全 文 ：第 wu卷 第 x期
u s s y年 x 月
林 业 科 学
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宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析 3
郑阳霞t ou 季 静t 王 罡t 杨婉身u
kt1 天津大学农业与生物工程学院 天津 vssszu ~ u1 四川农业大学生命科学与理学院 雅安 yuxstwl
关键词 } 宁夏枸杞 ~八氢番茄红素合成酶基因 ~克隆
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylsx p stv{ p sw
收稿日期 }ussw p tt p uu ∀
3 季静为通讯作者 ∀
Χλονινγ ανδ Σεθυενχε Αναλψσισ οφ Πηψτοενε Σψντηασε χ∆ΝΑ φροµ Λψχιυµ βαρβαρυµ
«¨ ±ª ≠¤±ª¬¬¤tou ¬¬±ªt • ¤±ªŠ¤±ªt ≠¤±ª • ¤±¶«¨ ±u
kt1 Χολλεγε οφ Αγριχυλτυρε ανδ ΒιοτεχηνολογψoΤιανϕιν Υνιϖερσιτψ Τιανϕιν vssszu ~
u1 Χολλεγε οφ Βιολογψ ανδ Σχιενχε o Σιχηυαν Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ψαπαν yuxstwl
Αβστραχτ } „ ±²√¨ ¯t1v ®¥¦⁄‘„ º¤¶¤°³¯¬©¬¨§©µ²° ¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼ ²© Λψχιυµ βαρβαρυµ ¥¼ °≤• q׫¬¶¦⁄‘„ ¦¯²±¨ º¤¶©∏µ·«¨µ
¬±¶¨µ·¨§¬±·²³Š∞2× q׫¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §·«¤··«¨ ¦⁄‘„ º¤¶t u|u ¥³ ²¯±ªº¬·«¤±²³¨ ±µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ ²©t uzx ¥³o
¤±§ ±¨¦²§¨§¤³²¯¼³¨ ³·¬§¨ ²©wux ¤±¬°²¤¦¬§¶qŒ·¶¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ¶«²º¨ §zx h ∗ {s h ¬§¨±·¬·¼o¤±§·«¨ ¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨
¶«¤µ¨§zs h ∗ {s h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«·«²¶¨ ²© ΠΣΨ©µ²° Λψχοπερσιχον εσχυλεντυµ o Χαπσιχυµ αννυυµ o Αραβιδοπσιστηαλιανᤱ§ Ζεα
µαψ󵨶³¨¦·¬√¨ ¼¯ o¬±§¬¦¤·¬±ª·«¤··«¨ ©∏¯¯ 2¯ ±¨ª·« ΠΣΨ¦⁄‘„ º¤¶¬¶²¯¤·¨§©µ²° Λq βαρβαρυµ q
Κεψ ωορδσ} Λψχιυµ βαρβαρυµ ~³«¼·²¨ ±¨ ¶¼±·«¤¶¨ ~¦¯²±¬±ª
