全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 469-475, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-10-25; 接受日期: 2008-01-20
基金项目: 863计划(No. 2006A A100105)
* 通讯作者。E-mail: lif ug@cricaas .com.cn
.专题介绍.
棉花体细胞胚胎发生的研究进展
武秀明, 刘传亮, 张朝军, 李付广 *
中国农业科学院棉花研究所, 农业部棉花遗传改良重点开放实验室, 安阳 455004
摘要 经过30多年的发展, 已经在多个不同的棉花品种中获得了体细胞胚, 并再生成苗。但由于体细胞胚胎发生往往受多种
因素影响, 如何从愈伤组织高效率地转化为胚性愈伤组织依然是限制棉花组织培养与遗传转化的关键问题之一。本文概述了
棉花体细胞胚胎发生的研究进展, 分别从棉花体细胞胚胎发生的起源、影响棉花体细胞胚胎发生的内外因素以及寻找棉花体
细胞胚胎发生特异表达基因等几方面进行综述, 并对研究中存在的问题进行了讨论。
关键词 棉花, 影响因素, 体细胞胚胎发生, 组织培养
武秀明 , 刘传亮 , 张朝军 , 李付广 (2008). 棉花体细胞胚胎发生的研究进展. 植物学通报 25, 469-475.
棉花是世界主要经济作物之一, 在发展国民经济、
保障人民生活和国防建设中起着重要的作用。我国棉
花生产的发展一直都与新品种培育和推广密切相关。
近年来, 组织培养以及以此为基础的转基因技术逐渐受
到了人们的广泛关注。这项技术具有不受亲缘关系限
制、可充分利用自然界的遗传资源和加快育种进程等
优势, 为我国棉花产业的发展提供了一条新的途径。目
前, 虽然棉花组织培养再生的研究取得了很大进展, 已建
立起陆地棉(Trolinder and Goodin, 1987)、海岛棉(李
仁敬等, 1993)、克劳茨基棉(Zhang et al., 1996)棉种
的再生体系, 但依然存在着技术瓶颈, 即如何从愈伤组织
高效率地转化为胚性愈伤组织, 继而得到再生植株。本
文主要综述了棉花体细胞胚胎发生的研究进展。
1 棉花组织培养的研究历程
1971年, Beasley首次从陆地棉胚珠的珠孔端诱导出了
愈伤组织(Beas ley , 1971)。随后, Pri ce 和 Smi th
(1979)报道了从克劳茨基棉细胞悬浮培养中获得体细胞
胚, 但未能得到再生植株。1983 年, Davi don is 和
Hamilton从继代培养2年的陆地棉子叶愈伤组织中获得
了体细胞胚, 进而得到再生植株(D avi don i s a nd
Hamilton, 1983)。直到 1986年, 才有正式报道从陆地
棉珂字棉 3 1 2 和珂字棉 2 0 1 中得到再生植株
(Shoemaker et al. , 1986)。
我国棉花组织培养在 20世纪80年代始见报道。刘
桂云(1983)最先从野生戴维逊氏棉的愈伤组织中诱导分
化并形成再生小植株。此后陈志贤和李淑君(1987 )、
吴敬音和陈松(1988)、谭晓连和钱迎倩(1988)及陆振鑫
和夏振澳(1 99 1 )分别从亚洲棉、陆地棉、雷蒙得氏
棉、拟似棉和戴维逊氏棉等不同棉属种的下胚轴、子
叶、幼叶、叶柄和幼茎等外植体愈伤组织诱导体细胞
胚胎发生或得到再生植株, 进而探明了胚状体发生以及
植株再生的培养条件, 初步建立并完善了棉花体细胞胚
胎发生和植株再生体系, 并利用我国自育品种如晋棉11
号、冀合 321、鲁棉 6 号、中棉所 13 号等培育出了
再生植株, 初步建立了棉花体细胞胚胎发生的再生体系
(丰嵘等, 1997)。到目前为止, 在棉属 51个种中已有 8
个种诱导获得了胚状体(崔凯荣等, 2001)。
这些工作为将植物基因工程技术应用于棉花遗传改
良打下了良好的基础。但是与其它作物相比, 棉花组织
培养依然比较困难, 主要表现在体细胞胚胎发生率低、
470 植物学通报 25(4) 2008
培养周期长、畸形胚频率高等方面。
2 棉花体细胞胚胎发生
棉花组织培养体系主要有胚珠培养、体细胞培养、茎
尖培养、原生质体培养、花药和花粉培养体系, 它们
在棉花育种与生物技术研究中发挥了重要作用。目前,
最为常见的是体细胞培养。
棉花体细胞胚胎发生的主要过程是从棉花无菌苗的
下胚轴、子叶、胚根、叶柄或成株的幼茎、幼叶以
及不同来源的原生质体, 经过愈伤组织诱导、胚状体发
生、胚状体萌发而成为再生植株。棉花外植体诱导产
