全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (2): 194-199, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-07-18; 接受日期: 2006-11-14
基金项目: 国家自然科学基金(No.30500071)、国家科技部中 -比国际合作项目(No.200441505)和大连民族学院人才引进启动基金(No.
20056104)
* 通讯作者。E-mail: ruan@dlnu.edu.cn
.组织培养简讯.
海滨锦葵胚轴愈伤组织诱导及植株再生
郑熙 1, 2, 王学英 1, 单莹 1, 2, 金华 2, 阮成江 2*
1 沈阳农业大学生物科学技术学院, 沈阳 110161; 2大连民族学院生命科学学院, 大连 116600
摘要 以海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)胚轴为外植体, 在9种不同激素配比的培养基上进行愈伤组织诱导、继代培养、
不定芽分化及生根培养, 确定了植株再生的最适培养条件: (1)愈伤组织诱导最适培养基为MS + IAA 1.0 mg.L-1 + KT 0.3 mg.
L-1 + sucrose 30 g.L-1 + agar 8 g.L-1, 愈伤组织诱导率为93.94%; (2)不定芽诱导最适培养基为MS + IAA 0.1 mg.L-1 + ZT
0.5 mg.L-1 + sucrose 30 g.L-1 + agar 8 g.L-1, 不定芽诱导率为65.83%; (3)生根最适培养基为MS + sucrose 30 g.L-1 +
agar 8 g.L-1, 生根率为96.67%。炼苗移栽后, 成活率可达85%。
关键词 胚轴, 海滨锦葵, 植株再生, 组织培养
郑熙, 王学英, 单莹, 金华, 阮成江 (2007). 海滨锦葵胚轴诱导愈伤组织及植株再生. 植物学通报 24, 194-199.
海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)为锦葵科多年生
草本植物, 作为发展盐土农业的盐生植物, 1992年从美
国引入我国。多年滩涂实验结果表明, 海滨锦葵能适应
我国江苏、山东、辽宁等省沿海滩涂生境, 是一种优
良的耐盐油料植物(Ruan et al., 2004)。但是, 在目前
我国滩涂种植的海滨锦葵自然生长群体内, 个体产量间
存在显著差异, 品质优良不齐(Ruan et al., 2003), 急需
改良。转基因植物育种是提高产量和改良品质的重要
方法之一, 而建立高效的植株再生体系是转基因育种成
功的前提条件(林荣双等, 2003)。Cook等(1989)以海滨
锦葵的茎段和胚为外植体进行了愈伤组织诱导及植株再
生实验, 以胚为外植体采用不同浓度的NAA与 2-IP组
合, 没有得到再生植株。本实验以海滨锦葵胚轴为外植
体, 在不同培养基上进行愈伤组织、不定芽诱导以及植
株再生培养, 以期获得高频再生体系, 为进一步利用转基
因方法培育海滨锦葵优良新品系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)种子采收于大连民族
学院海滨锦葵试验地。该试验地为2005年春利用2004
年秋采收于江苏盐城滩涂海滨锦葵试验地的种子种植后
所建立。
1.2 方法
1.2.1 培养基
以MS(Murashige and Skoog, 1962), 1/2 MS和
MSB(包括MS基本培养基的大量元素、微量元素和
铁盐与B5基本培养基的有机成分)(Gamborg et al.,
1968; 程林梅等, 2001; Jin et al., 2005)培养基为
基本培养基, 以不同的激素浓度组合共设计了3种愈
伤组织诱导培养基 M1、M2和 M3, 1种愈伤组织增
殖继代培养基 M4, 3种不定芽诱导培养基 M5、M6
和 M7, 2种生根培养基 M8和 M9(表 1)。实验开始
前曾对培养基中添加的激素种类进行预试验, 结果发
现 IAA和 KT以及 IAA和 ZT的激素组合对愈伤组织
诱导有较好效果, 所以采用 IAA和 KT、IAA和 ZT以
及 2, 4-D的激素组合做进一步筛选。所有培养基均
每升添加 30 g蔗糖、8 g琼脂, 在灭菌前将 pH值调
至 5.8。激素类物质均为过滤灭菌, 在基本培养基高
