全 文 ：植物学通报 2006, 23 (2): 138~144
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-07-06; 接受日期: 2005-12-05
基金项目: 国家自然科学基金(30200030, 30470283, 30370126)、国家 973计划(2001CB409701)、教育部留学回国人
员科研启动基金(教外司留[2005]383号)以及广东省教育厅自然科学研究项目(Z02018)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
.研究论文.
硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响
王艳1,3 唐海溶2 蒋磊3 李韶山3*
(1暨南大学理工学院环境工程系 广州 510632)
(2暨南大学生命科学学院 广州 510632)
(3华南师范大学生命科学学院 广州 510631)
摘要 以我国南海海域分离的赤潮原因种——球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)为材料, 研究了不同硝酸
盐浓度下藻细胞生长及硝酸还原酶活性的变化。当培养基中不含硝酸盐时, 藻细胞内硝酸还原酶的活性
保持在非常低的水平, 藻细胞的生长受到限制, 不能形成正常的生长曲线: 当培养基中硝酸盐浓度为
3.62 mmol.L-1时, 藻细胞的硝酸还原酶活性和比生长速率达到最大。在含有硝酸盐的培养基中, 接种培
养后第9天藻细胞硝酸还原酶活性达到最大值, 并且在4种不同硝酸盐浓度下, 藻细胞硝酸还原酶活性的
差异性达到极显著水平(P<0.01)。在接种培养第16天藻细胞密度达到最大值, 并且4种不同硝酸盐浓度培
养的藻细胞密度之间的差异性也达到极显著水平(P<0.01)。实验结果表明, 在培养基中添加不同浓度的
硝酸盐, 对球形棕囊藻细胞硝酸还原酶的活性和藻细胞的生长有极显著的影响, 含有较高硝酸盐的富营
养化海域有利于球形棕囊藻细胞的持续生长。
关键词 球形棕囊藻, 硝酸还原酶, 硝酸盐, 有害赤潮
Effects of Nitrate on the Growth and Nitrate Reductase
Activity in Phaeocystis globosa
Yan Wang1, 3, Hairong Tang2, Lei Jiang3, Shaoshan Li3*
(1 Department of Environmental Engineering, College of Science & Engineering, Jinan University,
Guangzhou 510632)
(2 College of Life Science, Jinan University, Guangzhou 510632)
(3 College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631)
Abstract Phaeocystis globosa, which causes harmful algae bloom (HAB), was isolated from the
South China Sea and grown in modified F/2 medium under varying nitrate concentrations. Cell
growth and nitrate reductase (NR) activity were investigated. P. globosa grown without nitrate
showed low-level NR activity, inhibited algal cell growth and no growth curve. The optimal nitrate
concentration for algal cell growth and NR activity was 3.62 mmol.L-1. Under 4 different levels of
nitrate, NR activity in cells peaked at day 9, but cell density peaked at day 16. Cell density and NR
activity differed significantly nitrate concentration. Thus, eutrophic sea water with a high nitrate
concentration is suitable for the growth of P. globosa and has great potential for developing into
red tide.
