全 文 ：植物学通报 2004, 21 (3): 326~331
Chinese Bulletin of Botany
①国家十五攻关子课题资助项目(2002BA515B0404)。
②通讯作者。Author for correspondence.
收稿日期：2003-04-21 接受日期：2003-07-18 责任编辑：孙冬花
红松 ISSR-PCR实验系统影响因素①
冯富娟 王凤友② 刘 彤
（东北林业大学森林资源与环境学院 哈尔滨 150040）
摘要 本文探讨了红松(Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) ISSR实验中的各种影响因素，分别对红松的鲜
叶、干叶、胚和胚乳4种材料进行了DNA的提取和PCR扩增，证明4种取样方式都是可行的。另外分析
了模板的纯度和浓度、dNTP浓度以及TaqDNA聚合酶的浓度等对ISSR-PCR扩增的影响；尝试了不同的
退火温度、延伸时间和循环次数, 筛选出17个扩增稳定且多态性丰富的ISSR引物；建立了红松ISSR的最
佳反应体系，为进行红松种群间遗传分化的研究奠定基础。
关键词 红松, ISSR, 影响因素, 最佳体系
The Influence Factors of the ISSR-PCR Experiment System
on Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.
FENG Fu-Juan WANG Feng-You② LIU Tong
(Faculty of Forest Resources and Environment, Northeast Forestry University, Harbin 150040)
Abstract The study focuses on the influential factors of ISSR experiments used to analyze Korean
pine. Comparative experiments on DNA extraction and PCR amplification among fresh leaves, dry
leaves, embryos and endosperms were conducted. The results showed that the four kinds of materi-
als were all feasible. The effect of purity and concentration of template, dNTP and TaqDNA poly-
merase on amplification was analyzed. Different annealing temperature, extension time and cycle
times were also compared. 17 primers with stable amplification and rich polymorphism for ISSR were
screened. The reaction condition of ISSR experiment of Korean pine was discussed, which was a
basis for the study on genetic divergency among Korean pine populations.
Key words Pinus koraiensis Sieb. et Zucc., ISSR, Influential factors, Optimal system
近几年，在 PCR基础上检测简单重复序列（SSR）指纹的技术得到很大的发展。在真
核生物基因组中广泛存在着SSR，并具有丰富的多态性。这种PCR是用SSR作为引物（16~18
个碱基），扩增重复序列之间的区域，并检测该区域DNA序列上的多态性，称之为 ISSR (inter
simple sequence repeat)。此技术类似于 RAPD，是显性标记，而且都具有不要求预知基因组
序列信息，所需的模板 DNA用量少，实验操作简便，费用较低等特点。两者相比，ISSR
研 究 简 报
3272004 冯富娟等：红松 ISSR-PCR实验系统影响因素
扩增产物的特异性更强，稳定性更高(钱韦等，2000)。Jonsson等(1996)的研究也认为在进行
植物遗传多样性的研究时可优先考虑使用 ISSR。ISSR技术已经广泛应用于遗传图谱的构建、
种群遗传学以及系统发育等方面的研究。国内最初是在水稻等作物中研究较多（Joshi et al.，
2000; 何予庆等，2001），但近年来在林木方面开始采用此方法（Arcade et al., 2000; 姜静等，
2003）。
虽然 ISSR-PCR具有重复性高的优点，但其扩增结果往往会受到多个因素的影响，如模板
浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度和延伸时间等。为了确保 ISSR分析结果
的可靠性和可重复性，本实验以红松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.）所提取的 DNA为材
料，探讨了影响 ISSR-PCR反应的多个因素，建立了红松 ISSR-PCR最佳反应体系，为进行红
松种群间遗传分化的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采集汤旺河林场的 80~120年生的红松新鲜幼叶，一部分从野外采集后，直接用冰壶保存
到实验室，置于-70℃冰箱中备用，另一部分利用变色硅胶干燥（材料与硅胶的体积比为 1:
10），硅胶变色后需马上更换，直到叶子变脆，实验室常温保存 5~6个月；采集的种子 4℃
保存，将胚和胚乳分离。
1.2 DNA提取的方法
4种材料均采用传统的 CTAB法提取DNA（邹喻苹等，2001）
1.3 PCR扩增程序
本实验采用了 Tsumura的体系（Tsumura et al.，1996），94℃充分变性 7 min，94℃变
