全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 430-436, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-11-12; 接受日期: 2008-01-20
基金项目: 国家科技支撑计划(No. 2006BA D13B01-11)和广东省科技基础条件项目(No. 2006B60101021)
* 通讯作者。E-mail: lic11111@sina.com
.实验简报.
广东高州 7个普通野生稻居群遗传结构的 SSR分析
陈雨 1, 2 , 潘大建 1 , 曲延英2 , 范芝兰 1 , 陈建酉1, 李晨 1 *
1广东省农业科学院水稻研究所, 广州 510640; 2新疆农业大学农学院, 乌鲁木齐 830052
摘要 利用32对SSR引物对来自全部7个自然居群的217份广东高州普通野生稻(简称“高野”)材料进行遗传结构、多样性和
遗传聚类分析。结果表明, 高野各居群因遗传结构存在差异而相对独立, 但各居群之间由于存在基因渗透又具有一定的相似
性。高野总体多样性指数(Ht)为0.65, 居群内的多样性(HS=0.431)略大于居群间的多样性(DS=0.392), 二者差异并不显著。居
群间的遗传分化系数(GST)为0.611, 说明高野群体的遗传差异是由居群内和居群间的遗传分化共同作用的结果。其中A、B、
E居群间, D、F、G居群间遗传相似性较高, C居群与其它居群之间存在较大差异。根据7个居群的遗传结构, 结合其地理分布
状况, 认为遗传多样性最大的B和E居群以及遗传分化最小的C居群应作为重点对象进行保护。
关键词 遗传分化, 遗传多样性, 遗传结构, 普通野生稻, SSR
陈雨 , 潘大建 , 曲延英 , 范芝兰 , 陈建酉 , 李晨 (2008). 广东高州 7个普通野生稻居群遗传结构的 SSR分析. 植物学通报 25, 430-436.
普通野生稻(Oryza rufipogon)是亚洲栽培稻的祖先
(丁颖, 1957), 为国家二级保护植物, 其中蕴藏着丰富的
抗病、抗虫、抗杂草、抗逆、高产和优质等优异基
因, 是解决目前水稻生产中诸多难题的宝贵资源。但由
于人类活动的影响, 使曾经相当丰富的普通野生稻资源
正以惊人的速度消失(庞汉华, 1996; 杨庆文等, 2003; 钟
平安等, 2003; 陈成斌等, 2005; 燕惠民和贺益娥, 2007),
成为濒危植物种之一。因此对现存的野生稻资源进行
科学合理的保护和有效的开发利用已经刻不容缓。近
年来在广东高州市镇江镇的大岭村、福石村、泊水
村、朋山村、谭碌村以及祥山镇、沙田镇等地相继发
现了大面积罕见野生稻资源。其地理位置为 21°42N,
110°36E, 分布于 4条小河沟或浅河床中, 面积约 33.3
hm2, 根据野外调查和标本鉴定, 已被确定为普通野生
稻。高州普通野生稻(简称“高野”, 下同)分布区是目前
已知的普通野生稻连片分布面积最大、保护最好的区
域。对遗传结构的研究不仅可以揭示物种或居群的进
化过程, 还能为珍稀濒危物种及作物野生近缘植物的保
护提供科学依据。近年来利用同工酶和分子标记技术
的研究表明, 野生稻种内不仅存在着丰富的遗传变异, 而
且种内不同地理环境的居群间也存在遗传变异(Second,
1984; Ichikawa et al., 1986; Sarkar and Raina, 1992;
Mart in et al., 1997; Ak imoto et al., 1999)。本研究拟
对高野 7个居群的遗传结构进行分析, 为该地区野生稻
的保护和利用提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料
普通野生稻(Oryza rufipogon Griff. )采集于广东省高州市
分布点的主要居群。按照收集样品地点差异划分居群,
表 1 高州普通野生稻样品清单
Table 1 The mus ter of Oryza rufipogon in Gaozhou
Population Place Amount
A Fushi 51
B Pengshan 45
C Daling 38
D Xiangshan 5
E Boshui 9
F Shatian 24
G Tanlu 45
431陈雨等: 广东高州7个普通野生稻居群遗传结构的SSR分析
且居群间采样不存在区域重叠。共采集 217份高野样
品(表1), 保存于广东省农业科学研究院水稻研究所国家
种质野生稻圃。
SSR引物: 选择比较均匀分布于水稻 12条染色体
上的 SSR引物 32对(表2), 由北京奥科生物技术有限责
任公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA的提取
按照 SDS 小量提取法(Kangle et al. , 1995)提取单株
表 2 高州普通野生稻各居群的遗传多样性
Table 2 The genetic diversity of all Oryza rufipogon populations f rom Gaozhou
Pr imer Clone name Na Ht HA HB HC HD HE HF HG DS GST