类胡萝卜素是植物叶绿体光合作用的辅助色素 o并能保护叶绿素免受高温强光的破坏k…¤µ·¯¨¼ ετ αλqo
t||xl ∀现在越来越多的医学研究表明 o类胡萝卜素与人类健康密切相关 ∀约有 ts h的类胡萝卜素是维生素
„的前体kŽµ¬±¶®¼ot|{|l ∀据统计 o每年有 zs多个国家的 v sss多万儿童因缺乏维生素 „而造成致命性疾病
k≤«¨µ¼¯ ετ αλqot||zl ∀此外 o类胡萝卜素在防癌抗癌 !预防心血管疾病 !增强人体免疫力等方面起着重要的作
用 k陶俊等 oussul ∀通过对菲律宾 !加拿大和中国的食道癌患者的调查已证明 Βp胡萝卜素能延缓疾病的进
程k韩雅珊 ot|||l ∀由于类胡萝卜素在许多植物中含量较低 o并且难以用化学方法合成 ∀因此 o利用基因工
程手段调控类胡萝卜素的代谢积累 o进而大量生产类胡萝卜素已成为研究者们所共识的研究方向之一 ∀目
前通过基因工程手段已获得转类胡萝卜素合成酶基因的/金大米0和/金油菜0 k陶俊等 oussul ∀
植物体内类胡萝卜素均通过异戊二烯化合物或萜类化合物合成 ∀代谢主链上有 x种酶参与 o分别是八
氢番茄红素合成酶k°≥≠l !八氢番茄红素脱饱和酶k°⁄≥l !Νp胡萝卜素脱饱和酶k⁄≥l !番茄红素 Βp环化酶
k¼¦…l和番茄红素 Ε p 环化酶k¼¦∞l ∀随着分子生物学研究手段的发展 o编码这些酶的基因已从番茄
kΛψχοπερσιχον εσχυλεντυµl !烟草k Νιχοτιανα ταβαχυµl !辣椒k Χαπσιχυµ αννυυµl !拟南芥k Αραβιδοπσιστηαλιαναl !玉米
k Ζεα µαψσl等植物中陆续分离鉴定k陶俊等 oussu ~≤∏±±¬±ª«¤° ετ αλqot||{l ∀据报道宁夏枸杞k Λψχιυµ
βαρβαρυµl的总类胡萝卜素含量为 u1|xu z °ª#ªptk李忠等 ot|||l o其含量之高为植物所罕见 ∀目前有关枸杞
类胡萝卜素合成酶基因的克隆还未见报道 ∀因此选择宁夏枸杞作为试验材料 o进行八氢番茄红素合成酶基
因k³«¼·²¨ ±¨ ¶¼±·«¤¶¨ oΠΣΨl的克隆 o可为进一步利用基因工程手段生产类胡萝卜素奠定基础 ∀
1 材料与方法
t1t 材料 质粒载体 ³Š∞2× √¨ ¦·²µ¶¼¶·¨°为 °µ²°¨ ª¤公司产品 oפ´ ⁄‘„聚合酶 !§‘×°和 ⁄‘„ °¤µ®¨µusss
购自大连宝生物工程有限公司 o÷pª¤¯ 和 Œ°×Š为北京鼎国生物技术有限责任公司产品 o其他化学常规试剂为
国产分析纯 ∀大肠杆菌菌株 ts|及宁夏枸杞叶片 ¦⁄‘„文库由解放军军需大学植物基因工程研究中心提
供 ∀
t1u °≤• 模板的制备 采用液体培养法提取 Κ噬菌体 ⁄‘„k萨姆布鲁克等 oussul ∀
t1v °≤• 体外扩增 根据番茄 !辣椒 !拟南芥 !玉米等植物 ΠΣΨ基因的保守序列设计一对引物 }引物 tk正
向lŠ„„ ××≤ „׊ ×≤× „×× ×Š× „≤Š ≤ׄ ׊Š Š×× Š×× ~引物 uk反向lŠ≤ ŠŠ≤ ≤Š≤ ×≤„ ×Š× ×׊ ŠŠŠ ׄ×
≤„× „„„ „Š„ ∀在 uxˏ反应体系中 o加入 ts ≅ °≤• …∏©©¨µkªun tx °°²¯ #ptl v1s ˏo§‘×°k各 u1x °°²¯ #
ptlu1x ˏo引物 tkus Λ°²¯#ptl和引物 ukus Λ°²¯#ptl各 t1x ˏoפ´ ⁄‘„聚合酶kx ˜#ˏptl s1x ˏo模板
