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Somatic Embryogenesis of Immature Embryos in Pinus armandii

华山松胚性愈伤组织诱导与幼胚离体培养



全 文 :植物学通报 2006, 23 (2): 186~191
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-06-28; 接受日期: 2005-12-26
基金项目: 国家杰出青年科学基金(30325006)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: jiacai79@yeah.net
.组织培养简讯.
华山松胚性愈伤组织诱导与幼胚离体培养
贾彩风* 李悦
(北京林业大学生物科学与技术学院林木花卉遗传育种教育部重点实验室 北京 100083)
摘要 探索华山松(Pinus armandii)体细胞胚胎发生技术对其实施规模化无性繁殖和开展遗传转化具有
重要意义。本文以1/2LM为基本培养基, 通过激素调节等措施对华山松的胚性愈伤组织诱导和幼胚的离
体培养技术进行了初步研究。研究结果: 胚性愈伤组织诱导率最高可达52.71%, 但愈伤组织继代培养后
没有体细胞胚胎的分化; 首次从其子叶期的幼胚中直接诱导出具有根和茎的完整植株, 诱导率达92%以
上。文章确认了采集的幼胚发育状态对胚性愈伤组织的诱导有重要影响, 并对诱导的培养条件等进行了
探讨。
关键词 华山松, 体细胞胚胎发生, 幼胚, 早熟萌发
Somatic Embryogenesis of Immature Embryos in
Pinus armandii
Caifeng Jia*, Yue Li
(Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education,
College of Biological Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083)
Abstract Performing clonal propagation and developing the genetic transformation for exploring
somatic embryogenesis is important. We studied the embryonic callus induction and culture in vitro
of immature embryos by hormone control and produced embryogenic calli on 1/2 LM medium, with a
high induction rate of 52.7%, but calli were not differentiated after subculture. We also produced
plantlets directly from cotyledon immature embryos at a rate of 92%. Our studies confirm that embryo
development stages have a great effect on embryonic callus induction, and we discuss the culture
conditions of somatic embryogenesis of Pinus armandii.
Key words Pinus armandii, somatic embryogenesis, immature embryos, precocious germination
体细胞胚胎发生是利用现代遗传操作方法
对树木实施改良的重要平台技术, 具有繁殖效
率高,系数大, 不受自然条件制约, 可作为基因工
程的受体系统等优点。该技术对于繁殖周期
较长且扦插生根困难的针叶树种改良具有更重
要的意义和广阔的应用前景。针叶树种的体
细胞胚胎培养需要经过胚性愈伤组织的诱导, 体
细胞胚胎的发端、成熟和萌发等阶段, 其中胚
性愈伤组织的诱导是其关键环节。自Hakman
和von Arnold(1985)首次报道由欧洲云杉 (Picea
abies)的未成熟合子胚培养中获得体细胞胚并
