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Overexpression of ChPSY Gene from Cerasus humilis Improved Carotenoids Synthesis in Transgenic Tomato

超量表达欧李ChPSY基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究



全 文 :园 艺 学 报 2014,41(8):1563–1572 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期:2014–04–16;修回日期:2014–07–18
基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金项目(20101403120006);山西省自然科学基金项目(2012011032-4);山西省人力资源和
社会保障厅优秀人才专项补助资金项目(2011-5);山西省科技重大专项(20121101010);山西省现代农业产业技术体系水果产业体系研究
示范项目(2014-04)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:djj738@163.com)
超量表达欧李 ChPSY 基因促进转基因番茄类胡
萝卜素合成的研究
张建成 1,王鹏飞 1,郝燕燕 1,杨淑一 1,郑 斌 1,牛自勉 2,杜俊杰 1,*
(1 山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;2 山西省农业科学院现代农业研究中心,太原 030031)
摘 要:将从欧李果实中分离的 ChPSY cDNA 经过序列分析、酶切之后,连接到植物表达载体 PMV,
构建了植物重组载体 pBI-ChPSY,并通过根瘤农杆菌 EHA105 介导转化番茄,获得了 12 株抗性植株。PCR
检测和 Southern 杂交结果显示,12 株抗性植株均为阳性,说明外源基因 ChPSY 整合到转化植株的基因组
中。RT-PCR 分析表明,ChPSY 基因在转化植株果实中得到表达。HPLC 分析表明,转 ChPSY 基因番茄果
实中总类胡萝卜素含量增加了 1.62 ~ 3.04 倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和 α–胡萝卜素含
量分别增加了 4.87、2.10、2.59 和 3.25 倍。转化植株中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影
响。ChPSY 基因超量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。
关键词:欧李;番茄;八氢番茄红素合成酶基因;遗传转化;类胡萝卜素
中图分类号:S 662.5 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2014)08-1563-10

Overexpression of ChPSY Gene from Cerasus humilis Improved
Carotenoids Synthesis in Transgenic Tomato
ZHANG Jian-cheng1,WANG Peng-fei1,HAO Yan-yan1,YANG Shu-yi1,ZHENG Bin1,NIU Zi-mian2,
and DU Jun-jie1,*
(1College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu,Shanxi 030801,China;2Research Centre of Modern
Agriculture,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030031,China)
Abstract:The ChPSY cDNA from the Cerasus humilis fruit was analyzed,digested and inserted into
plant expression vector PMV,resulting in the plant recombinant vector pBI-ChPSY,which was introduced
into tomato via Agrobacterium-mediated transformation. Twelve putatively independent transgenic plants
were generated. PCR and Southern blot analysis showed 8 out of these putative transgenic lines were
positive,which revealed that ChPSY gene was integrated into the transgenic lines genome. RT-PCR
analysis indicated that ChPSY gene was expressed in the fruits of these transgenic lines. HPLC analysis
showed that the total amount of carotenoids in the fruit of transgenic tomato was 1.62 to 3.04-fold higher
than the non-transformed controls,at the same time,phytoene,lycopene,β-carotene and α-carotene levels
were also increased by 4.87,2.10,2.59 and 3.25 folds,respectively. In addition,the expression of

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endogenous genes involved in carotenoid synthesis was affected in the transgenic lines. These results
suggested that overexpression of ChPSY significantly enhanced the carotenoids biosynthesis and
accumulation in transgenic tomato fruits.
Key words:Cerasus humilis;tomato;phytoene synthease gene;genetic transformation;carotenoids