⁄‘„ u1x ±ª∀反应条件 }|w ε v °¬±ψk|w ε t °¬±ψxx ε t °¬±ψzu ε u °¬±lvs ψzu ε ts °¬±∀扩增反应在
德国 ˜‘’ŒŒ …¬²°¨ ·µ¤ ⁄‘„扩增仪上进行 ∀反应结束后在 t h琼脂糖凝胶上电泳检查 ∀
t1w 扩增产物的克隆与 ⁄‘„序列测定 采用北京鼎国生物技术发展中心的 ⁄‘„片段回收试剂盒回收 °≤•
扩增产物 ∀回收产物与 ³Š∞p×载体进行连接 o连接产物转化大肠杆菌 ts| ∀在含氨苄青霉素的培养基上
进行蓝白斑筛选 ∀随机挑取白色菌落 o用碱裂解法小量提取质粒 ⁄‘„ o并进行 °≤• 和双酶切k Σαχ ´ oΝχο ´l
鉴定 ∀由华大基因上海鼎安生物科技有限公司用 ⁄‘„荧光自动序列分析仪进行序列测定 ∀
图 t 凝胶电脉图谱
ƒ¬ªqt Š¨ ¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶°¤³
t ow oy ⁄‘„ ¤µ®¨µusss ~u °≤• 产物 °≤• ³µ²§∏¦·~v 质粒 ³Š∞p
ΠΣΨ的 °≤• 扩增鉴定 Œ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©³Š∞pΠΣΨ ¥¼ °≤• ~x质粒
³Š∞pΠΣΨ的酶切鉴定 Œ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²© ³Š∞pΠΣΨ ¥¼ µ¨¶·µ¬¦·¬²±
±¨½¼°¨ ¶§¬ª¨¶·¬²±q
表 1 ΠΣΨ基因编码的蛋白质氨基酸组成
Ταβ . 1 Τηε αµινο αχιδ χοµ πονεντσ οφ προτειν βψ ΠΣΨ
氨基酸
„°¬±²¤¦¬§
数量
‘∏°¥¨µ
数量百分比
„°²∏±·³¨µ¦¨±·¤ª¨Πh
质量百分比
¤¶¶³¨µ¦¨±·¤ª¨Πh
氨基酸
„°¬±²¤¦¬§
数量
‘∏°¥¨µ
数量百分比
„°²∏±·³¨µ¦¨±·¤ª¨Πh
质量百分比
¤¶¶³¨µ¦¨±·¤ª¨Πh
„¯ ¤k„l vy {1wz x1zu  ·¨kl tw v1u| v1zv
≤¼¶k≤l z t1yx t1xt „¶±k‘l tz w1ss w1st
„¶³k⁄l uy y1tu y1t{ °µ²k°l t| w1wz v1|s
Š¯ ∏k∞l uz y1vx z1s| Š¯ ±k±l tu u1{u v1tv
°«¨ kƒl tw v1u| w1tv „µªk• l vw {1ss ts1xz
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‹¬¶k‹l v s1zt s1{v ׫µk×l t{ w1uw v1{v
Œ¯ k¨Œl uu x1t{ x1tx ∂¤¯k∂l u| y1{u y1sy
¼¶kŽl uy y1tu y1z{ ×µ³k • l z t1yx u1xx
¨∏kl ws |1wt |1vy ×¼µk≠l us w1zt y1wz
2 结果与分析
u1t ΠΣΨ基因的体外扩增与克隆 用 °≤• 技术从 ¦⁄‘„
文库中扩增出一条特异性片段 o大小约 t1v ®¥o与预期大小
相符k图 tl ∀经过多次重复 o均得到相同的结果 o初步证明
°≤• 扩增成功 ∀将该片段纯化后 o克隆至 ³Š∞p×载体 o转
化ts| ∀通过 °≤• 和双酶切鉴定 o筛选出插入片段在
t1v ®¥的重组质粒k图 tl ∀成功构建的重组质粒命名为
³Š∞2 ΠΣΨ∀
u1u ΠΣΨ基因的序列分析 重组质粒 ³Š∞pΠΣΨ的 ⁄‘„
