全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 526-532, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-12-20; 接受日期: 2008-04-10
基金项目: 中国科学院知识创新工程重要方向项目(No.KSCX2-Y W-N-007) 和 863 计划(No.2006AA 10A 213和No.2007AA 091600)
* 通讯作者。E-mail: dyguang@gmail.com
.研究论文.
壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成基因转录的影响
王文霞 1, 2 , 李曙光 1 , 赵小明 1 , 林炳承 1 , 杜昱光 1 *
1中国科学院大连化学物理研究所, 大连 116023; 2中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要 采用RT-PCR方法研究了不同浓度壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成酶基因的转录调控。结果表明, 50 mg.m L-1壳
寡糖能够明显诱导烟草悬浮细胞茉莉酸合成途径的关键酶——磷脂酶A2、13-脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化
物环化酶和12-氧-植物二烯酸还原酶基因的表达, 而且该浓度的壳寡糖对这些基因的诱导作用相同(似)。在实验设定时间内均
诱导表达编码磷脂酶A2的基因, 对其它基因的诱导时间均为8小时, 表明50 mg.m L-1壳寡糖在诱抗过程中启动了茉莉酸合成
途径。而200 mg.mL-1壳寡糖的处理对这些基因的表达无显著影响。表明不同浓度的壳寡糖对烟草悬浮细胞的作用模式存在
差异, 且高浓度的壳寡糖在烟草悬浮细胞中启动的信号通路可能没有茉莉酸信号的参与。
关键词 诱导抗病性, 茉莉酸, 壳寡糖, 烟草悬浮细胞
王文霞 , 李曙光 , 赵小明 , 林炳承 , 杜昱光 (2008). 壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成基因转录的影响. 植物学通报 25, 526-532.
茉莉酸(jasmonic acid)是一种植物激素, 广泛存在
于植物界, 具有多种生物学功能(Creelman and Mullet,
1997; Halim et al., 2006)。植物受到昆虫或食草动物
攻击、机械伤害、病原菌感染时, 体内的茉莉酸含量
显著增加(Ziegler et al., 2001; Wasternack et al., 2006),
继而作为信号分子, 引发诱导性系统抗病(induced sys-
temic res istance, ISR)。茉莉酸是由亚麻酸(linolenic
ac id)经十八碳途径(octadecanoid pathway)合成而来。
亚麻酸在 13-脂氧合酶(13-l ipoxygenase, 13-LOX)的作
用下, 在碳链的 13位置上加分子氧, 生成氢过氧化亚麻
酸, 再在丙二烯氧化合酶(allene ox ide synthase, AOS)
的作用下, 生成不稳定的环化物, 该环化物再由丙二烯氧
化环化酶(allene oxide cyc lase, AOC)作用生成12-氧-
植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic ac id, 12-OPDA), 之
后12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic ac id
reductase, OPR)催化 12-OPDA加氢生成OPC-8:0(3-
oxo-2-[2-penteny l]-cyc lopentane-1-octanoic acid), 再
经过 3次 b-氧化代谢为茉莉酸(Weber, 2002; 吴劲松和
种康, 2002)。许多逆境因子都可以诱导茉莉酸合成过
程中酶的表达, 同时研究表明这些酶的上调和茉莉酸的
累积密切相关(Dhondt et al. , 2000; Halitschke and
Baldwin, 2003; Stenzel et al., 2003; Mei et al., 2006;
Tani et al. , 2007)。因此对茉莉酸合成相关酶的研究也
可以反映出逆境对茉莉酸途径的调控。
