全 文 ：植物学通报 2006, 23 (4): 334~340
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2006-03-24; 接受日期: 2006-05-08
基金项目: 陕西省自然科学基金(2004C110)、陕西省教育厅专项(06JK176)和西北大学校内基金(04NW36)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: jiajf38@nwu.edu.cn
.研究论文.
烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探
王英娟 步怀宇 李多伟 贾敬芬*
(西北大学生命科学学院 西安 710069)
摘要 茄尼醇是合成泛醌类药物的重要中间体。以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)W.T15834感
染烟草叶片诱导产生毛状根, 探讨其茄尼醇含量变化。结果显示, 获得的毛状根能在无外源生长调节剂
的MS固体和液体培养基上自主生长, 但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速, 也不会形成愈伤组
织。甘露碱检测及PCR结果证实, 发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在烟草(Nicotiana tabacum)毛状根基因
组中整合并得到表达。用改进的HPLC法测定烟草毛状根中的茄尼醇含量, 其结果为对照根(种子萌发产
生的幼苗根)的1.12倍, 但仍比废弃烟叶中茄尼醇含量低43.2％。
关键词 烟草, 发根农杆菌, 毛状根, 茄尼醇
Preliminary Study of the Induction of Transformed Hairy Roots
and Solenesol Content in Nicotiana tabacum
Yingjuan Wang, Huaiyu Bu, Duowei Li, Jingfeng Jia*
(College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069)
Abstract Solanesol is an important material for synthesizing ubiquinone. An efficient transforma-
tion system was established in Nicotiana tabacum by use of Agrobacterium rhizogenes W.T15834.
The content of solanesol was detected. Hairy roots could grow normally on solid or liquid MS
medium without a growth regulator. However, the hairy roots grew rapidly and no callus formed
during subculture in liquid medium. The transformation of hairy roots was confirmed by PCR and
mannopine assay. By use of improved HPLC, we obtained a content of solanesol of almost 43.2% in
hairy roots that was 1.12 times that in roots of tobacco seedlings, but still lower than that in discarded
tobacco leaves; the content of solanesol is normally higher in liquid culture than in solid culture. This
study aims to provide a basis for future research in taking advantage of hairy root technology to
produce solanesol.
Key words Nicotiana tabacum, Agrobacterium rhizogenes, hairy roots, solanesol
1982年, Chilton等(1982)首次报道了发根农
杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) Ri 质粒在感
染植物细胞时, 通过细菌和植物细胞之间的附
着, Vir基因(virulencegene)的激活和表达, 其T-
DNA(transferred DNA)片段被转移、插入并稳
定地在植物细胞基因组中表达, 诱导植物细胞产
生毛状根(hairy roots)。与培养细胞相比,毛状
根培养具有激素自主性快速生长、分化,次生
3352006 王英娟 等: 烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探
代谢物种类多、含量高,遗传性稳定,且在基因
转移过程中无需标记基因等优点 (Flores et a1.,
1987)。这些优点使毛状根在生产植物次生代
谢物和传统中药材有效成分方面具有很大的工
业化生产潜力(芮和恺,1997)。因此毛状根培养
技术出现之后受到了越来越多的学者的重视,并
取得了飞速的发展(刘春朝等,1998)。烟草
(Nicotiana tabacum)不但是一种重要的经济作
物,而且它的次生代谢物质丰富,作为药用植物
具有很高的开发利用价值。烟草中含有的萜
类化合物茄尼醇(solanesol)有抗菌、消炎、治
疗心血管疾病及抗溃疡等药用功效, 也是重要的
医药中间体(孙心齐等, 1995), 主要用于合成维生
素K2及辅酶Q10(治疗心脏病的药物)和抗癌增
效剂SDB等(陈炳志等, 1999)。
目前合成辅酶Q10所需的茄尼醇市场缺口
很大, 加之其他药用需求, 使得茄尼醇的主要来
源——现有烟草野生资源, 难以满足制药工业的
市场需求(郑奎玲和余丹梅,2004)。至今为止,
很少见利用发根农杆菌转化的烟草毛状根来生
产茄尼醇等药用成分的报道。本文报道含甘
露碱型Ri质粒的发根农杆菌W.T15834对烟草
毛状根的诱导和培养及毛状根中茄尼醇产生的
实验结果, 为烟草发状根的大量培养和提高次生
代谢茄尼醇含量奠定技术基础。
1 材料和方法
1.1 细菌菌株及培养
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌
株W.T15834为陕西省生物技术重点实验室保
存菌种。
将发根农杆菌W.T15834在YEB培养基上
暗培养后, 挑取单菌落, 25℃活化, 28℃黑暗振荡
(160～200 g) 培养12小时, 测定 OD600值为0.8
时供感染用。
1.2 外植体制备
烟草(Nicotiana tabacum)品种为渭南种植
的烤烟07。将种子用70%乙醇灭菌10秒,再用
0.1% HgCl2水溶液(加少许吐温80)灭菌10分钟,
然后用无菌水冲洗5～6次,用无菌滤纸吸去表
面水珠,接种到MS 培养基(Murashige and
Skoog, 1962)上, 在(25±27)℃,光强2 000 µmol.m-2 .