再生植株以来, 针叶树的体细胞胚发生研究已
取得令人瞩目的进展。据初步统计, 目前已从
冷杉属(Abies)、落叶松属(Larix)、云杉属
1872006 贾彩风 等: 华山松胚性愈伤组织诱导与幼胚离体培养
(Picea)、松属 (Pinus)、黄杉属(Pseudotsuga)
和北美红杉属(Sequvia)等至少 20种不同的针
叶树种中培养产生了体细胞胚。其中欧洲云
杉、火炬松(Pinus taeda)、辐射松(P. radiata)
及北美黄杉(Pseudotsuga menziesii)等树种的体
细胞胚胎诱导和植株再生已用于生产, 稳定的基
因转移及表达调控在这些树种上也获成功(施季
森, 2000)。但作为针叶树中最大的松属等主要
造林和用材树种的体细胞胚胎发生仍有不少困
难(陈金慧等, 2000)。
华山松是我国西部山区的优良速生乡土针
叶树种之一, 也是南部高海拔地区重要的脂和材
两用树种, 综合利用价值较高。通过传统的遗
传改良途径已使多个经济性状得到一定程度的
改良提高, 但其体细胞胚胎发生及其植株再生体
系方面的研究尚未见报道。本文以不同发育
时期的幼胚为外植体, 对华山松体细胞胚胎发生
技术中的胚性愈伤组织诱导和幼胚的离体培养
技术等进行了研究, 为建立该树种离体培养技术
的生物学基础, 促进现代生物技术在其定向遗
传改良中的应用等提供实验资料。
1 材料与方法
华山松(Pinus armandii)的未成熟球果采种
于北京植物园。在雌配子受精 2周后(约 5月
中旬)开始采集球果, 每周采集1次, 直至球果
发育至子叶胚后期时停止。将采回的华山松
球果擦洗干净, 用塑料袋包好后, 于4℃冰箱中
保存1个月, 根据实验设计进行胚性愈伤组织
的诱导。
接种前从球果中取出幼嫩种子, 先用70%乙
醇浸泡0.5~1分钟后, 无菌蒸馏水冲洗3次; 再用
0.1%升汞(HgCl2)表面灭菌10~15分钟, 无菌水冲
洗 5~8次后, 在超净工作台上取出幼胚备用。
1.1 胚性愈伤组织的诱导
以1/2LM为基本培养基, 附加2.0 mg.L-1 2,
4-D 和1.0 mg.L-1 6-BA, 分别以不同发育阶段(即
子叶胚前期、子叶胚时期和子叶胚后期)的幼
胚为外植体, 在25℃暗培养条件下进行华山松
的胚性愈伤组织诱导。培养基中同时附加水
解酪蛋白(CH) 1 000 mg.L-1, 谷氨酰胺(Gln)500
mg.L-1, 肌醇含量为1 000 mg.L-1, 蔗糖含量30
g.L-1, 琼脂含量5 g.L-1, pH值调至5.8~6.2。每
个处理接种的胚个数为 30~50粒, 重复 3次。
从相关资料得知, 松属树种诱导形成的胚
性愈伤组织一般为: 白色、半透明丝状、黏度
高、湿度大且相对疏松(Gupta and Pullman,
1991), 本文以该标准来评价所选择的愈伤组织
是否符合胚性愈伤组织的要求。
1.2 愈伤组织的继代培养
愈伤组织培养约 2周后, 转至原成分不变
的新鲜培养基上进行继代增殖培养。
1.3 子叶期幼胚的早熟萌发
将子叶期幼胚在含激素的1/2LM培养基上
早熟萌发形成的小植株, 与成熟胚在无激素的
LM培养基上诱导形成的幼苗的各项生长性状
(如苗高、茎段粗细和生根等)进行比较。
1.4 小植株的继代培养
以在 1/2LM培养基上诱导的小植株的子
叶、下胚轴、子叶 -胚轴和胚根为外植体, 在
原成分不变的培养基上进行继代培养。
1.5 带子叶茎段的生根培养
将子叶 -胚轴段培养形成的带子叶茎段接
种在 1/2 LM培养基上, 附加不同含量的 IBA
(1.0、2.0、3.0、4.0和 5.0 mg.L-1)和NAA(0、
0.5 mg.L-1)进行华山松的生根诱导试验 , 重
复 3 次。
1.6 子叶期幼胚诱导植株的炼苗移栽
将子叶期幼胚诱导形成的组培苗置于自然
光下炼苗3~5天, 从瓶中小心取出小苗, 将黏附
于苗根上的培养基和松散的愈伤组织进行漂洗
清理, 迅速移入装有已经过灭菌处理的基质的
塑料营养杯中。移栽基质以疏松、排水和透
气性良好的蛭石、河沙或珍珠岩为好, 按一定
比例混合均匀, 以手捏成团且松开不散的潮湿
状态为宜。
188 23(2)
1.7 细胞学形态观察
取少许愈伤组织放于载玻片上, 将载玻片
置于装有湿滤纸的培养皿里, 用1滴醋酸洋红或
苏木精染液染色30分钟后, 加盖玻片并吸去多
余染液, 在光镜下观察愈伤组织的细胞学形态。
2 结果与分析
2.1 不同发育时期幼胚的诱导情况
将华山松各发育时期的幼胚接种到培养基