1392006 王艳 等: 硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响
球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)隶属于定
鞭藻纲(Haptophycea或Prymnesiophycea)棕囊
藻属(Phaeocystis), 从南极到北极的热带、温
带海洋中都有分布, 如北大西洋的温带及其沿海
地带, 北海沿岸地带, 地中海等(Veldhuis and
Admiraal, 1987; Baumann et al., 1994)。棕囊藻
是一种广温、广盐性的藻类, 具有复杂的异型
生活史(沈萍萍等, 2000)。近年来, 由于海洋富
营养化的加剧以及全球气候的异常, 由棕囊藻
引发的赤潮区域有逐步扩大的趋势。自 1997
年10月至1998年2月在中国东南沿海首次发
生大规模棕囊藻赤潮以来, 此类赤潮已多次在
我国沿海一带发生(陈菊芳等, 1999)。以棕囊
藻为原因种的赤潮发生覆盖面积大、持续时
间长, 给沿海地区的环境和海产品安全造成极
大的危害(Kam, 2003)。此外, 棕囊藻的大量繁
殖还能够产生二甲基硫化物(dimethyl sulfide,
DMS), DMS的氧化物不仅是酸雨和酸雾产生
的原因之一, 而且对全球的气候也会产生重要
的调节作用, 在局部地区高浓度DMS的恶臭或
毒性能导致严重的环境污染(Vogt et al.,1996; 王
艳等, 2003)。
海洋中的氮素是影响浮游植物生长的一个
重要限制因子(Touchette and Burkholder, 2000),
其中硝酸盐是浮游植物氮素的主要形式。不
同的藻类对氮素的需求量存在差异, 导致了藻类
对硝酸盐利用率也有差异。在对球形棕囊藻
生理特性的研究中发现, 硝酸盐对球形棕囊藻的
生长的影响达到显著水平, 并能刺激球形棕囊藻
群体的形成(Riegman and van Boekel, 1996)。
硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)是氮素代
谢中关键性酶(Dhindsa et al., 1981), 它将浮游植
物所吸收的氧化态氮化合物转化为还原态的氮,
进一步合成氨基酸和蛋白质 (Riegman and van
Boekel,1996; 王利群等, 2003)。如果海洋生物
体中缺少了硝酸还原酶, 将改变藻类的营养平
衡, 藻类的生长和繁殖都会受到抑制。硝酸还
原酶的活性也受到藻细胞体内生理因素与底物
NO3-的影响, 并对环境条件如光照、温度、
CO2等也十分敏感(张涛等, 2004)。
基于硝酸还原酶在氮代谢中的重要作用,在
过去的几十年里, 围绕对高等植物硝酸还原酶的
活性研究较多(Solomonson and Barber, 1994; 余
让才等, 1997), 然而海洋浮游植物尤其是球形棕
囊藻细胞硝酸还原酶活性及其影响因素的研究
较少。鉴于棕囊藻对海洋与环境的重要影响,
本文对不同硝酸盐浓度下, 球形棕囊藻的生长
状况和硝酸还原酶活性以及二者的关系进行
了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)分离自我
国南海海域。
1.2 球形棕囊藻的培养和实验结果的统计
分析
球形棕囊藻细胞的培养、比生长速率(m)
的计算参见沈萍萍等(2000)方法, 藻细胞在常规
条件下(F/2培养液, 22℃, 光通量密度150 mmol.
m-2.s-1, 光暗比为 12小时:12小时)进行预培
养。在藻类生长的对数期, 取等量、生长状况
良好的同步细胞, 分别接种于按4种不同硝酸盐
浓度(0、0.88、3.62、7.24 mmol.L-1)配制的
F/2培养液中进行培养, 每个处理均设 3个重
复。在对数生长期, 藻细胞的增殖符合公式:
dN/dt = mN, 比生长速率依下列公式计算:
m = ln (N/N0) / (t-t0)
m为比生长速, N、N0分别为 t、t0时刻
的细胞数, t、t0为不同的培养时间。
在培养过程中, 每72小时取藻类样品, 分别
测定OD680值及藻细胞内硝酸还原酶活性。培
养液中细胞密度与OD680值之间的对应关系如
Key words Phaeocystis globosa, nitrate reductase, nitrate, harmful algae bloom (HAB)
140 23(2)
图 1 所示。
采用单因素方差分析法(one-way ANOVA
analysis)对不同硝酸盐浓度下细胞密度值和硝
酸还原酶活性的差异显著性进行分析。
1.3 硝酸还原酶的提取和活性测定
硝酸还原酶的提取和活性测定参照陈薇和
张德颐(1980)以及薛应龙(1985)的方法进行。
培养的藻液经0.22 mm微孔滤膜超滤收集藻细
胞, 加入2 mL提取缓冲液4℃下抽提12小时后,
用超声波破碎, 之后在4℃, 7 500 g下离心15分
钟,其上清液即为硝酸还原酶的粗提液。
1.4 硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶活性的测定参照张志良(1990)
的方法进行。取0.4 mL硝酸还原酶粗提液, 加
入1 mL 0.01 mol.L-1 KNO3溶液, 0.6 mL 2.0 mg.
