C 2分钟; 94°C 1分钟, 56°C 1分钟, 72°C 2分钟,
35个循环; 72°C 10分钟。(2) Southern杂交检测: 将
人参愈伤组织总 DNA的KpnI酶切产物电泳后转移到尼
龙膜上, 用随机引物法标记 PS Y c DNA 探针, 进行
Southern杂交检测。
1.2.4 转基因人参愈伤组织细胞中产物的提取
取一定量的转基因人参愈伤组织细胞, 在真空干燥箱内
60°C、0.505×105 Pa下烘干 24小时。称取 1 g干细
胞, 加入 12 mL 2 mol.L-1 HCl, 浸泡 40分钟。100°C
4分钟, 迅速置冰上冷却。12 000×g离心 10分钟, 弃
上清, 沉淀水洗后再次离心, 除去上清, 即得细胞碎片。
按 20 mL.g-1干细胞的比例加入适量丙酮浸提 30分钟
后, 将沉淀洗入锥形瓶中。加入 5 mL石油醚, 振摇 1
分钟, 静置 5分钟。将提取液转入盛有 100 mL 5% 硫
酸钠的分液漏斗中, 并用 10 mL丙酮 -石油醚(v:v=3:7)
混合物洗涤锥形瓶, 洗涤液转入分液漏斗中, 重复上述操
作 1-3次, 直到提取液无色。弃去下层水溶液, 再用 15
mL 5% 硫酸钠反复振摇洗涤, 直到下层水溶液清亮。
将提取液通过盛有 10 g无水硫酸钠(吸水)的小漏斗, 下
接球形瓶。用大约 4-5 mL的石油醚分数次洗净分液漏
斗和无水硫酸钠层内的色素。将提取液于真空干燥箱
内 60°C减压蒸发。当蒸发至大约 1 mL时, 取下锥形
瓶, 用氮气吹干, 立即加入 2 mL石油醚定容。-20°C
保存, 备层析用(朱秀灵等, 2004)。
1.2.5 转基因人参愈伤组织细胞总类胡萝卜素含量
的测定
将一定量的人参愈伤组织细胞烘干, 研细后准确称取
581何秀霞等: 人参愈伤组织的PSY基因遗传转化
100 mg, 加2 mL 2 mol.L-1HCl 浸泡40分钟后, 100°C
4分钟, 冰上冷却。12 000×g离心, 水洗沉淀后再离心,
于所得细胞碎片中加入 5 mL丙酮浸提 30分钟后, 离心
取上清, 以丙酮为空白对照, 测定 450 nm 下的吸光值。
细胞总类胡萝卜素质量分数(mg.mg-1)=(A×V)/(E×W), 其
中A为吸光度, V为萃取液体积数, E为消光系数(0.16),
W 为称取的人参愈伤组织细胞质量。
1.2.6 产物的薄层层析、光谱分析及 HPLC测定
取一块硅胶板 105°C活化 0.5-1小时。用定量毛细管
将样品点在玻璃板另一端, 在密闭层析缸中用丙酮:石油
醚体积分数为 2:8的展开剂在室温下避光展开。当展开
达到适当高度, 用刀片刮下目标色素带, 溶于 5 mL丙
酮溶液, 并在 350-600 nm 条件下进行光谱特征分析。
设置的光谱扫描条件为Measuring mode: Abs; Scan
speed: Fast ; Slit width: 1.0 nm; Sampling interval:
0.2秒。采用 HPLC法分离测定溶于丙酮溶液中的 b-胡
萝卜素含量。色谱条件: D3.9 mm×150 mm P230型
不锈钢色谱柱(载体颗粒直径为 5 mm); 流动相为V 乙腈:
V三氯甲烷:V 叔丁醇＝ 83:15:2; 洗脱程序为 0-2分钟, 0.8
mL.min-1, 2分钟后为 1 mL.min-1; 检测波长 450 nm;
进样量 10 mL; 柱温 25°C; 通过保留时间定性, 峰面积
定量。重复取样 3 次, 每个样品重复测定 3 次。
2 结果与分析
2.1 人参愈伤组织转化及检测
从 pMD-PSY中切下目的基因PSY克隆于pBin438, 获
得重组质粒 pBin438-PSY。经 PCR扩增、BamHI和
SalI双酶切检测, 获得了与预期大小(1 300 bp)一致的
产物(图 1A), 表明植物表达载体构建正确。
将 pBin438-PSY通过冻融法导入农杆菌 EHA101
中, 利用农杆菌侵染法侵染人参愈伤组织细胞。经抗生
素筛选后, 挑选具有明显颜色特征(深黄色)的人参愈伤组
织, 提取细胞总DNA 并进行 PCR检测。4个样品均获
得了与预期大小相一致的DNA片段, 初步证明目的基因
已整合到人参愈伤组织细胞的基因组中(图 1B )。以非
转基因人参愈伤组织细胞DNA为阴性对照, 对4个PCR
阳性样品进行 Southern杂交检测。结果显示 4个样品
均为杂交阳性(图 1C), 进一步证明八氢番茄红素合成酶
基因已整合到人参愈伤组织细胞基因组中。
2.2 人参愈伤组织细胞中总类胡萝卜素的薄层
层析分离及b-胡萝卜素光谱分析
利用吸光光度法测得转基因人参愈伤组织中的总类胡萝