欧李[Cerasus humilis(Bge)Sok]为蔷薇科樱桃属植物,是中国特有的一种果树资源(刘孟军,
1998)。欧李果实色泽鲜艳,风味独特,营养丰富,尤其是果实富含花色苷、黄酮醇和类胡萝卜素等
多种色素物质,具有很高的开发利用和研究价值(常虹 等,2011)。类胡萝卜素具有抗氧化、降血
脂、抑肿瘤和防衰老等多种医疗保健功效(Fraser & Bramley,2004)。作者前期的研究发现,欧李
果实中含有八氢番茄红素、六氢番茄红素、α–胡萝卜素、β–胡萝卜素、β–隐黄质、玉米黄质、
叶黄素和紫黄质等多种类胡萝卜素,其中 β–胡萝卜素和 β–隐黄质含量最为丰富。因此,有必要
借鉴番茄、柑橘等果实的相关研究来探索欧李果实类胡萝卜素合成的分子机理。
八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是类胡萝卜素生物合成途径中的一个限速酶,
其编码基因已成为植物类胡萝卜素基因工程的首选目的基因(朱长甫 等,2004)。目前已从番茄(Ray
et al.,1992)、烟草(Busch et al.,2002)、柑橘(Ikoma et al.,2001)、向日葵(Salvini et al.,2005)、
玉米(Wong et al.,2004)、甜瓜(Karvouni et al.,1995)等多种植物中克隆到编码 PSY 的完整基
因或部分片段。在转基因番茄中,番茄 PSY cDNA 组成型超量表达,使类胡萝卜素合成增强,在种
皮、子叶和胚轴等部位积累了较多的类胡萝卜素(Fray et al.,1995)。在转基因烟草中,过量表达
烟草 PSY cDNA 促进叶片中八氢番茄红素的积累(Busch et al.,2002)。在转基因拟南芥中,PSY 过
量表达显著增加了种子中 β–胡萝卜素的含量(Lindgren et al.,2003)。在第二代“黄金水稻”中,
玉米 PSY 基因的过量表达使其胚乳中 β–胡萝卜素含量达到 37 µg · g-1 DW,较第一代“黄金水稻”
增加了 23 倍(Ye et al.,2000;Paine et al.,2005)。在转基因山金柑中,过量表达红肉脐橙 PSY 促
进果实中八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和 β–隐黄质合成和积累(Zhang et al.,2009)。
此外,也有人将细菌 crtB 基因导入番茄(Fraser et al.,2002)、油菜(Shewmaker et al.,1999)、马
铃薯(Ducreux et al.,2005)、亚麻(Fujisawa et al.,2008)、玉米(Zhu et al.,2008)等多种作物,
获得的转基因植株的果实、块茎、籽粒等器官或组织中的类胡萝卜素含量均显著增加。
作者前期已克隆欧李果实 PSY cDNA 全长序列,并利用工程大肠杆菌体系对其功能进行了鉴定
(张建成 等,2011)。本研究中进一步通过根瘤农杆菌介导法,在 CaMV 35S 驱动下将欧李 ChPSY
导入番茄进行超量表达,利用转基因番茄体系对其功能进行分析,为进一步研究该酶蛋白特性及其
在欧李等木本果树果实色泽遗传改良中的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与质粒
试验于 2012—2013 年在山西农业大学园艺学院果树学重点学科分子生物学实验室进行。番茄
‘中蔬 5 号’(Solanum lycopersicum‘Zhongshu 5’)购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所;欧李 ChPSY
cDNA 由本实验室克隆并保存在 pMD18-T 载体质粒中;植物表达载体 PMV(即将质粒载体 pBI121
的 GUS 片段缺失,引入含有 5′-XbaⅠ-XhoⅠ-SalⅠ······BamHⅠ-SacⅠ-3′多克隆酶切位点的片段)由
华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组馈赠;大肠杆菌 DH5α、根瘤农杆菌 EHA105、
克隆载体 pMD18-T 为本实验室保存。
8 期 张建成等:超量表达欧李 ChPSY 基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 1565