s-1(每日光照 12小时)的条件下萌发产生无菌
苗。取 20天龄无菌苗的幼嫩叶片(顶芽起第 2
及第3叶)切成约1.0 cm×1.0 cm 大小的具或不
具叶柄的叶片外植体, 并置于MS培养基上预培
养 24小时后, 用于转化。
1.3 毛状根的诱导和培养
参考叶盘转化法(Horsch et al., 1985)。将
上述预培养 24小时的烟草叶片外植体浸入用
MS培养基稀释5倍的菌悬液中轻轻振荡10分
钟取出, 用无菌滤纸吸去多余菌液并放回原培养
基上, 在黑暗条件下继续培养, 3～4天后, 转入
含有400 mg.L-1头孢噻肟钠(cefotaxime)的MS
培养基, 在25℃ 每天14小时散射光条件下培养
诱导毛状根。
切取从叶片外植体切口中脉处产生的毛状
根, 置于上述培养基中除菌培养, 7天继代1次,
逐渐降低抗生素浓度, 经5～6次除菌继代培养
后获得无菌毛状根。取等量的无菌毛状根分
成2份(每瓶0.5 g鲜重), 1份接种在MS固体培
养基上, 于26℃恒温培养箱中进行暗培养; 另1
份接种到MS液体培养基中, 26℃, 100 g恒温振
荡培养。培养 15天后, 取出毛状根, 去离子水
洗涤 5次, 再用灭菌的滤纸吸干水分后测量鲜
重; 对鲜重样品在50℃恒温干燥, 40小时后测量
干重; 同时测定鲜重和干重样品的茄尼醇含量。
上述各实验均在40 mL培养基环境下(100
mL的三角瓶)进行, 每组处理进行3次平行试验,
以减少误差。
1.4 转化毛状根的鉴定
1.4.1 甘露碱的检测 参考王关林和方宏筠
(1998)的检测方法。以试管苗的正常根为阴性
对照, 甘露碱标准品(1.02 mg.L-1)为阳性对照。
336 23(4)
转化毛状根、种子萌发产生的幼苗根各 100
mg(每组设 2个重复)。纸电泳结果照相记录。
1.4.2 毛状根的 PCR检测
1.4.2.1 植物DNA提取 用微量CTAB提取
方法(Clark, 1998), 从毛状根和种子萌发产生的
幼苗根中提取植物总DNA, 纯化后用作PCR扩
增的模板。
1.4.2.2 发根农杆菌Ri质粒 DNA提取 取
200 µL活化的发根农杆菌菌株W.T15834菌液,
3 200 g离心5 分钟,收集沉淀菌体, 加入40 µL
裂解液(华美工程公司), 悬浮混匀, 94℃裂解15
分钟, 13.2×104 g离心5分钟,取上清液备用。并
取少量上清液测其OD600值为 0.8。
1.4.2.3 PCR检测 Ri质粒TL-DNA上存在的
与毛状根发生相关的 4个基因为 rolA、rolB、
rolC和rolD (Cardarelii et al., 1987)。为了找到
转化的最直接的分子证据, 我们根据rolB基因
设计特异引物。上游引物: r o l . . . 5 C G A
GATATATGCCAA- ATTTACACTAG 3...; 下游
引物: rol . . .5 CGT GTTAACAAAGTAG-
GAAACAGG 3...。以此PCR引物(由上海生工
技术公司合成)进行 PCR 反应: 在含 2 µL Taq
DNA聚合酶(IU)的硅化离心管中加入 1.5 µL
20×PCR缓冲液、0.9 µL 50 mmol.L-1 Mg2+、
0.625 µL 10 mmol.L-1 3×dNTP、0.625 µL 10
mmol.L-1 dNTP、两种引物各 1 µL和 2 µL模
板DNA, 加无菌重蒸水至终体积30 µL, 混匀并
离心, 再加 50 µL石蜡油。在自动PCR仪上进
行PCR扩增, 参数如下: 94℃变性 45秒; 45℃
退火55秒; 72℃反应60秒; 共30次循环; 最后
72℃延伸反应10分钟。预期产物大小为564
bp。扩增产物采用 1.0％琼脂糖凝胶电泳进
行分析。
1.5 毛状根茄尼醇含量的测定
用改进的赵瑾等(1997)的方法进行毛状根
中茄尼醇的提取。精确称取1 g干重的毛状根,
加入正己烷20 mL热回流提取60分钟, 浓缩后
用无水乙醇定容到10 mL作为样品液, 上样前
2 300 g离心15分钟, 取上清液进行HPLC的测
定。每个实验重复 3次, 每次测定做 3组平行
试样取平均值。
用改进的武永昆等(2005)的HPLC法测定
毛状根中茄尼醇含量。采用1525型高效液相
色谱系统(美国Waters公司), 反相硅胶色谱柱
SymmetryC18 (5 mm, 4.6 mm×150 mm)。检测
波长为215 nm , 甲醇:无水乙醇=1:1.5 (V/V), 流