寡糖作为植物免疫激活因子的研究始于 20世纪60
年代。1976年 Ayers 等(1976)发现细胞壁的寡糖碎片
能诱导植物植保素(phyt oa l ex i n )的合成。1985 年
Darvil l及其同事发现霉菌细胞壁片段b-葡聚糖能够激活
植物抗性反应, 并且首次提出了寡糖素(oligosaccharins)
这个新概念, 他们认为寡糖素可以激活植物的免疫系统,
诱导植物对逆境产生抗性(Darvil l et al. , 1985)。壳寡
糖是氨基葡萄糖以 b-1, 4-糖苷键连接而成的碱性寡糖,
由几丁质脱乙酰基后, 酸解或酶解得到。壳寡糖在植物
病害防治上具有抑制病原菌侵染、诱导植保素生成及
激发植物自身抗性等作用(Hadwiger et al. , 1994; Khan
et al., 2003; Cabrera et al., 2006), 因此也是应用最广
泛的寡糖素之一。本实验室应用酶解反应膜分离耦合
技术制备得到壳寡糖(Zhang et al., 1999), 聚合度为2-
10, 经大田试验发现对多种植物病害有明显的控制作
用。进一步对其作用机理进行研究发现, 烟草细胞壁及
527王文霞等: 壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成基因转录的影响
质膜上有壳寡糖的结合位点, 壳寡糖可以诱导过氧化氢和
一氧化氮等信号分子的产生, 激活MAPK 途径, 上调抗
性相关酶的活性(Feng et al. , 2006; Yin et al. , 2006;
Zhang et al., 2007; Zhao et al., 2007)。已有研究证明
茉莉酸在植物逆境信号转导过程中发挥着重要作用。本
实验室曾用寡糖处理烟草使其体内茉莉酸含量升高。本
研究进一步探讨了壳寡糖在转录水平上对茉莉酸合成相
关基因的调控作用, 以期阐明壳寡糖的诱抗机理。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 悬浮细胞培养
枯斑三生烟草(Nicot iana tabacum var. samsun NN)悬
浮细胞在MS 液体培养基(3%蔗糖, 0.5 mg.mL-1 2, 4-
D)中继代培养。每14天继代1次, 摇床转速每分钟120
转, 培养温度 25°C, 12小时光照, 光照强度为 36 mol.
m-2 .s-1。细胞培养 12天后, 过滤收集, 重新悬浮于新
鲜培养基中。所有的操作均在无菌条件下进行。
1.1.2 药剂
壳寡糖(oligochitosan), 脱乙酰度>95%, 聚合度为 2-
10, 由中国科学院大连化学物理研究所1805组研制, 配
制成浓度为 50 mg.mL-1的溶液。通过 0.22 mm微孔
滤膜过滤除菌。
1.1.3 分子试剂
RNAISO、rTaq酶和 RNA PCR KIT(AMV) Ver.3.0试
剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 RNA提取及检验
烟草悬浮细胞分别用 50和200 mg.mL-1壳寡糖处理30
分钟后, 过滤收集, 重新悬浮于新鲜培养基中, 再分别于
处理后 1、8和 12 小时过滤收集, 对照细胞加无菌水,
操作步骤相同。所有的过程都在无菌条件下进行。取
悬浮细胞在液氮中研磨, 用 RNAISO(Takara)试剂提取
RNA。(1 )分光光度法定量。分别测定 260和 280 nm
处的吸光值, 计算 A260/A 280 比值以估计总 RNA 的纯
度。通过 A260 的值计算总RNA 的量。(2) RNA 完整性
检测。在 1%琼脂糖凝胶上分离总 RNA, 有 2条清晰的
条带, 且大分子量(28S rRNA)的亮度约为小分子量(18S
rRNA)的 2倍,说明总RNA 完整。
1.2.2 引物设计和目的基因的 RT-PCR扩增
实验设计引物对见表 1。利用 Taka ra的 rTaq酶进行
PCR扩增, 1% 琼脂糖电泳检测。以烟草 Actin基因作
为内标。PCR扩增条件: 95°C变性 5分钟; 95°C 30秒,
50-60°C 30秒, 72°C 1分钟, 25-30个循环; 72°C延
伸 10分钟。取 10 mL RT-PCR产物在 1% 琼脂糖凝胶
上电泳检测。
表 1 引物列表
Table 1 The primers used in the experiments
No. Pr imer sequences(5-3) Optimal cyc le Annealing Genbank
number temperature(°C) No.