1.2 ChPSY 植物表达载体的构建
根据已克隆欧李 ChPSY cDNA 序列和 PMV 植物表达载体的酶切克隆位点设计引物,即 PSY-L:
5′-CCGCTCGAGATGTCAGGTGTTCTTCTTTG-3′(下划线为 XhoⅠ酶切位点)和 PSY-R:5′-CGC
GGATCCTCATCTTGACACCAACTGCT-3′(下划线为 BamHⅠ酶切位点),扩增欧李 ChPSY cDNA
的完整编码区序列。将 PCR 产物经电泳检测回收,然后用 XhoⅠ和 BamHⅠ酶切,回收酶切片段与
经同样酶切的 PMV 质粒载体连接,构建植物表达载体 pBI-ChPSY。PCR、酶切和测序鉴定后,电击
法导入根瘤农杆菌 EHA105 中。
1.3 ChPSY 对番茄的遗传转化
番茄遗传转化和植株再生参考叶志彪等(1994)的方法并略有修改,即将 8 ~ 10 d 无菌苗的子
叶去叶尖和基端,正面朝下置于 MSⅠ培养基(MS + 20 mg · L-1 肌醇 + 0.65 mg · L-1 硫胺素 + 0.2
mg · L-1 2,4-D + 100 mg · L-1 KH2PO4 + 0.1 mg · L-1 KT)上,28 ℃暗培养 2 d。之后,将预培养的子
叶外植体置于用 MS 液体培养基稀释的农杆菌悬浮液中浸染 10 min,无菌滤纸吸去外植体表面多余
的菌液,重新置于 MSⅠ培养基上共培养 2 ~ 3 d。转移至筛选培养基 MSⅡ(MS + 2 mg · L-1 ZT + 0.5
mg · L-1 IAA + 100 mg · L-1 Km + 200 mg · L-1 Cef)上筛选分化芽。当转化的抗性芽苗长至约 1.5 ~ 2.0
cm 时,将芽切下置于 MS Ⅲ培养基(1/2MS + 0.5 mg · L-1 IAA + 50 mg · L-1 Km + 100 mg · L-1 Cef)
中诱导生根。4 ~ 5 周后将再生的转化小植株直接移入装有草炭和蛭石的营养钵中,遮荫保湿炼苗
3 ~ 5 d,放置于温室自然光照下生长。
1.4 PCR、Southern 杂交和 RT-PCR 分析
番茄叶片 DNA 提取采用 CTAB 法(Cheng et al.,2003),以提取的番茄 DNA 为模板,用 NPTⅡ
基因和 ChPSY 基因的特异引物进行 PCR 分析,同时设质粒和未转化番茄作为对照。NPTⅡ基因引
物为 NPTⅡ-L:5′-GCTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3′和 NPTⅡ-R:5′-GCGATACCGTAAAGCA
CGAGGAA-3′,ChPSY 基因引物为 ChPSY-L:5′-ATGTCAGGTGTTCTTCTTTG-3′和 ChPSY-R:
5′-TCATCTTGACACCAACTGCT-3′。PCR 反应程序为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 1 min,58 ℃
退火 1 min,72 ℃延伸 1.5 min,35 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。
Southern 杂交以 NPTⅡ基因(498 bp)片段作为探针,EcoRⅠ完全酶切 40 µg 番茄基因组总 DNA,
按照 Roche 公司 DIG High Prime DNA Labelling and Detection Starter KitⅡ说明书进行。
此外,提取完熟期转基因番茄果实 RNA(Liu et al.,2006),利用 RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit(MBI 公司)合成 cDNA 第一链,RT-PCR 分析转基因植株中 ChPSY 基因的表达,其
中 ChPSY 基因的扩增引物为 5′-ACTGGGGTTTTAGCTTACTC-3′和 5′-CTCCTGGCATCTTCTCC
AAC-3′,内参基因 Ef-1α 的引物为 5′-ATGTTGGGTTCAATGTTAAG-3′和 5′-ATCACACTGCACAGTT
CAC-3′,PCR 扩增条件为 94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 45 s,58 ℃退火 1 min,72 ℃延伸 1 min,
28 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。
1.5 ChPSY 转基因番茄果实类胡萝卜素含量及合成基因表达分析
称取完熟期转基因番茄果实样品 0.2 g,每个样品重复 3 次。类胡萝卜素的提取和 HPLC 分析参
考刘庆(2008)的方法。类胡萝卜素标样八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素、α–胡萝卜素和
叶黄素购自 Sigma 公司。
利用 SYBR® GREEN PCR Master Mix(ABI 公司)对转基因番茄果实类胡萝卜素合成基因的表
达进行定量分析,选用 Ef-1α 基因为内参基因。用 Primer Express® Software v2.0(ABI 公司)设计引
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物(表 1),具体参考张建成等(2010)的方法进行。类胡萝卜素含量的数据采用 EXCEL 2003 和
DPS 软件进行分析。