中, 培养4周后观察诱导情况发现经华山松的幼
胚诱导形成的愈伤组织有2种类型。一种为非
胚性愈伤组织, 颜色浅黄或黄色, 透明或半透明,
结构疏松, 表面湿润而粗糙或显结晶状。在低
倍光学显微镜下观察, 细胞较大, 近圆形。这
种愈伤组织继代培养后只发生体积上的扩增,
没有体细胞胚胎的分化。另一种颜色浅白或
白色、半透明、粘质状且结构较疏松, 表面常
呈透明丝状。在低倍光学显微镜下观察, 细胞
较小, 近圆形, 具较大的细胞核, 胞质浓厚, 为胚
性愈伤组织, 具有分化能力。
实验发现, 子叶胚前期的幼胚对愈伤组织
和胚性愈伤组织的诱导率都最高, 但随着胚逐
渐发育成熟, 愈伤组织的诱导率也逐渐降低; 其
中子叶期幼胚出现早熟萌发现象, 诱导出具有
根和茎的完整植株, 而没有胚性愈伤组织生成
(图1)。研究结果表明, 适宜的球果采集时间对
胚性愈伤组织的诱导非常重要。
2.2 愈伤组织的继代培养
继代培养发现, 浅黄色愈伤组织结构变松
散状, 非透明, 颜色逐渐加深; 白色愈伤组织转
变成乳白色, 结构致密非透明。遗憾的是, 2种
愈伤组织均随继代时间的延长而逐渐变褐, 失去
分化能力。
2.3 子叶期幼胚的早熟萌发
表 1 华山松不同发育时期幼胚的愈伤组织诱导情况
Table 1 Callus induction of immature embryos in different stages of Pinus armandii
Collecting Embryo Callus Embryonic Culture on 1/2LM medium
time development induction (%) callus induction (%)
20 May– Before cotyledon 85.9 52.71 With white, translucent, relax callus
24 June embryo formation
24 June– Cotyledon 32.6 0 Complete plantlet germination at the rate of
1 July embryo 92%, with little brown calli on radicle
1 July– After 96.4 12.86 With buff, opaque, relax callus formation
5 August cotyledon embryo
图 1 华山松幼胚在 1/2 LM培养基上诱导培养
A. 子叶前期胚形成愈伤组织; B. 子叶期胚早熟萌发成苗
Fig. 1 Immature embryos grow on 1/2LM medium of Pinus armandii
A. Calli formed before cotyledon embryo; B. Plantlets germinated from cotyledon embryo
1892006 贾彩风 等: 华山松胚性愈伤组织诱导与幼胚离体培养
早熟萌发(precocious germination), 指在含
有无机盐、有机物和蔗糖的培养基上, 离体培
养的幼胚越过正常胚胎发育阶段, 在未达到生
理和形态成熟的情况下, 萌发长成幼苗的过程
(周维燕, 2001)。本实验对不同成熟状态的胚
诱导植株的生长性状进行比较发现, 由幼胚经过
早熟萌发诱导形成的植株质量较好, 出苗时间
短, 茎段的高度和粗细较均匀, 生根率较高且长
势健壮, 但子叶伸展不大, 胚根处产生少量愈伤
组织后变褐色; 由成熟胚诱导形成的植株则出
苗时间较长, 茎段高矮粗细差异大, 生根率较低
且多生短根(图 2)。这说明不同的胚发育状态
对诱导植株的质量影响较大。
2.4 小植株的继代培养
小植株继代培养 4周后观察发现, 下胚轴
和胚根段在原培养基上逐渐褐化死亡; 子叶段
产生乳白色且质地坚硬的非透明性愈伤组织,
再继代后没有体细胞胚胎和不定芽的分化; 子
叶-下胚轴段的子叶伸展, 叶质变厚, 绿色加深,
胚轴增粗伸长, 木质化程度逐渐加深, 形成带子
叶的茎段, 可用于生根诱导。
2.5 带子叶茎段的生根培养
将华山松子叶-下胚轴段形成的带子叶茎
段接种到生根培养基上, 6周后观察诱导情况。
在本试验所选定的生根培养基及生长调节
剂浓度范围内, 华山松的带子叶茎段基部只萌
表 2 华山松不同成熟状态的胚诱导形成植株的生长性状比较