性 30 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，40个循环，最后 72℃延伸 7 min。其中 TaqDNA
聚合酶由 PROMEGA公司提供，引物和 dNTP由TaKaRa公司提供，PCR反应在美国MJ公司
的 PC-200型 PCR循环仪上进行。
1.4 检测方法
扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测, EB染色, 紫外光下UVP凝胶成像系统观察并成像。
2 结果与分析
2.1 提取的材料对 ISSR-PCR扩增的影响
本实验所采用的鲜叶、干叶、胚和胚乳等，均提取到了DNA，而且获得了稳定的扩增
结果（图 1），但 4种材料 DNA获得率有所不同。鲜叶提取 DNA得率高, DNA降解较少，
一般 0.1 g叶子,可以获得纯化的 DNA为 2 500~7 500 ng；用干叶提取 DNA得率较低，一般
0.2 g干叶可获得大约300~500 ng纯化的DNA；从胚中提取DNA较为方便,一个胚可以获得大
约 1 000~5 000 ng纯化的DNA；本实验还证明从胚乳中提取DNA是可行的，0.1 g胚乳可获
得 500~3 000 ng的DNA。
实验结果表明用红松的4种材料提取DNA进行 ISSR实验都是可行的。以上实验无疑为分
子标记实验中取样的工作提供了新思路——应该结合物种本身特点和各实验室的具体条件来确
定最佳的取样方法。
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图 1 不同模板的 ISSR-PCR电泳结果
M. 标准分子量 (3 kb，2 kb, 1.5 kb, 1.2 kb, 1 031 bp,
900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp); 1. 胚乳提取模
板的扩增图谱; 2. 胚提取模板的扩增图谱; 3. 干叶提
取模板的扩增图谱; 4. 未纯化的模板的扩增图谱; 5~7.
每 20 mL体系中 40, 10和200 ng模板的扩增图谱，所
用引物为 808号
Fig. 1 Electrophoresis results of ISSR-PCR with differ-
ent templates
M. DNA molecular weight markers (3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1.2
kb, 1 031 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp); 1.
Amplified bands with the template extracted from
endosperm; 2. Amplified bands with the template extracted
from embryos; 3. Amplified bands with the template ex-
tracted from dried leaves; 4. Amplified bands with the
unpurified template; 5-7. Amplified bands with the tem-
plate of 40, 10 and 200 ng (note:the primer number is 808)
2.2 模板对 ISSR-PCR的影响
2.2.1 模板纯度对 ISSR-PCR扩增的影响 一般 PCR反应的模板需要纯化，粗提取的DNA
含有大量的 RNA、蛋白质和多糖等杂质，会对扩增有影响，需要用 RNA酶和蛋白酶去除，
并要用氯或酚仿抽提（克拉尔克，1997）。本实验分别对纯化后和未纯化的DNA进行了扩
增，结果表明模板中含有少量的RNA和蛋白质不会抑制TaqDNA聚合酶的作用，模板的纯度
不会对扩增结果产生明显影响（图 1）。
2.2.2 模板浓度对 ISSR-PCR扩增的影响 PCR反应中对模板浓度要求的范围较宽，一般每
个反应中 5~500 ngDNA都能提供好的结果，但不同类群的DNA进行 PCR扩增时，适合的浓
度不同。本实验中模板浓度的测定采用凝胶电泳法，用λDNA作为对照，对 10~200 ng的模
板分别进行了 PCR，发现在此范围内模板浓度对扩增结果基本无影响（图 1）。
2.3 dNTP浓度对 ISSR-PCR的影响
dNTP是PCR的原料，常用的浓度范围为50~200 mmol.L-1, 浓度过高会产生错误掺入，浓
度太低导致产率太低（张恒庆等，1999）。本实验对不同浓度的 dNTP进行 PCR，结果表明,
dNTP在 150~200 mmol.L-1之间扩增结果一致，在 100 mmol.L-1时条带不够清晰，在 250
mmol.L-1以上带型会产生变化，所以本实验采用 200 mmol.L-1的浓度，在此浓度下，扩增稳
图2 不同浓度TagDNA聚合酶及dNTP的ISSR-
PCR电泳结果
M. 分子量标准(同上); 1~5. 250 mmol.L-1, 200
mmol.L-1, 150 mmol.L-1, 100 mmol.L-1和 50
mmol.L-1的 dNTP对 811号引物的扩增图谱;
6~9. 2, 1.5, 1和 0.5 U的 TaqDNA聚合酶对 834
号引物的扩增图谱
Fig. 2 Electrophoresis results of ISSR-PCR with
different amount of Taq DNA polymerase, dNTP
M. DNA molecular weight markers; 1-5. Amplified
bands with NO.811 primer and dNTPs of 200,150,
100 and 50 mmol.L-1; 6-9. Amplified bands with
NO.834 primer and Taq DNA polymerase of 2, 1.