表 1 定量 PCR 分析转基因番茄果实内源类胡萝卜素合成基因表达引物
Table 1 List of primers used in quantitative RT-PCR analysis of the expression of endogenous
carotenoid biosynthetic genes in transgenic tomato fruits
基因 Gene 引物 Primer name 引物序列 Sequence 扩增大小/bp Size
PSY1 PSY1-F ATCTTTGGTCTTGTACCGCAAA 149
PSY1-R GGCAGTTTTTGTAGGAGGCACA
PDS PDS-F AAGGCGCTGTCTTATCAGGAAA 106
PDS-R TAAACTACGCTTGCTTCCGACA
ZDS ZDS-F ACCGTACAACTACGCTACAATGG 109
ZDS-R CATCTGGCGTATAGAGGAGATTG
CRTISO CRTISO-F CCCAGGGCTTAAGTCATCTATTC 93
CRTISO-R GGTCCATAGGTACCACTATCACG
LCYb LCYb-F GAGTTCTTCTGCTTCGGTATGGA 110
LCYb-R AAGAAGCCATGCCAATAACGAG
LCYe LCYe-F GCAGGGATTTCTTGGTTCAAGT 101
LCYe-R TGATCAAGCCTTTTCTCATGTCA
BCH BCH-F GCTACATTCACTCTCTCGTTTGG 130
BCH-R AAGGTCCTTCTCTTGGTCTATGG
ZEP ZEP-F CCTTGTAGGAGCTTGGAAAATG 109
ZEP-R CCCCAGAGTCAGTCTTCTCTGTA
Ef-1α Ef-1α-F AGATGGTCAGACCCGTGAAC 104
Ef-1α-R TGGAGTACTTGGGGGTGGTA
2 结果与分析
2.1 pBI-ChPSY 植物表达载体的构建
以欧李 ChPSY cDNA 克隆为模板,采用 PSY-L 和 PSY-R 进行 PCR 扩增获得 ChPSY 基因长约
1.2 kb 的完整编码序列片段。然后用 XhoⅠ和 BamHⅠ双酶切 PCR 产物,并将酶切片段定向连接到
经 XhoⅠ和 BamHⅠ双酶切 PMV(改良 pBI121)载体,构建植物表达载体 pBI-ChPSY(图 1 和图 2)。
图 1 pBI-ChPSY PCR 扩增与酶切鉴定
M:DNA ladder;1:pBI-ChPSY PCR 扩增产物;2:pBI-ChPSY 酶切产物;3:PMV 酶切产物。
Fig. 1 Identification of pBI-ChPSY by PCR amplification and enzymatic digestion
M:DNA ladder;1:PCR amplified product from pBI-ChPSY;2:pBI-ChPSY digested with XhoⅠ/BamHⅠ;
3:PMV digested with XhoⅠ/BamHⅠ.

8 期 张建成等:超量表达欧李 ChPSY 基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 1567

图 2 植物表达载体 pBI-ChPSY 结构
Fig. 2 Schematic diagram of the plant expression vector pBI-ChPSY

2.2 转 ChPSY 基因番茄抗性植株的获得
番茄子叶外植体经农杆菌 EHA105 侵染后,共培养 2 d,转移至筛选培养基 MSⅡ进行选择性诱
导芽分化。大约经过 3 ~ 4 周培养后,大多数子叶在继代培养中颜色变暗、萎蔫并死亡,少数子叶
的基部逐渐长出少量致密的愈伤组织并逐步分化出小芽点,小芽点逐渐分化长出幼叶而形成小芽苗
(图 3,A)。将经过卡那霉素(Km)抗性筛选获得的 12 株小芽苗诱导生根后转入营养钵,炼苗 5
d,最后移栽到温室(图 3,B ~ D),这些抗性植株在温室生长发育良好,与未转基因对照相比没
有明显的形态学差异,均可正常生长、开花和结果(图 3,D ~ F)。