压灭菌后加入。
195郑熙等: 海滨锦葵胚轴愈伤组织诱导及植株再生
1.2.2 胚轴的获得
将海滨锦葵种子置于超净工作台上, 用75%乙醇浸泡10
分钟, 双蒸水冲洗3次, 浓硫酸浸泡1小时, 再用双蒸水
冲洗5次以上, 完成表面消毒。将冲洗干净的种子置于
灭菌滤纸上, 吸干水分。浓硫酸的腐蚀作用使种子的种
皮变软, 并且易于剥落。由于海滨锦葵种子体积小, 因
此胚轴的获得难度较大。用镊子和手术刀将种子的种
皮剥落, 得到完整的胚。用手术刀切取胚轴部分(从2片
子叶相连的基部切除子叶, 且切下后2片子叶不分离, 以
确保切除生长点)。最后, 将胚轴部分放入 75%乙醇中
浸泡消毒10秒, 时间过长会导致外植体脱水死亡, 时间
短又达不到表面灭菌效果, 因此严格控制灭菌时间是确
保整个实验成功的关键。并且注意在种子去皮后应尽
量保持表面湿润。最后接种到愈伤组织诱导培养基中
进行培养。
1.2.3 愈伤组织诱导
采用M1、M2和M3三种培养基进行愈伤组织诱导, 每
种处理接种外植体 5 5 个, 设 3 次重复。培养温度:
(26±1)℃; 相对湿度: 70%-80％。接种后先完全暗培
养72小时, 再转入培养箱内, 光照14小时 /天, 光强45
mmol.s-1.m-2。在诱导初期的 5-6天, 0.5 %左右刚启
动的愈伤组织会长出芽, 此时可通过芽的形态和产生时
间确定其不是不定芽。首先, 这些芽与后期产生的不定
芽在形态上有很大的区别, 此时的芽会直接产生细长弯
曲的茎, 这与继代后诱导不定芽时所表现出的丛芽形态
形成鲜明的对比。其次, 生长点只要经过不到 10天的
培养便可以产生芽, 而不定芽产生要经过愈伤组织的诱
导培养、继代培养和不定芽诱导培养, 需要的时间约
60天以上。因此, 在愈伤组织诱导率和植株再生率计
算过程中均要将这一部分数据舍弃。培养20天后分别
统计愈伤组织诱导率(产生愈伤组织的外植体数／接种外
植体数 × 100 %)和褐化率, 然后转入继代培养基M4中
增殖愈伤组织。
1.2.4 不定芽诱导及植株再生
继代21天后, 愈伤组织生长达到直径1.0-1.5 cm时, 将
愈伤组织取出, 切成 0.5-1.0 cm3小块, 将其转入不定
芽诱导培养基进行培养。采用M5、M6和M7三种处
理, 每处理设 3次重复。分别统计培养 10、20和 25
天后不定芽的数量和诱导率(产生不定芽的愈伤组织数／
接种愈伤组织数 × 100%)。不定芽长至 2-3 cm时, 移
至生根培养基M8和M9中。不定芽诱导及植株再生的
培养条件与愈伤组织诱导条件一致。不定芽诱导以及
生根培养时均采用透气封口膜封口, 以防止产生玻璃化
苗(蔡能等, 2003)。
1.2.5 炼苗移栽
当幼根在生根培养基上长到2 cm左右时, 去除玻璃瓶的
封口膜, 在室内自然光下炼苗3-5天。然后将组培苗从
瓶中取出, 漂洗清理黏附于苗根上的培养基和松散的愈
伤组织, 漂洗后保持组培苗根部湿润, 迅速假植到含水量
60 %的营养土(腐植土:珍珠岩= 3:1, v/v)中, 并保持营
养土表面湿润。培养 14天左右移栽入花盆, 转至室外
培养。统计成活率(成活苗数 / 移栽的组培苗总数 ×
100%)。
表 1 培养基成分
Table 1 Composition of media
Medium Composition of plant growth substances (mg·L-1)
M1 MS + 2,4 - D 0.5
M2 MS + IBA 1.0 + ZT 0.1
M3 MS + IAA 1.0 + KT 0.3
M4 1/2MS + IAA 0.3 + ZT 0.3
M5 MS + IAA 0.1 + ZT 0.3
M6 MS + IAA 0.1 + ZT 0.5
M7 1/2MS + IAA 0.1 + ZT 0.5
M8 MSa
M9 MSBb
a具体配方参见Murashige and Skoog (1962)
b包括MS基本培养基的大量元素、微量元素和铁盐以及 B5基本
培养基的有机成分, 具体配方参见Murashige and Skoog (1962)
和Gamborg (1968)
aDetailed directions in Murashige and Skoog (1962)
bIncluding in macro-elements, micro-elements and iron salt of