生的愈伤组织大致分为 2类: 胚性愈伤组织和非胚性愈
伤组织。前者能诱导体细胞胚胎发生, 后者则不能诱导
体细胞胚胎发生。它们在来源、形态、产生时间等方
面都存在差异, 在特定的条件下二者可以相互转化, 但转
化的难易程度不同。一般胚性愈伤组织易转化成非胚
性愈伤组织, 而后者较难转化为前者(崔凯荣等, 2000)。
棉花体细胞胚胎发生途径类似于合子胚的发育, 先
后经历了原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和
子叶胚期。张献龙等(1991 )利用愈伤组织活体压片、
石蜡包埋切片、悬浮细胞系活体压片等多种方法研究
了陆地棉体细胞胚胎发生的过程, 从单个胚性细胞追踪
到成熟胚, 发现体细胞胚胎发生具有多种途径。既有单
细胞途径, 又有多细胞途径; 既有内起源途径, 又有外起
源途径。
3 棉花体细胞胚胎发生过程中的生理生
化代谢
目前, 由于陆地棉中珂字棉的体细胞胚胎发生能力相对
较强, 是棉花组织培养的模式材料, 因此, 在已报道的研
究中, 多以珂字棉系列品种为研究对象。吴家和等
(1999)发现在从下胚轴开始诱导出愈伤组织再到体细胞
胚胎发生的过程中, 其可溶性糖和淀粉含量呈下降趋势,
而蛋白质与核酸含量呈上升趋势。这是由于蛋白质和
核酸是细胞的重要组成部分, 其含量的高低决定了细胞
的组织成分。在由愈伤组织向胚性愈伤组织分化时, 细
胞内的组织成分发生了巨大的变化, 细胞内部的蛋白质
和核酸代谢处于旺盛阶段, 其含量高是正常的。而这时
细胞内部的糖和淀粉被迅速转移和利用以提供能量, 所
以可溶性糖和淀粉的含量较低。这些结果与在其它植
物(高述民和陆帼一, 2000; 刘华英等, 2002)中的研究结
果一致。说明愈伤组织向胚性愈伤组织定向分化时, 细
胞内的代谢物质必须要符合一定的条件, 但其代谢物质
含量的上限为多少尚处于研究当中。Zeng等(2007)研
究了棉花体细胞胚胎发生发育过程中的生物化学及细胞
生物学变化。发现伴随着细胞的去分化和再分化, 内源
吲哚乙酸( indo l eac et ic ac i d, IA A)和异戊烯腺苷
(isopentenyladenosine group, iPAs)含量发生剧烈变化,
同时染色质也发生去凝聚和再凝聚。这些现象表明内
源生长素和细胞分裂素含量的变化以及染色质的再组织
(chromatin reorganizat ion)可能与棉花体细胞胚胎发生
发育具有密切的关系。
4 影响棉花体细胞胚胎发生的主要因素
棉花体细胞胚胎发生是一个复杂的过程, 受细胞内外多
种因素影响, 主要包括植物基因型、外植体类型和生理
状态、培养基种类、培养条件以及激素水平等方面。
4.1 细胞外因素
外植体是一个重要的影响因素。不同类型的外植体得
到愈伤并且分化为体细胞胚胎的能力不同。其中下胚
轴最容易, 子叶较差, 真叶和茎最差。另外, 外植体的
生理状态也很重要。一般暗处萌发的无菌苗外植体比
光照下获得的无菌苗外植体更容易形成愈伤和胚状体。
不同的培养基成分和培养条件对体细胞胚的产生具
有重要影响。大多数研究者认为培养基的 pH 值在 5.8
-6. 2之间是适于棉花体细胞胚胎发生和植株再生的。
而外部的培养温度以 28-30°C为宜。Price和 Smith
(1979)曾指出, 影响棉花体细胞胚胎发生的另外一个关
键因素是在培养基中加入谷氨酰胺, 这可能是由于在棉
花胚胎发育和萌发过程中, 氨的变化途径是从谷氨酰胺
471武秀明等: 棉花体细胞胚胎发生的研究进展
经天门冬酰胺、精氨酸转化为贮藏蛋白。Trolinder和
Goodin(1988)还指出, 氮化物对于体细胞胚胎的发生和
成熟都是很重要的, 增加 KNO3 的浓度可以促进棉花体
细胞胚胎发生。而 Kumria等(2003)却发现代谢胁迫也
能促进体细胞胚的产生和成熟。当把愈伤接种到 1 / 5
MS 培养基上后, 体细胞胚产生的频率可以提高 2-3
倍 。
培养基中适当应用植物激素不仅是成功诱导体细胞
胚胎发生的决定因素, 也是影响胚状体高频率诱导的主
要因素(张宝红等, 2000)。吲哚乙酸是诱导出胚性愈伤
组织和胚状体的重要激素。细胞分裂素中 6- 呋喃氨基
嘌呤(激动素, k inet in, KT)的效果较好。2,4-二氯苯氧
基乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)可以诱
导愈伤组织并易出现胚性愈伤组织, 但却抑制胚性愈伤