图 3 番茄子叶的转化、再生及抗性植株的开花结果
A:抗性芽再生;B:抗性芽诱导生根;C:营养钵中炼苗;D:移栽苗转入花盆中培养;
E:抗性苗开花;F:抗性苗结果。
Fig. 3 The transformation,regeneration processes of tomato cotyledon and fruit setting of transgenic plant
A:Regeneration of resistant shoot;B:Root induction from resistant shoots;C:Seedling hardening of transgenic plant in nutrition pot;
D:Transplanting of transgenic plants to the garden pot;E:Florescence of transgenic plant;
F:Fruit setting of transgenic plant.
2.3 转 ChPSY 基因番茄抗性植株的 PCR 和 Southern 检测
利用抗性基因 NPTⅡ(498 bp)引物和外源基因 ChPSY(1 194 bp)引物对 ChPSY 转基因番茄
抗性植株进行 PCR 检测,结果表明 12 个抗性植株经两对特异性引物均可扩增出和质粒阳性对照相
同大小的产物,而未转化植株中则无特异性扩增产物(图 4),初步表明 ChPSY 基因已转入番茄基
因组中,获得了转基因植株。

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图 4 ChPSY 转基因番茄抗性植株的 PCR 检测
M:DNA ladder;P:质粒 DNA;CK:未转基因对照;1 ~ 12:转基因植株。
Fig. 4 PCR analysis of resistant plants of tomato transformed with ChPSY gene
M:DNA ladder;P:Plasmid DNA;CK:Non-transgenic control;
1–12:Transgenic plants.


提取部分 PCR 阳性转化植株和对照未转化植株的 DNA,用 EcoRⅠ进行酶切,以 NPTⅡ基因
PCR 扩增产物为探针进行 Southern 杂交,结果表明外源基因已转入并整合到番茄基因组中,且多数
为 1 或 2 个拷贝数插入(图 5)。



图 5 ChPSY 转基因番茄抗性植株的 Southern blotting 检测
M:λ/Hind Ⅲ ladder;CK:未转基因对照;1、2、4、5、7、8、10、12:转基因植株。
Fig. 5 Southern blotting analysis of resistant plants of tomato transformed with ChPSY gene
M:λ/Hind ladderⅢ ;CK:Non-transgenic control;1,2,4,5,7,8,10,12:Transgenic plants.


2.4 转 ChPSY 基因番茄抗性植株的 RT-PCR 分析
提取了 10 个转基因抗性植株的总 RNA 反转录之后,用 cDNA 为模板进行 RT-PCR 扩增,结果
在转基因抗性植株 1、2、4 ~ 8、10 ~ 12 中均检测到了 ChPSY 基因,而未转化对照中未扩增出条带,
表明 ChPSY 基因在转基因株系 1、2、4 ~ 8、10 ~ 12 中得到表达,且不同株系之间 ChPSY 基因表达
量存在差异(图 6)。

8 期 张建成等:超量表达欧李 ChPSY 基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 1569

图 6 ChPSY 转基因番茄抗性植株 RT-PCR 分析
CK:未转基因对照;1、2、4 ~ 8,10 ~ 12:转基因植株。
Fig. 6 RT-PCR analysis of resistant plants of tomato transformed with ChPSY gene
CK:Non-transgenic control;1,2,4–8,10–12:Transgenic plants.

2.5 转 ChPSY 基因番茄果实类胡萝卜素含量的变化
利用 HPLC 分析部分转基因番茄株系(1、2、4、5、10 和 12 号株系)果实的类胡萝卜素含量
(表 2)。ChPSY 转基因番茄果实中类胡萝卜素含量显著增加,达到 925.93 ~ 1 741.36 µg · g-1DW,
为未转基因对照的 1.62 ~ 3.04 倍。
与对照相比,ChPSY 转基因番茄果实中八氢番茄红素含量增加最为显著,达到 76.40 ~ 186.42
µg · g-1DW,平均增加 4.87 倍。番茄红素、β–胡萝卜素和 α–胡萝卜素含量也有显著增加,分别为
602.38 ~ 1 178.06 µg · g-1DW,232.84 ~ 498.26 µg · g-1DW 和 2.55 ~ 6.15 µg · g-1DW,分别比对照增加
2.10、2.59 和 3.25 倍。
此外,除转基因株系 2 和 12 外,大部分转基因番茄株系果实中叶黄素含量没有明显差异。