图 1 人参愈伤组织细胞的转化与鉴定
(A) 植物表达载体pBin438-PSY的鉴定 M: lDNA/EcoRI+Hi ndIII;
1: pBin438-PSY的PCR鉴定; 2: pBin438-PSY的BamHI/SalI酶
切鉴定; (B) 人参愈伤组织细胞转化的 PCR检测 M: lDNA /
EcoRI+Hi ndIII; 1: 质粒 pBin438-PSY阳性对照; 2: 未转化株负对
照; 3-6: 转化株; (C) 人参愈伤组织细胞转化的Southern检测 1:
未转化株; 2-5: 转化株
Figur e 1 A nalysis of transgenic ginseng callus cells
(A) A nalys is of plant expre ss ion vec tor pBin438-PSY
M: lDNA /EcoRI+Hi ndIII; 1: PCR result of pBin438-PSY ; 2:
pBin438-PSY /BamHI+SalI; (B) PCR analys is of transgenic gin-
seng callus cells M: lDNA/EcoRI+HindIII; 1: pBin438-PSY
plasmid as positive control; 2: Non-transgenic callus; 3-6:
Transgenic callus; (C) Southern blot analysis of transgenic
ginseng callus cells 1: Non- transgenic callus; 2-5: Transgenic
callus
582 植物学通报 25(5) 2008
卜素含量为 486 mg.g-1(干细胞)。进一步采用薄层层析
法(thin-layer chromatography, TLC)分离总类胡萝卜素,
结果表明, 转基因人参愈伤组织细胞中含有 3种类胡萝
卜素产物, 其中最上端为 b-胡萝卜素(图2A, 带3), 由于
b-胡萝卜素在分离过程中有边缘效应, 带 2与带 3相距
很近, 难以分离, 推测是二者结构式十分接近, 所以不易
分离。带 1颜色较浅, 与带 2和带 3距离较远(图 2A)。
用刀片刮下带3, 进行光谱特征分析, 结果表明b-胡萝卜
素的紫外光谱最大吸收峰在 474 nm 处(图 2B), 因此以
该波长作为进行高效液相色谱分析(high-performance
liquid chromatography, HPLC)的检测波长。
2.3 转基因人参愈伤组织细胞中b -胡萝卜素含
量的HPLC测定
以标准b-胡萝卜素样品配制浓度为500 mg.mL-1的标准
液, 对转基因及非转基因人参愈伤组织样品中的b-胡萝
卜素含量进行 HPLC测定。做标准色谱图、样品及对
照样品色谱图(图3A), 结果表明转基因人参愈伤组织样
品中的 b - 胡萝卜素峰值低于标准峰值, 但明显高于非
转基因对照的峰值, 说明目的基因在转基因人参愈伤组
图 2 转基因人参愈伤组织细胞中类胡萝卜素产物分析
(A) 薄层层析结果 1, 2: 未知产物; 3: b-胡萝卜素;
(B) b -胡萝卜素的光谱特征图(1、2和 3为 3个吸收峰)
Figur e 2 Analysis of carotene produc ts of transgenic gin-
seng callus cells
(A) Result of TLC 1, 2: Unknow n produc ts; 3: b-carotene;
(B) Char t of spectral characterist ics of b-carotene (1, 2 and 3
are three absorption peaks)
织中得到了高效表达。由标准品曲线得回归方程:
y=23 063x–124 990r2 =0.989 4。根据上述公式可以
得出转基因人参愈伤组织细胞中 b-胡萝卜素的平均含量
为143 mg.g-1(干细胞), 而在非转基因人参愈伤组织细胞
中则未检测出 b-胡萝卜素(图 3B )。
3 讨论
本研究中所用的八氢番茄红素合成酶基因(PSY)是本实
验室根据已报道的番茄中 PSY 基因序列从番茄中克隆
图 3 转基因人参愈伤组织细胞中 b-胡萝卜素含量分析
(A) HPLC检测结果 1: 标准 b-胡萝卜素样品(500 mg.mL-1); 2:
非转基因人参对照样品; 3: 转基因人参样品;
(B) 转基因(1)和非转基因(2)人参愈伤组织中的b - 胡萝卜素含量
Figur e 3 Quantitative analys is of b-carotene of transgenic