RM259 CT550 14 0.873 0.399 0.744 0.583 0 0.560 0.612 0.684 0.512 0.586
RM23 GA594 6 0.591 0.132 0.595 0.077 0 0.560 0.500 0.453 0.331 0.56
RM104 R2508_1A 6 0.727 0.148 0.679 0.549 0.500 0.565 0.500 0.370 0.473 0.651
RM240 CT388 9 0.645 0.573 0.645 0.513 0.480 0.680 0.163 0.419 0.496 0.769
RM250 CT482 5 0.561 0.514 0.613 0.500 1.000 0.500 0.500 0.571 0.600 1.07
RM29 GA120 6 0.408 0.318 0 0.026 0 0.455 0.492 0.064 0.194 0.475
RM251 CT489 12 0.807 0.673 0.852 0 0.500 0.800 0.576 0.627 0.575 0.713
RM16 GA 53 5 0.613 0.499 0.439 0.026 0.500 0.500 0.591 0.586 0.449 0.732
RM130 N/A 4 0.599 0.555 0.257 0.500 0 0.565 0.500 0.497 0.411 0.686
RM307 GT97 4 0.558 0.311 0.298 0 0 0.540 0.226 0.488 0.266 0.405
RM471 OSJNBa0047N17 7 0.668 0.276 0.496 0.051 0.500 0.785 0.230 0.499 0.405 0.606
RM348 M16 5 0.541 0.058 0.633 0.500 0 0.255 0.497 0.064 0.287 0.53
RM161 N/A 6 0.716 0.636 0.726 0.569 0.500 0.580 0.237 0.548 0.077 0.108
RM13 GA478 9 0.764 0.570 0.556 0.500 0.500 0.685 0.606 0 0.488 0.639
RM217 CT115 10 0.573 0.214 0.597 0.500 0 0.620 0.632 0.022 0.369 0.644
RM50 GA534 5 0.254 0.131 0.412 0 0.500 0 0.497 0.044 0.226 1.047
RM541 OSJNBb0019O09 6 0.756 0.183 0.578 0 0.500 0.375 0.156 0.498 0.327 0.433
RM234 CT360 7 0.664 0.111 0.616 0.500 0 0.685 0.556 0.704 0.453 0.682
RM18 GA 97 11 0.567 0.183 0.463 0.513 0.500 0.625 0.521 0.642 0.07 0.123
RM248 CT469 8 0.663 0.216 0.558 0 0 0.645 0.575 0.447 0.349 0.526
RM337 CTT64 6 0.626 0.500 0.633 0 0.500 0.480 0.577 0.677 0.481 0.768
RM264 CT109 11 0.848 0.344 0.766 0.499 0.500 0.700 0.083 0.682 0.511 0.603
RM245 CT453 5 0.700 0.528 0.587 0.500 0.500 0.615 0.575 0.348 0.522 0.746
RM242 CT410 6 0.500 0.130 0.438 0.500 0 0.500 0.542 0.022 0.304 0.608
RM205 CT22 14 0.766 0.183 0.575 0.053 0 0.760 0.515 0.499 0.369 0.482
RM467 OSJNBa0044A 10 7 0.728 0.613 0.359 0.513 0.500 0.635 0.541 0.431 0.153 0.21
RM258 CT531 7 0.762 0.534 0.735 0.526 0.500 0.585 0.575 0.482 0.562 0.738
RM228 CT221 13 0.739 0.583 0.653 0.026 0.500 0.728 0.558 0.729 0.540 0.731
RM202 CT14 8 0.715 0.274 0.711 0 0.500 0.685 0.558 0.631 0.480 0.671
RM224 CT199 9 0.602 0.112 0.456 0 0.500 0.480 0.492 0.552 0.370 0.615
RM247 CT462 9 0.574 0.183 0.603 0.538 0 0.320 0.579 0.108 0.333 0.58