5, 1 and 0.5 U
定，重复性强(图 2 )。
2.4 TaqDNA聚合酶用量对ISSR-PCR的影响
在PCR反应中，不同厂家和不同批号的
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2.6 退火温度对 ISSR-PCR的影响
微卫星引动的PCR和RAPD-PCR很相似，退火温度明显影响扩增带的式样。本实验从45~55
℃尝试了不同的退火温度，发现正如Meyer (邹喻苹等，2001)在鹰嘴豆种间分析的 ISSR引物
的退火温度时所说，不同引物具有不同的最适退火温度。本实验在52℃的退火温度下，在100
个引物中筛选出 17个稳定扩增的引物(表 1)。
2.7 延伸时间对 ISSR-PCR的影响
在 ISSR反应中延伸温度一般为72℃，除了退火温度外，延伸时间是另外一个重要影响因
素，延伸时间的长短和扩增片段的长度有关，两者呈正相关。时间过短，无法完成扩增，
图 3 不同浓度引物的 ISSR-PCR电泳结果
M. 分子量标准(同上); 1~5. 5, 15, 30, 40和50 ng引物浓
度的扩增图谱，所用引物为 834号
Fig. 3 Electrophoresis results of ISSR-PCR with different
amount of primer
M. DNA molecular weight markers; 1-5. Amplified bands
with NO.834 primer of 5, 15, 30, 40 and 50 ng
TaqDNA聚合酶的用量不同。酶的用量是
影响PCR的一个重要因素，浓度过低不能
扩增,浓度太高产生非特异性扩增。本实
验采用的酶购自 Promega公司，每个反应
体系中从0.5~2 U分别进行了扩增实验, 0.5
U时无扩增, 1 U和1.5 U时扩增谱带结果
稳定一致,重复性好，2 U时带型发生变
化，结果如图 2。由于 T a q D N A 聚合
酶的成本较高, 所以在确保实验结果稳定
的前提下, 采用了较低的浓度1 U/每个反
应体系。
2.5 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
引物浓度会对PCR的带型产生明显的
影响,浓度过低不能扩增,浓度太高产生新的
位点(邹喻苹，2001)。为了减少非特异性
扩增, 加强重复性, 本实验在确保产量的前
提下,采用了较低的引物浓度为30 ng /20 mL
(相当于0.5 mmol.L-1) , 结果稳定, 重复性较
好(图 3)。
表1 ISSR引物序列
Table 1 ISSR primer sequences
引物序号与序列 The number of primers and their sequences（5~3）
2核苷酸重复 8 3 4（A G）8 Y T 8 5 3（T C）8 R T 8 1 8（A G）8 C 8 4 8（C A）8 R G
Dinucleotide 8 2 8 （T G）8 A 8 0 8（A G）8 T 8 0 9（A G）8 G 8 2 3（T C）8 C
8 2 2（T C）8 A 8 1 2（G A）8 A 8 1 1（G A）8 C 8 0 7（A G）8 T
8 2 7（A C）8 G 8 4 5（C T）8 R G 8 2 0（G T）8 C
4核苷酸重复 8 7 3（G A C A）8
Tetranucleotide
5′锚定的重复 8 8 4 H B H（AG）7
Primer aimed at 5-end
R 代表 A 和 T，Y 代表 G 和 C，B 代表 C、G 或 T，H 代表 A、C 或 T
R stands for A and T, Y for G and C, B for C, G or T, H for A, C or T
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产量低；时间过长，会产生非特异扩增。本实验进行了 1 min、1.5 min和 2 min 3种尝试,发
现不同引物最适的延伸时间不同。因为对红松来说, 不同引物所扩增的片段大小的范围不同, 而
且跨度较大, 一般在2.5 kb~300 bp之间，1 min时, 多数引物无扩增带或带型很少, 2 min时多数
引物获得了稳定扩增, 带型较为丰富, 在本研究中所有引物均采用2 min的延伸时间。
2.8 循环次数对 ISSR-PCR的影响