速为1.5 mL.min-1, 灵敏度2.00 AUFS。进样
量为 20 µL。
2 结果
2.1 烟草毛状根的诱导和培养
发根农杆菌感染的叶片外植体培养7天后,
从其叶片切口中脉处产生毛状根; 同时还观察
到被农杆菌感染的叶柄切口处产生的愈伤组织
上可直接产生毛状根(图1A)。培养20天后, 外
图 1 烟草毛状根的诱导和培养
A．感染 7天后; B．感染 20天后; C．在固体MS
培养基上培养 15天; D．在液体MS培养基上培养
15天
Fig. 1 Induction and culture of hairy roots of Nicoti-
ana tabacum
A. Hairy roots from leaf explants 7 days after inocula-
tion with Agrobacterium rhizogenes 15834; B. Hairy
roots from leaf explants 20 days after inoculation with
A. rhizogene 15834; C. Hairy roots cultured on growth
MS medium for 15 days; D. Hairy roots cultured in
liquid MS medium for 15 days
3372006 王英娟 等: 烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探
植体产生毛状根数量增多, 其产生频率约为
65.3% (图1B)。将叶片外植体切口中脉处产生
的毛状根切下并置于MS+400 mg.L-1头孢噻肟
钠中除菌培养, 每隔7天左右转接1次, 5～6次
后即可完全除菌。无菌的毛状根可在MS固体
或液体培养基上快速自主生长, 分枝较多(图1C,
D)。未感染的烟草叶片外植体在MS+400 mg.
L-1头孢噻肟钠的培养基上培养 1个月后无一
生根, 仅从部分叶片的形态学下端切口中脉处或
叶柄切口处产生少量浅黄绿色致密的突起; 且无
菌苗的离体根不能在MS培养基上自主生长并
随着培养时间的延长逐渐褐化坏死。
2.2 固体培养和液体培养对毛状根生长的
影响及生长曲线的测定
研究固体培养和液体培养方式对烟草毛状
根生长的影响, 结果如图2所示, 无菌的毛状根
在固体或液体培养基上均能快速生长, 但在液体
培养基中的生长速度比固体培养基的要快, MS
液体培养条件下生长速度最快。继代 2次后,
MS液体培养的毛状根的鲜重和干重分别为
MS固体培养的2.20和1.78倍; 另外, MS液体
培养的毛状根的鲜重和干重分别为1/2MS液体
培养的1.28和1.38倍, 可见, MS液体培养效果
优于MS固体培养和1/2MS液体培养。但同时
观察到, 在液体培养基中培养24天后, 毛状根的
老根段(起始根段)已严重褐化, 培养基变混浊;
而生长在MS固体培养基上的烟草毛状根培养
至30天后老根段才开始变褐, 或产生少量呈念
珠状的愈伤组织。另外由于烟草发状根比较
脆弱, 生长时有一些深入在固体培养基中。
以培养时间为横坐标,毛状根的生物产量为
纵坐标作生长曲线(图3), 可以看出烟草毛状根
的生长可基本分成3个阶段, 即前2周为快速生
长阶段,3～5周为持续增长阶段, 5周以后生长
速度减慢。由此可见,烟草毛状根培养的最佳
继代培养时间为 4周。
2.3 甘露碱的检测
纸电泳检测结果(图4)表明, 转化的毛状根
提取物中含有特异产物甘露碱, 而未转化的正常
根(阴性对照)提取物中没有检测到甘露碱。说
明发根农杆菌Ri质粒TR-DNA(T-DNA右臂)区
中编码冠瘿碱合成酶的基因已整合到烟草基因
组DNA中, 并且在烟草细胞中得到表达。
2.4 毛状根中rol基因的PCR扩增
rolB是发根农杆菌Ri质粒TL-DNA(T-DNA
左臂)上的一个生根基因。本实验中, 我们利用
rolB的PCR引物, 以烟草毛状根的基因组DNA
为模板, 从毛状根的总DNA中扩增到期望的
图 2 固(液)体培养对烟草发根生物量的影响
Fig. 2 Effects of solid and liquid culture on the
biomass of Nicotiana tabacum hairy roots
图3 烟草发根液体和固体培养条件下的生长曲线
Fig. 3 Grow curve of ginseing hairy roots in liquid and
solid condition
338 23(4)
560 bp左右的特异性DNA片段, 而未转化根的