ginseng callus cells
(A) HPLC prof iles 1: Standard b-carotene(500 mg.mL-1); 2:
Non-transgenic ginseng; 3: Transgenic ginseng;
(B) A nalysis of b-carotene content in transgenic (1) and non-
transgenic (2) ginseng callus cells
583何秀霞等: 人参愈伤组织的PSY基因遗传转化
并保存的。将该基因重组到植物表达载体 pBin438的
强组成型启动子 DE35S 及 W 增强子下游, 以增强其表
达。所用 pBin438载体经改造后将其原来的卡那霉素
抗性筛选基因替换为潮霉素抗性筛选基因。在对转基
因人参愈伤组织进行初步PCR检测时, 虽然经过潮霉素
的严格筛选, 但仍有转化体逃避选择压力产生假阳性, 而
因为 PSY 基因的表达会使相应的愈伤组织表现出黄色
特征, 故而挑选具有黄色特征的转化体进一步筛选可以
提高 P CR 的阳性率。
进行类胡萝卜素提取时, 由于光照、空气中的氧气
和紫外光对类胡萝卜素的稳定性影响很大(孙明奇等,
2007), 因此应在避光条件下进行, 特别是在层析时, 一
定要在黑暗条件下进行。另外, 人参愈伤组织细胞本身
细胞壁很厚, 本研究中所采用的朱秀灵等(2004)的酸热
法效果更好。类胡萝卜素的分离主要依据它们的不同
化学结构, 可以根据其在有机溶剂中溶解度的差别, 通
过薄板层析分离并用 R f 值比较类胡萝卜素的组成成
分。我们提取了转基因人参愈伤组织细胞中的表达产
物并进行 TLC和 HPLC检测。结果表明, 目的基因 PSY
在人参愈伤组织中已得到高效表达, 其含量为143 mg.g-1
(干细胞)。在人参细胞中表达一定量的维生素 A 前体可
以间接提高人参中维生素A的含量, 从而将维生素A的治
疗作用与人参的药用价值相结合, 期望能在抗病毒、抗
肿瘤和免疫调节等方面发挥协同作用(Lin et al., 2004)。
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Co lle ge of L ife Scien ce, Ch angchun Un ive rsi ty of Scie nce an d Tech nolo gy, Ch ang chu n 1 3002 2, Chi na
Abs tract A plant express ion vector cons isting of PSY gene w as construc ted and transf ormed into ginseng callus v ia Agrobac terium
tumefac iens-mediated trans formation. PCR and Southern blotting revealed the successful transformation and express ion of PSY
in the ginseng callus cells . Analys is w ith thin-layer chromatography (TLC) , spectral characterization, as w ell as high-performance
liquid chromatography (HPLC) show ed that the amount of b-carotene production w as 143 mg.g-1 (dried ginseng callus cells) . This
provides a good model for improving nutr ition in plants by genetic engineering.
Ke y words gin sen g cal lus, PSY, tra nsform ati on
He XX, Yu YH, Zha ng Y (200 8). Gen eti c t ran sfo rmat ion of PSY g ene in gi nse ng. Ch in Bull Bo t 25 , 57 9-58 4.
(责任编辑: 刘慧君)
* Author for correspondence. E-mail: chinese_hxx@yahoo.com.cn
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