1. Pr imers for tobacco NTPAT3 gene AGCTTGGTGAGGA GGGTCA CA
CCTCTCCA GTCAAA TTGTCGTC 25 50 AF158253
2. Pr imers for tobacco LOX gene AATCAGGCTTATCTACCAA
GTCCTCCATGCA GTTTTA 30 50 X84040
3. Pr imers for tobacco AOS gene CGACGGCA AGAGTTTTCC
GATTTCA TCACAGGCATTTTC 30 50 AJ295274
4. Pr imers for tobacco AOC gene GCTTGAGCCAA AAGAATGT
GTGTAAAA TAGCTTGAA AGG 30 50 AJ308487
5. Pr imers for tobacco OPR gene TAA TGCCTGATGGAA CTC
GAA TGTCCCCTGATA CGC 30 50 AJ278332
6．Pr imers for tobacco Actin gene GA TGGTGTCAGCCACA CTGTC
ATGCTGCTAGGAGCCAGTGC 30 60 X69885
528 植物学通报 25(5) 2008
2 结果与分析
2.1 壳寡糖诱导NtPAT3 mRNA水平变化
NtPAT3基因在烟草中的编码产物具有磷脂酶A2 的活
性, 被认为在茉莉酸的合成过程中起重要作用(Dhondt et
al., 2000)。实验检测了浓度为50和 200 mg.mL-1壳寡
糖处理烟草悬浮细胞后不同时间NtPAT3的转录水平变
化, 利用 Image J软件计算灰度, 根据NtPAT3/Actin的
比值对 2次 RT-PCR结果进行量化。结果表明, 50 mg.
mL-1 壳寡糖处理烟草悬浮细胞 1小时后, NtPAT3基因
表达水平就被诱导提高, 并在整个检测时段内持续诱导,
但是与对照相比诱导强度逐渐减弱。而200 mg.mL-1壳
寡糖处理烟草悬浮细胞后, NtPAT3基因表达水平未被
诱导, 与对照水平相当(图 1)。
2.2 壳寡糖影响茉莉酸合成途径其它酶mRNA
水平变化
茉莉酸在植物体内是在一系列相关酶的作用下合成的,
包括 LO X、AO S、AO C和OP R。实验中测试了 50
和200 mg.mL-1壳寡糖处理烟草悬浮细胞后这些酶在不
同时间其转录水平的变化, 利用 Image J软件计算灰
度。根据各个基因与 Actin的比值对 2次 RT-PCR结果
进行量化分析, 发现壳寡糖对茉莉酸合成相关酶在转录
水平上都有调控作用, 但是对不同基因, 具体的作用模式
有所差异。
对于 LOX , 仅在 50 mg.mL-1壳寡糖处理烟草悬浮
细胞后 8小时, 基因表达水平升高。而在其它检测时间
并未被诱导。200 mg.mL-1 壳寡糖处理烟草悬浮细胞
后, LOX基因表达水平在1、8和12小时均未被诱导(图
2)。对照细胞中 A O S 转录水平随时间变化。壳寡糖
对 AOS在转录水平上的作用见图 3。50 mg.mL-1壳寡
糖可以在处理烟草悬浮细胞 8小时后, 诱导AOS转录上
调。而分别用 2个浓度的壳寡糖处理烟草悬浮细胞 1和
12小时后, 在转录水平上对该基因的表达有一定的抑制
作用。用 50 mg.mL-1 壳寡糖处理烟草悬浮细胞, AOC
基因在 8和 12小时表达水平升高; 200 mg.mL-1壳寡糖
可以使AOC基因表达水平在12小时被诱导(图4)。OPR
基因在 50 mg.mL-1壳寡糖处理 8小时后转录水平上调,
而200 mg.mL-1壳寡糖处理对该基因在转录水平上无显
著调节作用(图 5 )。
图 1 壳寡糖处理后烟草悬浮细胞中NtPAT3 mRNA水平变化
Figur e 1 Regulation of the NtPAT3 mRNA express ion in
tobacco suspension cells upon treatment w ith oligochitosan
图 2 壳寡糖处理后烟草悬浮细胞中 LOX mRNA水平变化
Figur e 2 Regulation of the LOX mRNA express ion in tobacco
suspension cells upon treatment w ith oligochitosan
529王文霞等: 壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成基因转录的影响
3 讨论
茉莉酸在植物启动抗性防御反应中发挥重要作用。当
植物体内的茉莉酸累积超过一定量时, 一些抗病防御基
因就会被启动表达。据报道, 低浓度的茉莉酸可诱导蛋
白酶抑制剂、硫素(th ioni n)、渗调蛋白质(os mot i n)、
富含脯氨酸细胞壁蛋白质以及植保素合成过程中的关键
酶, 如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查耳酮合成酶(CHS)等