MS basic media, and organic components of B5 basic media,
detailed directions in Murashige and Skoog (1962) and Gamborg
(1968)
196 植物学通报 24(2) 2007
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导
3种愈伤组织诱导培养基, 在接种2-3天后, 外植体都会
膨大, 经 20天培养均可产生愈伤组织。刚诱导的愈伤
组织多为浅黄色, 半透明状, 结构松散, 表面湿润。在
光照14小时 /天光周期条件下培养一段时间后, 愈伤组
织颜色加深, 少数M2、M3培养基中愈伤组织出现浅绿
色, 而M1培养基上的愈伤组织一直为半透明浅黄色。
3种培养基诱导愈伤组织的启动速度、愈伤组织质量和
得率不同。诱导20天统计结果(表2)显示3种培养基诱
导效果有明显差异(F = 28.500, P < 0.01)。
3种培养基中以M3诱导愈伤组织的效果最好, 诱导
率为 93.94 %, 其次为M1, 诱导率为 87.27%。M1诱
导愈伤组织的褐化率最低, 为9.70 %, M2和M3愈伤组
织褐化率分别为 31.45 %和 22.58 %。前期的预试验
表明, 褐化可通过在培养基中添加活性炭等吸附物质解
决。愈伤组织诱导 20天后, 转入M4增殖培养基进行
继代培养 14天。继代培养后的愈伤组织明显增大, 愈
伤得率可达到2.5 g/皿, 且愈伤组织明显比刚诱导的愈
伤组织生长旺盛, 培养 14天后进行不定芽诱导。
2.2 不定芽诱导及植株再生
选择继代增殖培养后浅黄色半透明、表面光滑、生长
旺盛的愈伤组织, 切成 0.5-1.0 cm3小块, 转入不定芽
诱导培养基M5、M6和M7中, 每个处理接种 40块左
右愈伤组织, 诱导愈伤组织分化。培养 10、20和 25
天后统计不定芽诱导情况, 结果表明3种培养基对不定
芽的诱导有明显差异(F = 34.357, P < 0.01)。
表 3和图 1显示, 在M5、M6和M7 3种培养基中,
M7对不定芽诱导效果最佳(图 2 A), 即 1/2 MS + IAA
0.1 mg·L-1 + ZT 0.5 mg·L-1 + sucrose 30 g·L-1 + agar
8 g·L-1, 25天时诱导率可达 65.83%, 其次为M6, 诱导
率为61.67%, M5诱导效果最差, 培养25天后诱导率仅
为 45.00 %。3种培养基诱导的不定芽均为丛生芽, 将
产生不定芽的愈伤组织在 3种培养基中继续继代培养,
丛芽产生率均在 50 %以上。
将M7诱导产生的不定芽从基部切下, 转到生根培
表 2 不同培养基对愈伤组织诱导率和褐化率的影响
Table 2 Effects of different media on callus induction and browning
No. of expalnts No. of explants Average frequency No. of browning Percentage of
Medium inoculated producing calli of callus induction (%) calli browning calli (%)
M1 55 48.00 ± 0.577c 87.27 ± 0.01 5.33 ± 0.333b 9.70 ± 0.01
M2 55 41.33 ± 0.677b 75.15 ± 0.01 13.00 ± 0.577a 31.45 ± 0.01
M3 55 51.67 ± 1.202a 93.94 ± 0.02 11.67 ± 0.333a 22.58 ± 0.01
ANOVA F = 28.500, P < 0.01 F = 90.600, P < 0.01
每种处理接种 55个外植体, 3次重复。P < 0.01 水平上的差异显著性。表中数字右上角字母表示邓肯氏分析结果。
Fifty-five explants inoculated in each treatment with 3 replicates.Significant differences at the P < 0.01 level. Different superscripts
indicate the results of Duncan’s test.