组织分化为胚状体, 所以在胚状体生长的培养基中一般
要去除 2 , 4 - D(郏艳红和熊庆娥, 20 03 )。吕复兵等
(1999)以陆地棉品种珂字棉 201为材料, 比较了 IAA+
KT和 2,4-D+ KT在愈伤诱导和悬浮培养中的效应。实
验结果表明, 愈伤组织诱导中 IAA 和 2,4-D表现为正效
应, 且2,4-D的效应强于 IAA, KT则表现为负效应; 而在
胚性愈伤悬浮培养中, 3种激素都表现出负效应。
4.2 细胞内因素
细胞内因素主要体现在基因型的限制上, 即不同品种的
棉花体细胞胚胎发生的能力相差很大。Tro l inder 和
Chen(1989)分析了38个品种分化产生体细胞胚的能力,
发现它们可以分成 4大类: 高能力的品种、中等能力的
品种、低能力的品种和不能产生体细胞胚的品种。另
外同一品种不同种子间产生体细胞胚的能力也有差异,
这些结果表明品种间和个体间产生体细胞胚的能力存在
差异, 这种差异很可能就是由基因型决定的。谢德意等
(2007)以分别适宜长江和黄河流域棉区种植的各 10个
棉花品种, 以及珂字棉 201和 YZ1共 22个基因型为实
验材料, 对不同棉花品种的体细胞胚胎发生和植株再生
能力进行了比较, 发现胚性愈伤组织的分化率在 50%-
80% 之间。 喆而王 之等(1994)以陆地棉的 3个栽培品
种鲁棉 6 号、鲁棉 1024 号、冀棉 14 号为实验材料,
研究了陆地棉胚性愈伤组织的变异及高频胚胎发生, 虽
然 3个棉花品种的体细胞胚发生率都相对较高, 但依然
存在明显差异。体细胞胚胎发生频率最高的品种为鲁
棉 6号, 其分化率达到 98%, 而冀棉 14号为 90%。国
外品种中, 珂字棉最容易再生, 爱字棉和斯字棉难再生,
岱字棉极难或不能再生; 国内品种中, 黄河流域品种易再
生, 陕西、河北的品种次之, 长江流域的品种难以获得
胚性愈伤组织(蔡小宁等, 1997)。基因型对体细胞胚产
生的影响是一个复杂的过程。G aw e l 和 Robac k e r
(1990)将能产生体细胞胚的品种 Coker 321和T25分别
与不能产生体细胞胚的品种Acala SJ-5、Paymaster
303、T1 和 T169杂交, 分析了 F1、F2 和 BC 1后代群
体产生体细胞胚的能力。统计结果表明, 这是一个多基
因参与的过程。
5 棉花体细胞胚胎发生特异表达基因研
究及相关技术
体细胞胚胎发生是一个复杂的动态过程。从愈伤组织
到胚性愈伤组织的发育过程中有多种环境因素、外源
物质和激素的参与, 细胞内的代谢与信号转导过程也发
生着巨大的变化。在这个复杂的转换过程中, 基因的特
异表达起着决定性作用。因此研究棉花体细胞胚胎发
生过程中基因的差异表达, 以及分离特异表达的基因具
有重要意义。
近年来, 分离特异表达基因的技术不断发展与完善,
出现了mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)、cDNA扩增
片段长度多态性技术(cDNA-AFLP)、抑制性消减杂交
法(SSH)、基因表达序列分析法(SAGE)、代表性序列
差别分析技术(RDA)和 cDNA微阵列等技术。这些方法
已得到广泛应用, 并已成功分离了许多体细胞胚胎发生
的特征表达基因。
5.1 mRNA差异显示技术
mRNA 差异显示技术由 Liang和 Pardee(1992)创立。
Eric和 Venu(1994)将这种方法正式命名为差异展示反
转录聚合酶链式反应(differentially display reverse tran-
472 植物学通报 25(4) 2008
script ion polymerase chain react ion), 简称 DDRT-
PCR。该技术使用微量总 RNA 为模板, 能从多组样品
中灵敏快速地检测出差异表达基因片段, 但假阳性率较
高。李惠英和张献龙(2003)通过 DDRT-PCR技术对陆
地棉珂字棉201的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的
体细胞胚胎发生过程中的 c DNA 表达差异进行了研
究, 得到约 200个差异表达 cDNA片段, 其中 51个为
陆地棉胚性愈伤组织所特有, 并分离到了一个可能与
陆地棉品种“珂字棉 201”体细胞胚胎发生相关的新的
cDNA片段。
5.2 cDNA扩增片段长度多态性技术
cDNA扩增片段长度多态性技术(cDNA-amplified frag-