的表达。此外, 茉莉酸也可调控植物次生代谢物如生物
碱类化合物、萜类化合物和酚类化合物的产生
(G undl ach et al. , 1992; Farmer et a l. , 2003;
Wasternack, 2007)。
壳寡糖已经被证明是一种高效的植物诱抗剂。本
实验室在壳寡糖诱抗机理方面做了大量工作, 包括对结
合位点、信号转导和防御酶的研究等。研究认为壳寡
糖可以诱导茉莉酸的累积, 进而启动相关抗性基因的表
达(Doares et al. , 1995)。本实验室用 50 mg.mL-1 壳
寡糖处理烟草后, 茉莉酸含量升高(杜昱光等, 2003)。本
研究中茉莉酸合成途径的关键酶基因在 50 mg.mL-1壳
寡糖处理后都有一定程度的诱导表达, 进一步证明壳寡
糖诱抗过程中有 JA 信号的参与。提示壳寡糖的作用机
理中存在以茉莉酸为代表的诱导系统获得性抗性, 这与
本实验室前期的实验结果一致。
用 50 mg.mL-1壳寡糖处理有效地提高了烟草悬浮
细胞内编码这些酶基因的表达, 诱导作用相同(似)。在
实验检测时间内对编码磷脂酶 A2的基因持续诱导表达,
图 3 壳寡糖处理后烟草悬浮细胞中 AOS mRNA水平变化
Figure 3 Regulation of the AOS mRNA express ion in tobacco
suspension cells upon treatment w ith oligochitosan
图 4 壳寡糖处理后烟草悬浮细胞中 AOC mRNA水平变化
Figure 4 Regulation of the AOC mRNA express ion in tobacco
suspension cells upon treatment w ith oligochitosan
图 5 壳寡糖处理后烟草悬浮细胞中OPR mRNA水平变化
Figure 5 Regulation of the OPR mRNA express ion in tobacco
suspension cells upon treatment w ith oligochitosan
530 植物学通报 25(5) 2008
对其它基因的诱导时间基本上都为 8小时, 表明信号转
导过程中各个成员之间在作用时间上可能存在一定的时
序性和相关性。此外, 编码磷脂酶 A2的 NtPAT3基因
最初是在烟草花叶病毒侵染烟草后分离得到的, 该基因
在烟草产生对烟草花叶病毒的抗性中发挥作用, 壳寡糖
对该基因的转录调控可能是壳寡糖诱导烟草抗烟草花叶
病毒的一个机制。在上述实验中还同时得到另外 2个基
因 NtPAT1和NtPAT2(Dhondt et al., 2000), 然而壳寡
糖对这 2个基因并没有诱导作用, 表明壳寡糖启动的烟
草抗性信号通路可能和病毒自身侵染烟草引起的通路有
交叉, 但又不完全相同。
实验中作者观察到壳寡糖在某些时间点对一些基因
的转录具有抑制作用。如 50和 200 mg.mL-1壳寡糖在
处理烟草悬浮细胞 1和 12小时后, 对 AOS基因的转录
均有抑制作用。AOS 是不饱和脂肪酸代谢为茉莉酸类
化合物的关键酶, 在植物体内, 不饱和脂肪酸还可以在氢
过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase, HPL)作用下生成
六碳挥发物和十二碳的氧酸类化合物, 或者由二乙烯醚
合酶(divinyl ether synthase, DES)作用生成二乙烯醚
类化合物。这几类物质在植物防御反应中都具有独特
的生物活性(Blée, 2002; Howe and Schilmiller, 2002;
Matsui, 2006; Eschen-Lippold et al., 2007)。植物遭
遇逆境时, 体内各种酶的相对表达量无疑将影响其竞争
作用底物的能力, 从而导致不同逆境因子作用下植物体
内不饱和脂肪酸代谢物组成和含量的差异。壳寡糖对
烟草中茉莉酸合成相关基因的影响是一个复杂的过程,
其中对关键基因转录水平的影响可能在一定程度上反映
出壳寡糖对烟草悬浮细胞中脂肪酸代谢流的控制, 因此
它对 AOS转录的抑制可能是对不饱和脂肪酸代谢 HPL
和DES途径综合作用的结果, 这有待于进一步的实验证
明 。
实验中 2种浓度的壳寡糖处理烟草悬浮细胞后, 对
茉莉酸合成相关酶在转录水平上的调控作用存在差异。
50 mg.mL-1壳寡糖的处理有效地提高编码这些酶的基因
的表达, 而 200 mg.mL-1的壳寡糖几乎没有诱导作用。
前期实验已经发现, 高浓度壳寡糖可诱导烟草悬浮细胞
死亡, 且伴随着类似动物细胞凋亡的形态学特征(Wang
et al. , 2008)。Cabrera等(2006)用壳寡糖处理拟南芥
悬浮细胞, 发现低浓度的壳寡糖可以诱导PAL的活力升
高, 对细胞活力几乎没有影响; 而高浓度的壳寡糖则会引
起细胞死亡, 并且对 PA L的诱导能力下降。结合本实
验结果, 表明不同浓度的壳寡糖可能启动了植物不同的
信号途径, 低浓度的诱导胁迫会启动植物的防御途径, 而