表 2 ChPSY 转基因番茄果实中类胡萝卜素的含量
Table 2 Carotenoid content in fruits of tomato transformed with ChPSY gene µg · g-1DW
株系
Lines
八氢番茄红素
Phy
番茄红素
Lyc
β–胡萝卜素
β-Car
α–胡萝卜素
α-Car
叶黄素
Lut
类胡萝卜素总量
Total
对照 Control 25.36 ± 0.65 d 419.28 ± 16.38 e 125.34 ± 1.54 d 1.28 ± 0.10 e 1.61 ± 0.66 c 572.87 e
1 128.12 ± 6.14 b 1 000.22 ± 46.32 b 498.26 ± 8.48 a 5.58 ± 0.28 a 4.48 ± 0.63 c 1 636.66 b
2 186.42 ± 22.38 a 1 178.06 ± 88.24 a 358.18 ± 20.38 b 6.15 ± 0.42 a 12.55 ± 1.82 a 1 741.36 a
4 116.24 ± 3.24 b 716.68 ± 16.28 c 248.36 ± 3.96 c 3.05 ± 0.16 c 2.98 ± 0.24 c 1 087.31 c
5 128.62 ± 7.78 b 1 004.54 ± 33.42 b 370.62 ± 5.54 b 3.14 ± 0.04 c 1.76 ± 0.12 c 1 508.68 b
10 76.40 ± 2.64 c 602.38 ± 12.12 d 240.64 ± 5.58 c 2.55 ± 0.12 d 3.96 ± 0.22 c 925.93 d
12 105.28 ± 4.42 b 786.26 ± 20.64 c 232.84 ± 7.28 c 4.46 ± 0.12 b 9.15 ± 0.52 b 1 137.99 c
注:同列数值不同字母表示差异达 5%显著水平。
Note:Different letters within the same column indicate significant differences at 5% level.

2.6 转 ChPSY 基因番茄果实类胡萝卜素合成基因的表达
利用 real-time RT-PCR 分析表明,超量表达 ChPSY 基因对转基因番茄(株系 1、2、4、5、10
和 12)果实类胡萝卜素合成内源基因的表达有显著影响(图 7)。转基因番茄果实中,PSY1、PDS、
ZDS、CRTISO 等类胡萝卜素合成上游基因的表达呈明显上调,其中 PSY1 基因的表达上调最为明显,
其表达量为未转基因对照的 1.8 ~ 4.8 倍,PDS、ZDS、CRTISO 的表达量分别为非转基因对照的 1.6 ~
3.8 倍、1.4 ~ 3.6 倍和 1.6 ~ 3.4 倍;LCYb 和 LCYe 基因的表达也呈明显上调趋势,较对照其表达量
分别增加了 2.0 ~ 3.4 倍和 1.2 ~ 1.8 倍;BCH 和 ZEP 基因的表达则变化不明显。