表 3 不同培养基对不定芽诱导的影响
Table 3 Effects of different media on shoot regeneration
Mean frequency of shoot regeneration (%)
Medium No. of calli inoculated 10 d 20 d 25 d
M5 40 6.67 ± 0.02a 35.00 ± 0.01c 45.00 ± 0.01c
M6 40 7.50 ± 0.02a 41.67 ± 0.01b 61.67 ± 0.01b
M7 40 6.67 ± 0.01a 47.50 ± 0.01a 65.83 ± 0.01a
ANOVA F = 0.600, P = 0.579 F = 16.900, P < 0.01 F = 34.357, P < 0.01
每种处理接种 40块愈伤组织, 3次重复。P < 0.01 水平上的差异显著性。表中数字右上角字母表示邓肯氏分析结果。
Forty calli were inoculated in each treatment with 3 replicates.Significant differences at the P < 0.01 level. Different superscripts
indicate the results of Duncan’s test.
197郑熙等: 海滨锦葵胚轴愈伤组织诱导及植株再生
养基M8和M9中进行不定根的诱导。每个处理接种30
个不定芽, 分别在培养 10和20天后记录生根情况。表
4表明, 海滨锦葵是一种生根较容易的植物, 不定芽转至
MS和MSB培养基培养 10天左右均可产生不定根, 且
最终生根率分别为96.67 %和94.44 %。M8培养基的
生根率在培养第10天后低于M9培养基, 为36.67 %, 但
在第20天统计结果反而超过M9培养基, 90个不定芽中
有 87个产生不定根, 生根率达到 96.67 %。在M8培
养基中生根的小苗生根速度快, 茎粗壮, 叶片正常生长,
根系发达, 根粗而长(图 2 B); 而在M9培养基中生根的
小苗茎较纤细, 叶片较小, 生根数目多, 且根细长。
2.3 炼苗移栽
当幼根在生根培养基上长到2 cm时, 去除玻璃瓶的封口
膜, 将组培苗从瓶中小心取出, 漂洗清理黏附于苗根上的
培养基和松散的愈伤组织, 漂洗后保持组培苗根部湿润,
迅速假植到含水量60%的营养土(腐植土:珍珠岩=3 : 1,
v/v)中(图 2C)。室内自然光下炼苗3-5天。此时注意保
持营养土表面湿润, 控制室内湿度在70%-80%之间, 温
度 25℃左右, 此条件下幼苗可以健康生长。培养 2周后
移栽入花盆, 转至室外培养。统计幼苗成活率为 85%。
2.4 结果分析
Cook等(1989)分别以海滨锦葵的茎段和成熟胚为外植
体, 进行了海滨锦葵愈伤组织诱导及植株再生实验, 以茎
段为外植体成功地得到了再生植株, 但以成熟胚为外植
体却没有得到再生植株。本实验前期参照该方法以茎
段和成熟胚为外植体, 利用NAA与 2-IP组合进行植株
再生, 但未得到再生植株。随后以胚轴为外植体, 用不
同浓度的IAA和ZT组合试验, 成功地再生了海滨锦葵植
株, 再生率为 64%。
外植体在M1、M2和M3 3种培养基中均能成功诱
导愈伤组织。各种指标显示M1和M3均优于M2, M1
培养基诱导愈伤组织的褐化率最低, 仅为9.70 %, M3培
养基诱导愈伤组织的褐化率为 22.58%。但由于M1所
采用的激素是2,4-D, 在随后进行的不定芽诱导中会导致
畸形苗产生。并且, 愈伤组织的褐化可通过添加抗氧化
物质, 如添加 Vc(高国训, 1999)、吸附剂活性炭(刘用
生和李友勇, 1994)和 PVP(姚洪军等, 1999)等方法解
决。我们的预试验也证明活性炭对海滨锦葵愈伤组织
的褐化有较好的抑制作用。综合考虑, 作者认为以M3
培养基为最佳, 即: MS + IAA 1.0 mg·L-1 + KT 0.3 mg·L-1
+ sucrose 30 g·L-1 + agar 8 g·L-1最适合海滨锦葵愈
伤组织诱导。愈伤组织诱导初期, 生长点切除不净的胚
轴有可能通过生长点直接产生芽, 此时产生的芽会直接
图 1 不同培养基上不定芽的分化频率
Figure 1 Shoot induction frequency on 3 tested media
表 4 培养基对生根培养的影响
Table 4 Effects of media on root induction
10 d 20 d
No. of shoots No. of shoots Mean frequency of No. of shoots Mean frequency of
Medium inoculated rooted root induction (%) rooted root induction (%)
M8 30 11.00 ± 0.577 36.67 ± 0.01 29.00 ± 0.577 96.67 ± 0.01
M9 30 12.67 ± 0.882 42.22 ± 0.03 28.33 ± 0.882 94.44 ± 0.03
每种处理接种 30个不定芽, 每个处理做 3次重复。
Thirty shoots inoculated in each treatment with 3 replicates.