PCR的循环次数决定产量，次数太少，产物量极低，次数太多，达到反应平台后，循
环不会使产物明显增加，反而引起非特异性扩增。本实验进行了 30、35、40和 45次循环的
表 2 红松 ISSR-PCR反应体系
Table 2 The reaction system of ISSR-PCR on Korean pine
成分 母液浓度 反应总体积 20 mL 每个反应中
Components Concentrations of 各成分加入的量(mL) 各成分的含量
stocking solution Total reaction volume: Content of each
20 mL amount of each component in
component(mL) per reaction
ddH2O 11.0
MgCl2 25 mmol.L-1 1.2 1.5 mmol.L-1
Primer 15 ng.(mL)-1 2.0 30 ng
4× dNTP 10 mmol.L-1/each 1.6 0.2 mmol.L-1
Buffer 10× 2.0 1×
DNA polymerase 5 U.(mL)-1 0.2 1 U
Template 10~20 ng.(mL)-1 2.0 20~40 ng
图 4 红松 ISSR-PCR电泳图谱
M. 分子量标准(同上); 1~3. 828号引物对3个个体
的扩增图谱; 4~6. 827号引物对3个个体的扩增图
谱; 7~9. 811号引物对3个个体的扩增图谱
Fig. 4 Electrophoresis results of ISSR-PCR with the
template from Korean pine
M. DNA molecular weight markers; 1-3. Amplified
bands with NO.828 primer and the templates from 3
independent samples; 4-6. Amplified bands with NO.
827 primer and the templates from 3 independent
samples; 7-9. Amplified bands with NO.811 primer
and the templates from 3 independent samples
尝试，30个循环时，扩增不稳定，35个循环
时，部分引物的扩增带型较弱，40和 45个循
环时，扩增结果一致，可见在本实验中，40
个循环已经达到要求了。
实验中Mg2+的浓度也是一个重要因素，
它对 TaqDNA聚合酶的活性、退火和产物的
特异性都有影响，但对Mg2+的浓度的研究进
行的较多，已经达到一致，所以本实验不再
进行过多的研究，采用每个反应体系中 1 .5
mmol.L-1的浓度，扩增效果稳定
综上所述，我们得出比较稳定的红松
ISSR-PCR的反应体系，在 20 mL的反应体系
中，Mg2+的浓度为 1.5 mmol.L-1，引物的浓度
为 1.5 ng.(mL)-1, dNTP的浓度为 0.2 mmol.L-1,
TaqDNA聚合酶的用量为1 U, 模板DNA的用量
为 20~40 ng，如表 2。按照此体系，在 52℃
的退火温度下，延伸 2 min，40个循环，扩
增的重复性好，多态位点丰富(图 4)。
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3 讨论
本实验所采用的鲜叶、干叶、胚和胚乳等材料各有优缺点。鲜叶的优点是提取 DNA得
率高, DNA降解较少，但不足之处在于野外取样后需要 4℃保鲜，不便于长途运输。干叶的
优点是野外取样携带方便, 便于保存，缺点是得率较低, 研磨困难, 所耗费药品较多。从胚中提
取DNA的优点是得率高, 提取简单, 含有的多糖等杂质少, 而且种子便于携带和长期保存, 但该方
法不适合于胚很小的物种。从胚乳中提取DNA是可行的，缺点在于胚乳中含有较多的脂类物
质, 十分粘稠, 提取困难, 需要多次抽提。4种方式各有优缺点，工作中可结合实际情况来选择。
本实验证实了模板的纯度不会影响扩增结果，和邹喻苹等(2001)在银杉的RAPD实验中提
出未纯化的DNA不会影响扩增的结论一致。此外，模板浓度在10~200 ng 之间扩增结果相同，
说明 ISSR-PCR对模板浓度的要求范围较宽，具有很好的可重复性和稳定性。
参 考 文 献
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