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图 7 ChPSY 转基因番茄果实内源类胡萝卜素合成基因的表达
表达水平由 Ef-1α 基因均一化,未转基因对照的表达量设为 1。图示数字代表各株系。PSY1:八氢番茄红素合成酶基因;
PDS:八氢番茄红素脱氢酶基因;ZDS:ζ–胡萝卜素脱氢酶基因;CRTISO:类胡萝卜素异构酶基因;
LCYb:番茄红素 β–环化酶基因;LCYe:番茄红素 ε–环化酶基因;
BCH:β–胡萝卜素羟化酶基因;ZEP:玉米黄质环氧酶基因。
Fig. 7 Quantitative RT-PCR analysis of the expression of endogenous carotenoid biosynthetic genes in transgenic tomato fruits
The levels of expression were normalized to Ef-1α relative to the non-transformed tomatoes which was set to 1.
Numbers within the legend indicate different lines. PSY1:Phytoene synthase gene;PDS:Phytoene desaturase gene;
ZDS:ζ-carotene desaturase gene;CRTISO:Carotenoid isomerase gene;LCYb:Lycopene β-cyclase gene;
LCYe:Lycopene ε-cyclase gene;BCH:β-carotenoid hydroxylase gene;ZEP:Zeaxanthin epoxidase gene.
3 讨论
高等植物中,类胡萝卜素是在质体中通过类异戊二烯途径合成。通过对参与类胡萝卜素生物合
成基因的遗传操作可改良植物品质,尤其是通过转基因技术获得的“黄金水稻”(Ye et al.,2000)
和“金色油菜”(Shewmaker et al.,1999)极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素代谢调控的信心
(Botella-Pavía & Rodríguez-Concepión,2006;Giuliano et al.,2008)。本研究中将 ChPSY 基因在
CaMV35S 启动子驱动下导入番茄,转基因番茄果实中类胡萝卜素含量较未转基因对照有较大增加,
其中转基因果实中八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和 α–胡萝卜素分别增加 4.87、2.10、2.59
和 3.25 倍。可见,欧李 ChPSY 超量表达可形成一个具有催化活性的功能酶,有效促进了番茄果实
中类胡萝卜素的合成和积累;同时,也为进一步利用欧李 ChPSY 创制高类胡萝卜素含量新种质资源
以及开展类胡萝卜素品质育种奠定了基础。
植物类胡萝卜素生物合成主要受一系列酶或基因调控(Cunningham & Gantt,1998)。某一种
类胡萝卜素合成酶催化活性的改变或代谢中间物含量的变化会影响其它类胡萝卜素合成内源基因的
表达(Fraser et al.,2002;Romer et al.,2002)。细菌八氢番茄红素脱氢酶基因 crtⅠ在番茄中过量
表达,番茄果实中 β–胡萝卜素含量增加了 3 倍(Romer et al.,2000),这是由于转基因番茄果实
中 PDS、ZDS 和 LCYb 基因被诱导表达的结果。“黄金水稻Ⅰ”和“黄金水稻Ⅱ”胚乳中积累了丰
富的 β–胡萝卜素也是由于胚乳中类胡萝卜素合成内源基因 PDS、ZDS、CRTISO 和 LCYb 等被诱导
协同表达的结果(Ye et al.,2000;Paine et al.,2005)。本研究中超量表达 ChPSY 基因有效克服了
GGPP 生成八氢番茄红素这一代谢途径的“瓶颈”,伴随着转基因番茄果实中八氢番茄红素、番茄
红素、β–胡萝卜素和 α–胡萝卜素含量的增加,转基因番茄果实中类胡萝卜素合成内源基因的表达
也发生了变化,如 PSY1、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb 和 LCYe 等基因表达呈明显上升趋势。这些
结果表明,ChPSY 基因超量表达克服了 PSY 酶的限速效应,同时也诱导了转基因植株中 PSY1、PDS、
ZDS、CRTISO、LCYb 和 LCYe 等类胡萝卜素合成基因的表达,从而使转基因番茄果实中合成和积累
大量的类胡萝卜素。
8 期 张建成等:超量表达欧李 ChPSY 基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 1571

Fray 等(1995)的研究表明,番茄 PSY cDNA 组成型过量表达,引起转基因番茄植株矮化,这
主要是由于 PSY 基因过量表达,使 GGPP 大量进入类胡萝卜素合成途径,而使赤霉素(GA)合成
减少的缘故。在转基因烟草中,烟草 PSY 基因组成型过量表达,也导致转基因植株发生矮化、叶形
卷曲等效应(Busch et al.,2002)。在转基因拟南芥中,PSY 基因过量表达使得拟南芥转化植株种子
萌发延迟,这主要是由于种子中 ABA 含量增加所致(Lindgren et al.,2003)。本研究中获得的 12
株组成型过量表达 ChPSY 的番茄植株与未转基因对照相比没有明显的形态学差异,均能正常生长发
育和开花结果。在转基因亚麻中,crtB 基因组成型超量表达促进了亚麻转化植株种子中类胡萝卜素
的合成和积累,转基因亚麻植株能正常生长发育,与未转基因对照相比没有明显形态学特征的差异
(Fujisawa et al.,2008)。同样,在转基因山金柑中,PSY 基因过量表达也没有引起植株明显矮化或
叶片卷曲等不良效应,转化植株均能正常生长、开花和结果(Zhang et al.,2009)。可见,在对 PSY
基因进行遗传转化时,转基因植株的生长和发育表型会因植物种类和基因结构有所差异。因此,在
应用基因工程技术调控类胡萝卜素生物合成途径时,目标基因的选择和组织或器官特异性启动子的
选择是关键,这样可减少转基因植物中经常出现的共抑制(co-suppression)现象,也可有目标地增
加靶器官或组织中类胡萝卜素的含量。

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