L-1 NADH用于反应。混合后在 25℃保温 30
分钟。保温结束后, 立即加入10.0 mg.L-1对氨
基苯磺酰胺(P-aminobenzene sulfonamide) 1分
钟和2.0 mg.L-1萘基乙烯二胺[N -(1- naphthyl)
ethylenediamine] 1 mL, 摇均显色后静置15分钟
以上, 于10 000 g离心5 分钟, 取上清液在540
nm处测定OD值。反应生成的亚硝态氮总量
(mg)与 OD540值之间的对应关系如图 2所示。
硝酸还原酶的活性单位以每毫克鲜重藻细胞每
小时催化反应所产生亚硝态氮总量表示(mg.
mg-1. h-1)。
2 实验结果
2.1 不同硝酸盐浓度对球形棕囊藻生长的
影响
不同硝酸盐浓度对球形棕囊藻生长的影响
如图3所示。当培养基中硝酸盐浓度低于3.62
mmol.L-1时, 藻细胞密度在指数生长期随着硝
酸盐浓度的增加而急剧上升, 并且在16天前后
达到细胞密度的最大值。硝酸盐浓度过高(7.
24 mmol.L-1), 藻细胞生长较快, 但藻细胞密度的
最大值低于硝酸盐浓度为3.62 mmol.L-1培养下
的最大值。
取不同浓度硝酸盐培养下处于对数生长期
的藻细胞, 进行比生长速率的比较, 发现硝酸盐
浓度为3.62 mmol.L-1的培养基中, 其藻细胞比
生长速率最大达0.1168, 表明在该硝酸盐浓度下
最适合藻细胞的生长。而在达到最适浓度之
前, 藻细胞增殖速率与硝酸盐浓度呈正相关; 超
过此浓度, 藻细胞的比生长速率反而下降, 说明
了对球形棕囊藻进行培养的硝酸盐浓度有一阈
值, 超过了此阈值, 藻细胞密度会受到抑制。另
外在不添加硝酸盐的培养中, 藻细胞由于缺乏氮
素营养, 生长活性受到限制, 其比生长率最低。
对不同硝酸盐浓度下生长的球形棕囊藻细
图 1 球形棕囊藻细胞密度和光密度的线性关系
Fig. 1 Linear fit between cell density and OD680 in
Phaeocystis globosa
图 2 亚硝态氮总量与光密度的线性关系
Fig. 2 Linear fit between NO2- and OD540
1412006 王艳 等: 硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响
胞密度值的差异显著性进行单因素方差分析(表
1)表明, 在培养的0~7天, 任意2种不同硝酸盐
浓度下生长的藻细胞密度之间的差异性不显著
(P＞0.05); 在10~13天, 培养基中添加了硝酸盐
的藻细胞与不含硝酸盐的藻细胞相比有显著性
差异(P<0.05), 说明了硝酸盐的存在与否对藻细
胞生长有显著影响; 在培养的第16天, 分别生长
在4种不同硝酸盐浓度下的藻细胞密度之间的
差异性, 两两相比均达到极显著水平(P<0.01); 而
在19天后, 随着细胞生长进入衰亡期, 4者两两
之间的差异性恢复到显著水平(P<0.05)。
2.2 球形棕囊藻硝酸还原酶活性的比较
图4为球形棕囊藻在4种不同硝酸盐浓度
培养下, 硝酸还原酶活性的变化情况。缺氮培
养的球形棕囊藻, 尽管在培养的第4天检测到硝
酸还原酶活性达到6.197 mg.mg-1. h-1, 但此后
逐步下降, 在第9天左右硝酸还原酶活性几乎检
测不到; 在含有硝酸盐的培养中, 所有藻细胞在
接种培养的第9天硝酸还原酶活性达到最大值,
并且在硝酸盐浓度低于3.62 mg.mg-1. h-1的培
养中, 硝酸还原酶的活性在藻细胞指数生长期会
随着底物硝酸盐浓度的增加而有所增加; 当硝
酸盐浓度过高(7.24 mg.mg-1. h-1)时, 球形棕囊
藻硝酸还原酶的活性低于3.62 mg.mg-1. h-1硝
酸盐浓度培养时硝酸还原酶的活性, 这说明藻细
胞内的硝酸还原酶活性存在阈值, 当酶活的增长
达到这一阈值时, 即使外源硝酸盐浓度继续增
加, 硝酸还原酶活性也不会再增加, 这与Berges
图 3 硝酸盐对球形囊藻生长的影响
Fig. 3 Effects of nitrate on the growth of Phaeocystis
globosa
表 1 不同硝酸盐浓度对球形棕囊藻生长影响的统计分析