总DNA中扩增不到任何片段(图 5)。这说明,
发根农杆菌的含 rol基因的RiTL-DNA部分已
在烟草基因组中整合。
2.5 烟草毛状根茄尼醇含量
2.5.1 茄尼醇标准曲线的确定 精密称取茄
尼醇标准品(陕西省皓天生物公司, 质量分数
92.97%)107.56 mg, 置100 mL容量瓶中, 加无水
乙醇溶解并用无水乙醇定容, 摇匀, 制成1 mg.
mL-1对照品溶液。精密移取适量上述溶液于
5 mL容量瓶中, 加色谱流动相稀释至刻度, 配成
茄尼醇浓度分别为 0.05、0.10、0.15、0.20、
0.25和0.30 mg.mL-1的系列浓度对照品溶液, 按
色谱条件依次进样平行测定 3次(均进样 10.0
mL), 记录峰面积。线性关系用外标峰面积法测
定, 以平均峰面积Y对浓度C(mg.mL-1)进行线
性回归, 茄尼醇回归方程和相关系数分别为Y =
332 368X-8 563.1,r = 0.9998, 得知茄尼醇含量在
0.05～0.30 mg.mL-1范围内线性关系良好。
加样回收率试验时, 精密称量已测含量
(0.29%)的废弃烟叶粉0.5 g, 共6份, 每份准确加
入茄尼醇对照品1.52 mg, 按1.5节中的方法制
备供试品溶液后, 进行测定。茄尼醇的平均加
样回收率为97.8%, RSD=1.2%。
2.5.2 烟草毛状根茄尼醇含量 将烟草毛状
根在MS液体培养基上培养20天后, 取样进行
茄尼醇含量的HPLC分析测定, 结果如图 6所
示。与对照根(种子萌发产生的幼苗根)相比,
毛状根合成茄尼醇的含量是非转化对照根的
图 4 烟草毛状根中甘露碱的检测
1.标准品; 2,3.转化毛状根; 4,5.未转化根; NS. 中性
糖; M. 甘露碱
Fig. 4 Detection of mannopine in hairy roots of
Nicotiana tabacum
1. Standard mannopine; 2, 3.Fresh hairy root extracts;
4, 5. Nontransformed root extracts. NS. Neutral sugars;
M. Mannopine.
图 5 遗传转化体 rolB基因 PCR产物的电泳图
1. Ri质粒阳性对照; 2. 转化毛状根; 3. 未转化根
Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of PCR products
of rolB gene in transformed roots
M. Marker,1kb DNA ladder; 1. Fragment from Ri
plasmid with rolB primers; 2. Fragment from hairy
roots with rolB primers; 3. Nontransformed roots with
rolB primers.
图 6 HPLC法测定的茄尼醇含量
A.转化毛状根; B.未转化根; C.野生烟叶
Fig. 6 Solanesol content by HPLC detection
A. Hairy roots transformed by Agrobacterium
rhizogenes 15834; B. Non-transformed roots; C. Leave
from wild type Nicotiana tabacum plants
3392006 王英娟 等: 烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探
1.12倍。同时, 我们还测定了废弃烟叶中的茄
尼醇含量, 结果显示毛状根中的茄尼醇含量比废
弃烟叶中茄尼醇含量低 43.2％。
2.5.3 固体培养和液体培养对毛状根中茄
尼醇含量的影响 培养 20天后, 取固体培养
和液体培养的毛状根测定茄尼醇含量。如图2
所示, MS固体培养的毛状根茄尼醇含量分别比
MS液体培养和1/2MS液体培养的低8.22%和
4.39%, 而且MS与1/2MS液体培养相比, MS液
体培养比1/2MS液体培养的毛状根茄尼醇含量
高 3.67%。
3 讨论
通过野生型发根农杆菌感染烟草产生毛状
根, 并将发状根作为培养体系积累烟碱等目的产
物的研究已有报道(Christen et al., 1992), 但以烟
草毛状根作为培养体系积累茄尼醇的研究目前
未见有报道。我们以烟草叶片外植体为材料,
利用含甘露碱型 R i 质粒的发根农杆菌W .