序列分析结果表明 o分离克隆的 ΠΣΨ基因 ¦⁄‘„全长 t u|u
¥³o阅读框位于 z ∗ t u{w ¥³之间 o共编码 wux个氨基酸k图
ul ∀与其他植物 ΠΣΨ基因核苷酸序列同源性比较发现 o与
番茄k„utvyslk•¤¼ ετ αλqot|{zl !辣椒k÷y{stzlk•²°¨ µ ετ
αλqot||vl !拟南芥 kux{tulk≥¦²¯±¬® ετ αλqot||wl !玉米
k˜vuyvyl k …∏¦®±¨ µ ετ αλqot||y l !黄 水 仙 k Ναρχισσυσ
πσευδοναρχισσυσlk÷z{{twlk≥¦«¯ §¨½ ετ αλqot||yl !甜瓜k Χυχυµισ µελοlkvzxwvlkŽ¤µ√²∏±¬ετ αλqot||xl的同源性分
别为 z{ h o{s h ozz h ozx h oz| h o{s h ∀另外 o该基因所编码的氨基酸序列与其他植物的同源性高达 zs h ∗
{s h o肽链长度相仿 o由 wts ∗ wux个氨基酸组成 o且其中存在 w个高度保守序列k图 u斜黑体部分l ∀说明所
获得基因序列是宁夏枸杞 ΠΣΨ基因 ∀
|vt 第 x期 郑阳霞等 }宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析
图 u 宁夏枸杞 ΠΣΨ基因 ¦⁄‘„序列和由此推导的氨基酸序列
ƒ¬ªqu ׫¨ ±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤±§·«¨ §¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ²© ΠΣΨ©µ²° Λqβαρβαρυµ
斜黑体字母指高度保守序列 ∀
׫¨ ¬±¦¯¬±¨ §¤±§¥¯¤¦®¯¨·¨µ¶³²¬±··²·«¨ «¬ª«¯¼ ¦²±¶¨µ√¤·¬√¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ q
u1v ΠΣΨ基因所编码的蛋白质
特性分析 用 „±·«¨ ³µ²·软件对
ΠΣΨ基因编码的蛋白质的基本
特性和氨基酸组成进行分析 ∀
结果为 o相对分子质量是 w{
vuz o等电点为 {1{ux ∀在 ³‹ z1s
时 o电荷为 y1|{v ∀蛋白质氨基
酸的组成分析结果见表 t ∀
对 ΠΣΨ基因编码的蛋白质
进行二级结构预测分析 o结果
k图 vl表明该蛋白富含 Αp螺旋
k«¨ ¬¯¬l o高达 xw1v h o其次无规
卷曲k¦²¬¯l o为 ws h o而 Βp折叠
k¶·µ¤±§l只有 x1y h ∀
3 结论与讨论
目前已建立多种方法克隆
基因 ∀构建 ¦⁄‘„ 文库是其中
比较常规的一种 ∀利用探针从
文库中筛选基因是一件比较烦
琐的工作 o易受假阳性的干扰 ~
而且有时所获取的克隆还不完
整 o需要重新筛选 ∀°≤• 扩增克
隆基因仍是目前最为快速 !简便
的方法 ∀程奇等kt||wl和刘建
喜等kusstl研究发现在已建立
¦⁄‘„文库的基础上 o利用 °≤•
反应可以快速地克隆 ¦⁄‘„ o这
在本试验中进一步得到证实 ∀
由于 °≤• 反应存在非特异扩
增 o可以通过提高退火温度 !增
加引物长度来提高 ¦⁄‘„ 序列
的精确性 ∀
ΠΣΨ催化 u个 牛儿基 牛儿基焦磷酸kŠŠ°≥l缩合形成八氢番茄红素 o它是整个类胡萝卜素合成途径
中第 t个类胡萝卜素分子 ∀来自其他植物的研究表明 °≥≠ 是类胡萝卜素生物合成途径中的第 t个限速酶