ment length polymorphism, cDNA-AFLP)是将RT-PCR
和 AFLP技术结合起来分析基因表达差异。该技术重复
性好, 假阳性率低, 可用于基因表达分析、遗传标记分
析和差异表达基因的克隆等领域。冷春旭等(2007)利用
cDNA-AFLP 技术研究了陆地棉标准系TM-1胚胎发生
过程中基因的差异表达。选择了 180对引物组合, 在显
示的约 3 000条谱带中, 38条为胚性愈伤组织中所特有
的差异谱带。对这些差异片段进行克隆、序列测定和
同源性分析, 其中 12 个差异片段同已知陆地棉、雷蒙
德氏棉和亚洲棉不同发育时期器官的 EST序列高度同
源。而且这些差异片段与花及纤维发育相关, 证明在植
物形态建成早期相关基因已经表达, 也就是说在植物胚
胎发育阶段特定器官的基因表达就已经发生。
5.3 抑制性消减杂交技术
Diatchenko等(1996)提出了新的克隆差异表达基因的方
法, 抑制性消减杂交法( supp res s i on s ub t rac t ive
hybridization, SSH)。该方法能够选择性地扩增差异表
达基因片段, 并具有高度灵敏性和较低的假阳性率, 但要
求起始材料的量较多, 至少需要 2 mg的mRNA(郭新红
等, 2001)。抑制性消减杂交法最初多用于动物, 随着技
术的不断成熟, 其在植物学研究领域的应用越来越多, 目
前在棉花上也有应用。Zeng和 Zhang(2006)通过抑制
性消减杂交法对陆地棉珂字棉201的胚性愈伤组织和非
胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生过程中的cDNA表达进
行研究, 得到了671个差异表达的 cDNA片段, 其中242
个片段被证实表达水平明显上调。同时采用 cDNA ar-
rays分析了胚性愈伤组织分化不同阶段中这些基因的表
达模式, 认为有多条途径共同调节棉花胚性愈伤组织分
化。将差异表达 cDNA片段与GenBank中的已知基因
进行比对、归类, 可以推知其中 8%的片段与代谢相关,
11% 的片段与转录及转录后修饰有关。
6 问题与展望
迄今为止, 棉花组织培养再生的研究已经取得了很大进
展, 建立起多个棉种的再生体系, 在棉花细胞分化和胚胎
发生的机理、细胞的基因表达调控、杂种优势的固定
和遗传转化等方面取得了极其重要的研究成果, 并成为
棉花遗传转化的主要途径和手段之一。但棉花组织培
养中仍存在一些问题, 主要表现在以下几方面。
(1 )组织培养中对基因型的依赖性强, 种间、品种
间的再生能力差异很大。品种局限性是棉花组织培养
的一个难题, 棉花组织培养中以珂字棉、鲁棉、冀棉
的体细胞胚发生率较高, 而其它大部分品种的体细胞胚
发生率相对较低(迟吉娜等, 2004)。这样使利用组织培
养技术对一些优良品种进行改良受到了限制。虽然目
前已有报道称建立起了一套体系可以满足 10 个品种
的组织培养条件(Wu et al. , 2004), 但降低基因型依
赖性的工作依然任重道远。在今后的研究中仍要努
力扩大棉花再生的基因型范围, 继续探讨棉花组织培
养的最佳条件, 建立高效、稳定且对基因型限制不严
格的再生体系。
(2)培养过程复杂, 周期长, 重复性差。棉花组织培
养再生植株均需要经过多次继代培养才能获得成功。
培养过程易受基因型、培养基成分、培养条件等因素
影响, 不同品种的培养条件也不完全相同, 重复性比较
差。棉花体细胞胚胎的诱导和发育条件以及胚状体成
苗技术尚需进一步研究, 以简化操作步骤, 缩短再生时
间, 提高组织培养效率。
(3)对于棉花体细胞胚胎发生率低和畸形胚胎频率高
473武秀明等: 棉花体细胞胚胎发生的研究进展
的现象缺乏系统研究。胚性愈伤组织在长期的继代培
养过程中易产生染色体变异, 在胚胎发生过程中往往伴
随着大量异常胚状体的发生, 因此获得大量正常的棉花
再生植株仍存在一定困难。畸形苗是在人工提供的培
养基和培养条件下的产物, 故培养环境对畸形苗的发生
有很大影响, 同时遗传背景不同, 畸形苗的发生率也不
同。多数学者认为, 畸形苗的形成与培养基内的激素、
糖、水分、固化剂、培养温度和培养容器等有关, 但
对畸形苗的发生机理, 诸如其发生过程、遗传上的根本
改变、分子水平上的变化还缺乏研究 ( 亓建飞等 ,
2004)。周大云等(2000)发现, 选用畸形苗作为外植体
进行再次培养, 可以使棉花体细胞胚胎发生率得到提高,
这为棉花组织培养提供了一个新的思路。而弄清染色
体变异的规律和畸形胚产生的原因以及如何控制变异率,