Table 2 Comparison of plantlets induced by different embryos of Pinus armandii
Embryos Medium Plantlet traits Rooting time (d) Rooting rate (%) Rooting traits
Immature 1/2LM Cotyledon lengthen, 5–7 98 Slim roots at
embryo seedlings with average the length of 1.5
heights of 2.4 cm, stems cm or so
are strong and straight
Mature LM Cotyledon lengthen and 7–10 87 Stubbed roots at
embryo spread, seedlings heights the length of 0.6
vary greatly, stems are cm or so
mediate and curly
注: 壮茎段. 叶片为绿色, 茎粗 1.0 mm以上, 长度为 2.0 cm以上; 中茎段. 叶片为绿色, 茎粗 0.5~1.0 mm, 长度为
1.5 cm以上; 弱茎段. 叶片为浅绿色, 茎粗 0.5 mm以下, 长度为 1.5 cm以下
Note: Strong stems. Green leaves, width more than 1.0 mm, length more than 2.0 cm; Mediate stems. Green leaves,
width 0.5–1.0 mm, length more than 1.5 cm; Slim stems. Jade-green leaves, width less than 0.5 mm, length less than
1.5 cm
图 2 LM培养基诱导形成的苗
A. 成熟胚, LM无生长调节剂; B. 子叶期幼胚, 1/2 LM有生长调节剂
Fig. 2 Plantlets on LM medium of Pinus armandii
A. Mature embryos grew on LM medium; B. Immature embryos grew on 1/2LM medium
190 23(2)
发大量针叶和不定芽, 没有不定根分化, 诱导的
愈伤组织内也没有不定根原基形成。由于培
养基内生长调节剂浓度过高, 对植株生长产生毒
害作用, 随生根培养的时间延长, 茎段和针叶逐
渐黄化干枯, 直至失去生命力(图 3)。
2.6 子叶期幼胚诱导植株的炼苗移栽
从华山松幼胚直接诱导形成的组培苗移栽
2周后, 出现黄化并失水萎蔫现象, 部分植株根
部腐烂致死, 可能由于基质水分过多, 通气不良
影响根部生长导致烂苗。约2周后成活的组培
苗开始转绿, 并出现新梢生长, 成活率达85%以
上, 苗木生长状况良好。
2.7 分析
目前进行体细胞胚胎发生的松柏类植物,
几乎均以合子胚为外植体, 其中又以幼胚为材料
效果较好(Ja in e t a l . ,1995)。Chel iak 和
Klimaszewska(1991)认为在松属植物中, 子叶前
期的种胚最适于诱导体细胞胚胎发生。Attree
和 Fowke(1993)在白云杉、黑云杉(Picea
mariana)及火炬松等树种的体细胞胚胎诱导中
发现, 在胚的不同发育时期, 仅有某一时期内采
集的球果, 可以用于建立良好的体细胞胚胎发生
体系。华山松的花期在 4~5月, 本试验在受精
2周后开始采集未成熟球果, 直至胚发育到子叶
胚后期为止, 观察不同发育阶段的胚外植体对胚
性愈伤组织诱导及体细胞胚胎分化的影响。
表 3 不同生长调节剂的种类和浓度对华山松茎段生根的影响
Table 3 Effects on the stem rooting of Pinus armandii of different hormones and concentrations
No. Concentration (mg.L-1) Rooting induction
IBA NAA
1 1.0 0.5 Axillary buds geminate from cotyledon base while needles lengthen; and stems
grow with little tight buff calli blocks at the base