对于高浓度的胁迫, 细胞的应答方式则为启动自身的死
亡程序。
综上所述, 我们利用 RT-PCR方法, 在烟草悬浮细
胞中探讨了不同浓度壳寡糖对茉莉酸合成途径关键基
因的转录调控, 推测壳寡糖可能通过激活茉莉酸途径诱
导了烟草的抗性, 为深入研究壳寡糖诱导抗性机制奠定
了基础。
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Effects of Oligochitosan on Transcription of Genes Involved in
Jasmonic Acid Biosynthesis in Tobacco Suspension Cells
Wenxia Wang1, 2, Shuguang Li1, Xiaoming Zhao1, Bingcheng Lin1, Yuguang Du1*
1Da lia n Insti tute o f Chemical Ph ysi cs, Ch inese Acad emy of Sciences, Da lia n 11602 3, Chi na
2Gradu ate Sch ool , Ch ine se Acad emy of Sciences, Be ijin g 1 000 49, Chi na
Abstr act Oligochitosan prepared by enzymatic hydrolysis of chitosan is a potent plant defense elicitor , but the mechanism of
oligochitosan inducing resistance of plants to pathogens is s till unc lear. In this s tudy , w e applied diff erent concentrations of
oligochitosan to tobacco suspension cells to inves tigate the change in gene expression involved in jasmonic acid biosynthesis.
Semi-quantitative RT-PCR revealed that 50 mg.mL-1 oligochitosan up- regulated the expression of genes encoding phospholipase A2,
13-lipoxygenase, allene oxide synthase, allene ox ide cyclase and 12-oxo-phytodienoic ac id reduc tase in a similar manner. The
gene expression of phospholipase A2 w as increased over time, w hereas inc reased expression of the other genes appeared at 8
h after treatment. These results show ed that the jasmonic acid biosynthesis pathw ay can be triggered by 50 mg.mL-1, rather than
200 mg.mL-1, oligochisan suggesting that the action of oligochitosan in tobacco suspension cells w as dose dependent, and that a
higher concentration of oligochitosan may activate a defense response w ithout the participation of jasmonic acid.
Ke y w ords in duced d ise ase re sistance, jasmoni c a cid , o lig ochi tosan, to bacco susp ension cel ls
Wa ng WX, Li SG, Zhao XM , Lin BC, Du YG (20 08 ). E ffects o f ol ig ochi to sa n on t ra nscrip ti on o f ge ne s in vo lved i n ja sm on ic a ci d
bi osynthe sis in to bacco susp ension cel ls. Ch in Bull Bo t 25 , 52 6-53 2.
* Author for correspondence. E-mail: dyguang@gmail.com
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