198 植物学通报 24(2) 2007
产生长而弯曲的茎, 而愈伤组织继代培养后进行不定芽
诱导而产生的芽多为丛芽, 两者从产生时间和芽的形态
上均可区分开。
MS培养基是植物组织培养中应用最广泛的一种培
养基。Jin等(2005)报道棉花组织培养的最佳基本培养
基为MSB培养基(包括MS基本培养基的大量元素, 微
量元素和铁盐及B5基本培养基的有机成分)。由于棉花
与海滨锦葵同属锦葵科, 所以本实验设计了MS与MSB
的生根诱导的对比实验。结果显示, 海滨锦葵不定芽生
根诱导在MS培养基和MSB培养基中的诱导差异不大,
在MSB培养基中生根量较大, 但在MS生根培养基上茎
叶的生长情况较好。
参 考 文 献
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图 2 海滨锦葵的植株再生
(A) M7培养基上的不定芽分化;
(B) M8培养基上的生根情况;
(C) 再生植株
Figure 2 Plant regeneration
of Kosteletzkya virginica
(A) Shoot induction on M7 medium;
(B) Root induction on M8 medium;
(C) Regenerated plant
199郑熙等: 海滨锦葵胚轴愈伤组织诱导及植株再生
(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: ruan@dlnu.edu.cn
Callus Induction and Plant Regeneration from Embryo Exes of
Kosteletzkya virginica
Xi Zheng1,2, Xueying Wang1, Ying Shan1, 2, Hua Jin2, Chengjiang Ruan2*
1Biological Science and Technology College, Shenyang Agriculture University, Shenyang 110161, China
2College of Life Sciences, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China
Abstract The embryo exes of Kosteletzkya virginica were used as explants for induction of callus, buds and roots on nine
culture media with different hormone combinations. The best results were achieved on the following media: (1) 93.94% callus
induction on MS medium supplemented with 1.0 mg.L-1 IAA, 0.3 mg.L-1 KT, 30 g.L-1 sucrose and 8 g.L-1 agar; (2) 65.83% shoot
induction on MS medium supplemented with 0.1 mg.L-1 IAA, 0.5 mg.L-1 ZT, 30 g.L-1 sucrose and 8 g.L-1 agar; and (3) 96.67%
rooting on MS medium containing 30 g.L-1 sucrose and 8 g.L-1 agar. The survival rate of the plantlets was 85% after being
transplanted into soil.
Key words embryo exes, Kosteletzkya virginica, plant regeneration, tissue culture
Zheng X, Wang XY, Shan Y, Jin H, Ruan CJ (2007). Callus induction and plant regeneration from embryo exes of Kosteletzkya
virginica. Chin Bull Bot 24, 194-199.
中国植物学会古植物学分会第 1 1 届学术讨论会
为了进一步拓展我国古植物学的研究事业, 促进学科之间的交叉和同行之间的交流与合作, 中国植物学会古植物学分会
将于 2007年 3月 23-26日在珠海召开第 11届学术讨论会。本次会议由中国植物学会古植物学分会主办, 中山大学生命科
学学院和广东省植物学会承办, 珠海淇澳 -担杆岛省级自然保护区协办。组委会诚邀从事古植物学和相关学科研究的同仁参
会交流。
会议日程
3月 23日 在中山大学(珠海校区)报到
3月 24日 学术交流研讨
3月 25日 珠海近海岛屿生态及红树林植被考察
3月 26日 参观澳门世界文化遗产及博物馆
会务费
(1)只参会、不参加考察: 100元
(2)参会并参加珠海考察: 200元
(3)全程参加会议及考察: 500元
联系方式
通讯地址: 广东省广州市新港西路 135号 中山大学生命科学学院 邮编: 510275
联系人: 金建华 博士, 廖文波 博士
电话: 020-84113348, 84115882(O); 传真: 020-84034957
手机: 13924215068
E-mail: Lssjjh@mail.sysu.edu.cn ; Lsslwb@mail.sysu.edu.cn
会议第一轮通知详见中国植物学会网站 www.botany.org.cn