2 2.0 0.5 Great axillary buds geminate from cotyledon base while needles lengthen; and
stems grow slowly with some relax buff calli at the base
3 3.0 0 Great axillary buds geminate from cotyledon base, and little adventitious buds
grow clustered; stems grow rapidly with little relax buff calli at the base, need-
les are partly browned
4 4.0 0 Great axillary buds and adventitious buds geminate from cotyledon base; stems
grow rapidly with some relax buff calli at the base, needles are partly browned
5 5.0 0 Great axillary buds and adventitious buds geminate from cotyledon base; stems
grow rapidly with some relax buff calli at the base, needles and stems are most-
ly browned
图 3 带子叶茎段在 1/2 LM培养基上进行生根
A. 附加 2.0 IBA+0.5 NAA; B~D. 分别附加 3.0、4.0和 5.0 IBA。单位: mg.L-1
Fig. 3 Root induction on 1/2LM medium from stems of Pinus armandii
A. Supplemented with 2.0 IBA+0.5 NAA; B-D. Supplemented with either 3.0,4.0, or 5.0 IBA. Unit: mg.L-1
1912006 贾彩风 等: 华山松胚性愈伤组织诱导与幼胚离体培养
从收集的资料看, 以幼胚为外植体时, 多数
松属树种的球果采集都在子叶期幼胚发育阶段
前后。如 Lelu等(1999)发现欧洲赤松(Pinus
sylvestris)在球形胚前期能够诱导出胚性愈伤组
织的外植体数最多, 分化率达到22%; 而海岸松
(P. pinaster)只有在胚发育到子叶胚前期时, 诱
导出胚性愈伤组织的外植体数才最多, 分化率达
到 40%。Mathur等 (2000)在喜马拉雅长叶松
(P. roxburghii)的体细胞胚胎研究中发现, 从 6
月13日(幼胚处于子叶胚前期)起开始有胚性愈
伤组织产生, 其中6月24日左右(子叶胚时期)的
胚性愈伤组织的诱导率最高, 至7月8日(子叶
胚后期)以后胚性愈伤组织的诱导率显著下降,
整个采集期内胚性愈伤组织的诱导率曲线呈抛
物线形。Miguel等(2004)从 5月 5日至 7月 30
日期间采集海岸松的幼胚, 结果发现直到6月末
才开始生成胚性愈伤组织, 并且有74%的愈伤
组织是从6月30日至7月16日期间获得的, 其
中7月7日左右处于子叶期以前的幼胚上获得
的胚性愈伤组织诱导率明显高于胚的其他发育
阶段。类似研究都证明子叶期以前的幼胚更
适于胚性愈伤组织的诱导。本试验的研究结
果也符合多数松属树种以幼胚为材料诱导体细
胞胚胎发生的规律。
以华山松子叶期幼胚为外植体, 在1/2LM
培养基上培养时, 能诱导出具有根和茎的完整植
株, 且植株质量较由成熟胚诱导形成的好。虽
然其繁殖系数较体细胞胚胎发生技术低, 但也可
以作为遗传转化的受体系统, 对提高其改良效率
具有重要意义。
外植体的遗传特性、发育状态和生长调
节物质等被普遍认为是影响体细胞胚胎发生的
主要因子。本试验虽对不同胚发育阶段的华
山松进行体细胞胚胎发生试验, 并成功诱导出
了胚性愈伤组织, 但继代培养后愈伤组织多发生
褐化, 失去胚性特征, 未能分化成体细胞胚胎。
由于华山松等针叶树种中含有较多的松脂类物
质阻碍其对外源激素和营养物质的吸收, 导致该
树种的体细胞胚胎形成机制比较复杂, 其关键的
代谢调节物质和调控环境等还需进一步摸索。
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(责任编辑: 孙冬花)