T15834建立了发根农杆菌对烟草的遗传转化系
统, 获得了可在无外源生长调节剂的培养基上自
主生长的烟草毛状根; 同时研究了烟草毛状根
在不同培养条件下的生长速度,发现烟草毛状根
更适宜MS液体培养; 首次获得具有比非转化
自然根(种子萌发产生的幼苗根) 的茄尼醇积累
量高的毛状根, 在后期的继代培养中, 3次跟踪
检测毛状根中的茄尼醇含量平均为1.573 mg.g-1
DW, 说明毛状根中的茄尼醇含量继代基本稳
定。有研究证实烟叶采收一段时间后, 游离态
的茄尼醇的量逐渐增多, 而化合态的茄尼醇逐渐
减少 (Bharati, 2000)。同时在不同的生长季节
及不同产地的烟草, 其有效成分(如茄尼醇)的含
量与组成相差各异(另文报道)。我们初步认
为, 造成茄尼醇含量差异的原因可能与产地及采
收季节及生药制备过程中的损失以及与Ri 质粒
T-DNA片断的遗传转化对烟草细胞次生代谢的
影响等因素有关。
本实验在参考前人的HPLC方法检测茄尼
醇的含量时, 改进了高效液相的流动相, 使出峰
时基线稳定, 检测效果较好,这也为茄尼醇含量
的HPLC检测提供了又一可行的方法。
本实验获得的具有较高茄尼醇产率的毛状
根, 为今后利用毛状根技术来进行茄尼醇的生产
奠定了初步的实验基础。但如何提高毛状根
生长速率和茄尼醇的含量, 尚待进一步研究。
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中国遗传学会功能基因组学研讨会(第一轮通知)
为把握近两年来基因组学研究的最新动态, 加强国内外同行的沟通与交流, 定于2006年10月13~18
日在成都召开“中国遗传学会功能基因组学研讨会”。会议将邀请贺林、薛勇彪、杨焕明、Jurg Ott
(美国)等国内外知名专家围绕基因组学各领域的新进展作专题学术报告。大会组委会诚挚邀请国内外广
大基因组学工作者以及研发人员参加本次盛会。
一、会议主题 1. 基因组学最新研究进展; 2. 基因组学与药物研发; 3. 基因组学与系统生物学; 4.
基因组学与人类重大疾病的分子诊断和分子病理; 5. 动植物基因组学; 6. 基因组学与生物芯片; 7. 生物
信息学; 8. 蛋白质组学及转录组学。
二、组织机构 1. 主办单位: 中国遗传学会基因组学专业委员会, 中国遗传学会国际交流委员会;
2. 承办单位: 电子科技大学; 3. 协办单位: 四川省遗传学会, 四川大学, 四川农业大学, 《遗传学报》杂
志, 《遗传》杂志, 上海市医学会医学遗传学分会; 4. 支持媒体: 中国遗传网, 生物通网站, 中国生物器
材网; 5. 大会主席: 中国遗传学会基因组学专业委员会主任贺林院士, 中国遗传学会国际交流委员会主任
杨焕明教授。
三、会议征文
本次会议以“大会专题报告”和“分组学术交流”两种方式进行。征文格式按《遗传学报》
或《遗传》 (www.chinagene.cn) 的格式撰稿, 全文 6000~10000字 (含摘要、图表、文献)。
四、会议注册 正式代表注册费 700元, 学生代表 500元。住宿费: 标准间 80~100元 /日。
五、会议参展 本次会议将提供 10余个展台供厂商展示产品。每个展位收费 5000元, 免 2人会
议注册费。
六、会议时间 2006年 10月 13日报到, 14~18日学术交流及考察。
七、会议地点 成都市建设北路二段四号, 电子科技大学宾馆
八、报名与参展联系人
电子科技大学生命科技学院 杨足君、史青老师, 邮政编码: 610054;
E-mail: yangzujun@uestc.edu.cn, 电话: 028－83206556, 传真: 028－83206124