Table 1 Statistic analysis of Phaeocystis globosa growth response (cell denisty) to different levels of nitrate
Comparison of cell density
Day 1 Day 4 Day 7 Day 10 Day 13 Day 16 Day 19 Day 22 Day 25between different levels of
nitrate (mmol.L-1)
0 (CK) vs 0.88 - - - + + ++ + + +
3.62 - - - + + ++ + + +
7.24 - - - + + ++ + + +
0.88 (CK) vs 3.62 - - - - - ++ + + -
7.24 - - - - + ++ + + +
3.62 (CK) vs 7.24 - - - - - ++ + + +
+. Significant at P < 0.05; ++. Significant at P < 0.01; -. Not significant
图4 不同硝酸盐浓度下球形棕囊藻硝酸还原酶活
性的变化情况
Fig. 4 NR activity of Phaeocystis globosa cells under
different nitrate concentrations
142 23(2)
等(1995)在许多其他藻类中得到的结果一致。
同时, 在上述3种硝酸盐浓度中培养的藻类在第
19天前后(即藻类衰亡期开始, 如图3所示), 胞
内硝酸还原酶活性降到了最低, 并维持在这一较
低水平, 这可能是因为这时培养基中的硝酸盐被
耗尽, 硝酸还原酶的活性也会随着硝酸盐浓度的
下降而减弱。另外, 不添加硝酸盐的藻类培养
中, 在藻类生长的第4天测到其硝酸还原酶的活
性后, 胞内硝酸还原酶的活性迅速下降, 到第9
天达到其最低水平, 证实了硝酸还原酶是一种底
物诱导酶, 只有当外界环境中存在硝酸盐的时候
才会因诱导而产生(李果龙和焦瑞身, 1995)。
对不同硝酸盐浓度下, 球形棕囊藻细胞硝
酸还原酶活性的差异显著性进行单因素方差分
析(表 2), 结果表明: 在培养的第 9天, 4种不同
硝酸盐浓度下, 藻细胞硝酸还原酶活性的差异
性, 两两相比均达到极显著水平(P<0.01), 说明在
培养基中添加不同浓度的硝酸盐, 对藻细胞硝酸
还原酶的活性有极显著的影响。
2.3 球形棕囊藻细胞密度与胞内硝酸还原
酶活性的比较
对不同硝酸盐浓度下球形棕囊藻生长(图
3)和硝酸还原酶活性(图4)进行比较, 发现球形
棕囊藻硝酸还原酶活性的高峰期(第9天)早于
藻细胞密度的高峰期(第16天)出现。在硝酸盐
浓度为3.62 mmol.L-1的培养中, 藻细胞的硝酸
还原酶活性和比生长速率明显高于其他3种硝
酸盐浓度下培养的藻细胞。
在图5中可以观察到不同硝酸盐浓度下球
形棕囊藻比生长率和硝酸还原酶活性最大值之
间的对应关系: 藻细胞比生长率较大时, 硝酸还
原酶活性最大值也较大。通过这种对应关系
以及藻细胞密度最大值与硝酸还原酶最大值在
时间上的差异, 说明了藻细胞密度与硝酸还原酶
活性密切相关并存在一个时间上的滞后, 而这种
滞后效应可能是由于硝酸还原酶对硝酸盐代谢
所起的作用决定, 即硝酸盐在硝酸还原酶作用下
转化为能被藻类吸收利用的物质。球形棕囊
藻硝酸还原酶活性在藻细胞密度的高峰期之后
降到了最低, 很可能是因为藻细胞的大量繁殖,
表 2 不同硝酸盐浓度对球形棕囊藻硝酸还原酶活性影响的统计分析
Table 2 Statistic analysis of nitrate reductase activities of Phaeocystis globosa response to different nitrate levels
Comparison of NR activity
Day 4 Day 9 Day 14 Day 19 Day 22 Day 25 between different levels of
nitrate (mmol.L-1)
0 (CK) vs 0.88 - ++ + - -
3.62 + ++ + + - -
7.24 + ++ + + - -
0.88 (CK) vs 3.62 - ++ - - - -
7.24 - ++ + - - -