k • ¨¯¶¦« ετ αλqousssl o其活性的高低会影响类胡萝卜素的生物合成 ∀季静等kussul将来自龙胆草k Ραβδοσια
τερνιφολιαl的 x个类胡萝卜素合成酶基因导入烟草 o并对转基因烟草中的类胡萝卜素含量进行测定 ∀结果表
明 ΠΣΨ基因对烟草的叶黄素 !Βp胡萝卜素含量影响较大 ∀因此 ΠΣΨ基因是基因工程的首选目标 ∀枸杞是
我国重要的药用经济林木 o总类胡萝卜素含量居植物之首 o因此从枸杞中克隆类胡萝卜素合成酶基因对提高
植物中的类胡萝卜素含量可能具有更大的优势 ∀本试验利用 °≤• 技术从宁夏枸杞 ¦⁄‘„文库中成功地分离
了 ΠΣΨ全长¦⁄‘„ o其核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物具有很高的同源性 o分别达到 zx h和 zs h
以上 ∀宁夏枸杞 ΠΣΨ基因的分离 o为通过基因工程方法调控类胡萝卜素的代谢和积累 o创造类胡萝卜素含
量更高的品系 o改善果蔬的营养价值奠定基础 ∀
swt 林 业 科 学 wu卷
图 v ΠΣΨ基因编码的蛋白质二级结构预测分析
ƒ¬ªqv ≥ ¦¨²±§¤µ¼ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ³µ¨§¬¦·¬²± ²©³µ²·¨¬± ¥¼ ΠΣΨ
‹ }Αp螺旋 ‹¨¯¬¬~≤ }无规卷曲 ≤²¬¯~∞}Βp折叠 ≥·µ¤±§q
参 考 文 献
程 奇 o于晓兰 o章力建 o等 qt||w q从水稻叶绿体基因文库中快速克隆叶绿体基因 q中国农业科学 ouzkvl }z p tt
韩雅珊 qt||| q类胡萝卜素的功能研究进展 q中国农业大学学报 owktl }x p |
季 静 o王 罡 qussu q来自龙胆草的 x个类胡萝卜素生物合成相关酶基因对类胡萝卜素生物合成量影响的分析 q农业生物技术学报 otskvl }yu
p yv
李 忠 o彭光华 o张声华 qt||| q枸杞子中的类胡萝卜素的组成及含量 q植物资源与环境 o{kwl }xz p x{
刘建喜 o林爱星 o李雪辉 o等 qusst q用 °≤• 法从 ¦⁄‘„文库中快速克隆基因 q农业生物技术学报 o|kvl }uz| p u{t
萨姆布鲁克 o拉塞尔 ⁄ • qussu q分子克隆实验指南 qv版 q黄培堂 o王嘉玺 o朱厚础 o等译 q北京 }科学出版社 ouv{ p uwt
陶 俊 o张上隆 o徐昌杰 o等 qussu q类胡萝卜素合成的相关基因及基因工程 q生物工程学报 ot{kvl }uzy p u{t
…¤µ·¯¨¼ Š ∞o≥¦²¯±¬® ° „ qt||x q°¯ ¤±·¦¤µ²·¨±²¬§}³¬ª°¨ ±·©²µ³«²·²³µ²·¨¦·¬²±o√¬¶∏¤¯ ¤·µ¤¦·¬²± ¤±§«∏°¤± «¨ ¤¯·«q°¯ ¤±·≤¨¯¯oz }tsuz p tsv{
…∏¦®±¨ µ…o¬ª∏¨¯ ° ≥ o¤±¬¦®2…∏¦®±¨ µ⁄oετ αλqt||y q׫¨ ¼t ª¨ ±¨ ²© °¤¬½¨ ¦²§¨¶©²µ³«¼·²¨ ±¨ ¶¼±·«¤¶¨ qŠ¨ ±¨ ·¬¦¶otwv ktl }wz| p w{{
≤«¨µ¼¯ o•²¦®qt||z q≤¤µ²·¨±¬²§¶}¥¬²¯²ª¼ ¤±§·µ¨¤·°¨ ±·q°«¤µ°¤¦²¯²ª¼ ¤±§×«¨µ¤³¨ ∏·¬¦¶ozxkvl }t{x p t|z