仍是今后研究的方向之一。
(4)高效的棉花体细胞胚胎发生体系需要不断优化。
通过在不同成分的培养基上多次继代, 棉花愈伤组织完
成了从胚性愈伤诱导到再生植株的转化过程。培养基
成分影响愈伤组织中的基因表达、蛋白合成修饰和相
关的信号转导途径, 进而影响体细胞胚胎的产生和分
化。目前对实验材料的生长状态与培养基组成的关系
研究得还不够深入, 组织培养过程中体细胞胚胎发生频
率较低。所以需要不断优化棉花体细胞胚胎发生体系,
建立高效的棉花组织培养体系。
(5)对棉花体细胞胚胎发生及发育过程中的分子机制
了解很少。目前大多数的研究都集中在各种外界条件
以及不同基因型对棉花体细胞胚胎发生发育的影响方面,
并且通过各种手段努力提高棉花体细胞胚胎发生频率。
这些努力都获得了很大进展, 使棉花组织培养周期明显
缩短, 效率明显提高。但是对于这一过程的分子机制研
究仍然较少, 目前仅有少数文献报道。虽然已经分离得
到了一些相关基因, 但是在这个复杂过程中起重要调控
作用的关键基因以及相关信号转导途径还未见报道。
综上所述, 棉花体细胞胚胎发生不仅仅是简单的繁
殖过程, 而已成为一个研究领域, 诸如遗传学、转基因
工程体系、生理生化、棉花发育过程中的基因表达和
调控以及功能基因组学等。而对棉花体细胞胚胎发生
过程的研究将对理解棉花体细胞形态建成、组织分化
及植株再生方面具有重要价值。
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475武秀明等: 棉花体细胞胚胎发生的研究进展
Progress of Somatic Embryogenesis in Cotton
Xiuming Wu, Chuanliang Liu, Chaojun Zhang, Fuguang Li*
Ke y L abo rato ry of Cot ton Gen eti c Improve ment , Mini stry o f Ag riculture , Cotto n Rese arch Insti tute, Chi nese Acade my of
Ag ricultu ral Scien ces, An yan g 4 550 04, Chi na
Abstract Over the past 30 years, somatic embryogenes is induc tion and plant regeneration has been success ful in many
different cotton cultivars . How ever, the eff icient conversion of callus into embryogenic callus is s till a restrict ing step dur ing cotton
tissue culture and genetic transf ormation, because embryogenic callus induction is affected by many f actors. This paper review s
the research into cotton embryogenic callus in terms of the origin, intrins ic and extrins ic factors aff ecting callus dif ferentiation, as
w ell as the techniques used to inves tigate the dif ferential gene express ion in the convers ion process. We also discuss the
problems encountered dur ing the research.
Ke y w ords co tto n, factors, so mat ic embryog ene sis, ti ssu e cu ltu re
Wu XM, Liu CL, Zhang CJ, Li FG (200 8). Pro gre ss of som atic em bryoge nesis in cotton. Ch in Bull Bo t 25 , 469-475.
* Author for correspondence. E-mail: lifug@cr icaas.com.cn
(责任编辑: 刘慧君)