3.62 (CK) vs 7.24 - ++ - - - -
+. Significant at P < 0.05; ++. Significant at P < 0.01; -. Not significant
图5 不同硝酸盐浓度下对数生长期球形棕囊藻比
生长速率和硝酸还原酶活性最大值的比较
Fig. 5 Growth rate and NR activity of Phaeocystis
globosa cells in the exponential phase under different
nitrate concentrations
* means significant at P < 0.05, error bars stand for SD
1432006 王艳 等: 硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响
消耗掉环境中的硝酸盐, 致使亚硝酸盐增加, 硝
酸还原酶因缺乏诱导物而使其活性降低。
3 讨论
硝酸还原酶(NR)是植物氮素代谢过程中重
要的调节酶, 它主要是在硝酸亚硝化过程中起催
化作用, 同时它与藻类的生物代谢和光合作用,
以及各种细胞的信号转导过程密切相关。
对比球形棕囊藻细胞生长状况和硝酸还原
酶活性的变化发现: 在藻类生长的迟滞期(0~7
天), 硝酸盐浓度较低并不会成为藻类生长的限
制因子; 随着藻类的生长, 细胞内源的硝酸盐被
大量消耗, 藻细胞生长受到限制; 在藻类生长的
指数期(7~16天), 如果培养基中添加了硝酸盐,
藻细胞的硝酸还原酶的活性被诱导而达到最大,
细胞通过对外源硝酸盐的利用, 达到最大限度的
增殖, 即指数增长。
球形棕囊藻是危害我国沿海海域的一种较
为常见的有毒赤潮藻, 在富营养化的水域中极易
爆发形成赤潮, 并且持续时间有时可以长达月余
(王艳等, 2003)。我们的研究表明, 当水体中有
较高浓度的硝酸盐存在时, 此种藻类细胞内源的
硝酸还原酶极易被诱导产生, 从而提高对外界硝
酸盐的利用能力。球形棕囊藻细胞在富营养
化的水域中持续生存能力与其较高的硝酸还原
酶关系密切, 这提示我们, 在海区监测和球形棕
囊藻赤潮防治中, 应密切关注海域的硝酸盐浓度
变化。
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第 1 1 届国际植物组织培养和生物技术大会会讯
经国务院批准, 第 11届国际植物组织培养和生物技术大会(11th International Con-
gress of Plant Tissue Culture & Biotechnology)将于 2006年 8月 13日至 18日在北京国
际会议中心举行。此次盛会由中国科学院和北京大学主办, 国家自然科学基金
委员会和科技部中国生物技术发展中心协办。
本届会议研讨的内容包括：植物分子生物学、功能基因组学、代谢工程、植
物转化、植物发育、作物抗性的分子调控、信号转导、作物品种改良、禾谷类
作物生物技术、经济作物生物技术、药用和园艺植物生物技术、组织培养在生
物多样性保存中的作用、植物生物反应器、分子药学、分子育种、转基因植物
的经济价值、生物技术领域里的知识产权、生物安全与大众对转基因植物的接
受程度、与生物技术相关的生物信息以及技术转让等。
本届大会将是国际生物学界重要的学术活动之一。届时将邀请 4~5位诺贝尔
奖获得者以及国内外约 1 5 0 位在组织培养、生物学和生物技术领域从事前沿研
究工作的学者和专家作报告。这些科学家和专家将以 4 场全体会议和 30 多场不
同内容的小型讨论会的形式作学术报告。大会预计将有 2 000 人参加此次会议,
并有来自不同国家和地区科研人员的 400~500个展板演示。
会议期间还将举办与生物技术相关的产品及技术展览会, 展览会的总面积约
为 2 000平方米。届时, 将有数十家享誉世界的各国公司到会展示他们的新产品
和新技术。
会议详细信息请浏览 http://www.genetics.ac.cn/iaptcb.htm
联系人：赵庆华 电话：010-64838095 传真：010-64878314
Email: qhzhao@genetics.ac.cn
中国科学院遗传与发育生物学研究所 IAPTC&B 办公室