≤∏±±¬±ª«¤° ƒ ÷ oŠ¤±·∞qt||{ qŠ¨ ±¨ ¶¤±§ ±¨½¼°¨ ¶²©¦¤µ²·¨±²¬§¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶¬± ³¯¤±·¶q„±±∏ • √¨ °¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ °¯ ¤±·²¯ …¬²¯ ow| }xxz p x{v
Ž¤µ√²∏±¬ o²«± Œoפ¼¯²µ∞oετ αλqt||x qŒ¶²¯¤·¬²±¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶¤·¬²±²©¤ °¨¯²±¦⁄‘„ ¦¯²±¨ ±¨¦²§¬±ª³«¼·²¨ ±¨ ¶¼±·«¤¶¨ q°¯ ¤±·²¯ …¬²¯ ouz kyl }ttxv p ttyu
Žµ¬±¶®¼ ‘Œqt|{| q≤¤µ²·¨±²¬§¶¦«¨ °¬¶·µ¼ ¤±§¥¬²¦«¨ °¬¶·µ¼q‘¨º ≠²µ®}°¯ ±¨∏° ³µ¨¶¶ouz| p u|t
•¤¼  „ o…¬µ§≤ • o¤±∏§¨µ¶ oετ αλqt|{z q≥¨´ ∏¨±¦¨ ²©³×’x o¤µ¬³¨ ±¬±ªµ¨ ¤¯·¨§¦⁄‘„ ©µ²°·²°¤·²q‘∏¦¯ „¦¬§ • ¶¨ouw }tsx{z
•²°¨ µ≥ o‹∏ª∏¨ ±¨ ¼ ° o…²∏√¬¨µƒ oετ αλqt||v q∞¬³µ¨¶¶¬²± ²©·«¨ ª¨ ±¨ ¶ ±¨¦²§¬±ª·«¨ ¤¨µ¯¼ ¦¤µ²·¨±²¬§¥¬²¶¼±·«¨·¬¦ ±¨½¼° ¶¨¬± Χαπσιχυµ αννυυµ q…¬²¦«¨ ° …¬²³«¼¶
• ¶¨≤²°°∏±ot|ykvl }twtw p twut
≥¦²¯±¬® ° „ o…¤µ·¯¨¼ Š ∞qt||w q‘∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©¤± Αραβιδοπσιστηαλιανα ¦⁄‘„ ©²µ³«¼·²¨ ±¨ ¶¼±·«¤¶¨ q°¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ otsw kwl }twzt p twzu
≥¦«¯ §¨½  o…¤¥¬¯¬≥ o√²± ¬±·¬ªoετ αλqt||y q°«¼·²¨ ±¨ ¶¼±·«¤¶¨ ©µ²° Ναρχισσυσ πσευδοναρχισσυσ}©∏±¦·¬²±¤¯ ¬¨³µ¨¶¶¬²±oª¤¯¤¦·²¯¬³¬§µ¨ ∏´¬µ¨° ±¨·o·²³²¯²ª¬¦¤¯
§¬¶·µ¬¥∏·¬²±¬±¦«µ²°²³¯¤¶·¶¤±§¬±§∏¦·¬²± §∏µ¬±ª©¯²º µ¨¬±ªq°¯¤±·ots kxl }z{t p z|u
• ¨¯¶¦« • o…¨ ¼¨ µ° o‹∏ª∏¨ ±¨ ¼ ° oετ αλqusss q• ª¨∏¯¤·¬²±¤±§¤¦·¬√¤·¬²±²©³«¼·²¨ ±¨ ¶¼±·«¤¶¨ o¤®¨ ¼ ±¨½¼°¨¬±¦¤µ²·¨±²¬§¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶o§∏µ¬±ª³«²·²°²µ³«²ª¨ ±¨ ¶¬¶q
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k责任编辑 徐 红l
twt 第 x期 郑阳霞等 }宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析