RM235 CT368 8 0.695 0.553 0.767 0.500 0.500 0.640 0.500 0.539 0.571 0.822
Mean 7.75 0.650
0.351 0.565 0.299 0.328 0.565 0.477 0.435
0.392 0.611
HS=0.431
各居群编号及来源见表 1。Na : 等位基因数; Ht : 总体遗传多样性指数; HA、HB、HC、HD、HE、HF和HG分别为各居群的遗传多样
性指数; HS: 居群内平均遗传多样性指数; DS: 居群间遗传多样性指数; GST: 遗传分化系数
The code f or each population w as indicated in Table 1. Na: Number of allele; Ht: Total genetic diversity; HA, HB, HC, HD, HE, HF and HG:
Genetic divers ity of each population; HS: Genetic diversity w ith populations; DS: Genetic divers ity among populations; GST: Coeff i-
cient of genetic diff erentiation
432 植物学通报 25(4) 2008
新鲜叶片总DNA。
1.2.2 PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
反应体系 10 mL: 10×PCR buffer 1 mL, 10 mmol.L-1
dNTP 0.1 mL, 10 mmol.L-1引物 1 mL, 总 DNA 模板 2
mL, Taq酶 0.3 mL (2.5 U.mL-1), 加水补足至总体积 10
m L。
反应程序: 94°C预变性 5分钟; 94°C变性 30秒,
55°C复性 1分钟, 72°C延伸 2分钟, 35个循环; 最后
72°C 延伸 8 分钟。
在1×TBE缓冲系统下采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳
对扩增产物进行检测, 并使用DNA Marker标定分子
量。硝酸银染色, 对 SS R扩增条带进行数据分析。
1.2.3 SSR数据统计与分析
以所得 S S R 数据为基础分别使用 S t r uc t u re2 . 2、
PowerMarker3.25和MEGA3.1软件进行高野居群的遗
传结构、遗传多样性和遗传距离聚类分析。
相关计算公式如下: 遗传多样性指数 H= S H i / n ,
Hi=1-SP2ij(其中 Pij表示第 i位点上第 j 个等位变异的频
率, n为检测位点的总数); 遗传分化系数 GST=Ds/H t=
(Ht-Hs)/Ht(其中Ht为总群体遗传多样性指数, Hs为亚群
体遗传多样性指数)。
2 结果与分析
2.1 遗传结构分析
利用Struc ture2.2软件对SSR数据进行分析, 绘制出高
野群体的遗传结构图(图 1)。高野 7个居群在遗传结构
上存在差异, 具有相对独立性; 但各居群之间也存在基因
相互渗透, 具有一定的相似性。B、E 居群中存在较多
的 A居群基因渗入, D和F居群的相似性也相对较高, C
和G居群显得更加独立, 但 A、C、F 居群内部个体间
的分化较小, 其中 C居群分化程度极其微弱, 只有很少
量的个体与其它居群遗传结构相似。在G居群中, 存在
一部分与 A、C 居群遗传结构相似的个体。
2.2 遗传多样性分析
根据 SSR数据利用 PowerMarker3.25软件分别计算出
高野各居群内、居群间以及总群体的遗传多样性指数
(表 2)。结果表明在检测的32个位点上平均等位变异数
达 7.75, 总体遗传多样性指数 Ht=0.65, 其中 RM259和
RM205出现的遗传变异数最大。居群内平均多样性指
数 HS=0.431, 其中 C居群多样性指数最低, B、E 居群
图 1 高州普通野生稻各居群的遗传结构(K=5)
各居群编号及来源见表1。
Figur e 1 The genetic s tructure of all Oryza rufipogon populations f rom Gaozhou (K=5)
Notes for each population w ere indicated in Table 1.
433陈雨等: 广东高州7个普通野生稻居群遗传结构的SSR分析
多样性指数最高; 各居群间平均遗传多样性指数 D S=
0.392, 其中以RM235的多样性最高。 居群间的遗传分
化系数GST为 0.611。可见, 居群内遗传多样性略大于
居群间, 经 t 检验表明二者差异并不显著(t =0.812 5<
t0. 05/ 2=2.348); 居群间的遗传分化比较明显。
2.3 遗传距离聚类分析
利用PowerMarker3.25软件计算各居群之间的Nei氏遗
传距离(表 3), 并结合MEGA3.1软件采用邻近归并法
(Ne i ghbo r - j o i ni ng )绘制聚类系统树, 设为矩形树
(rec tangular tree)显示(图 2)。高野居群一级聚类为 3
组, 其中 A、B、E 居群聚为 1 组, D、F、G 居群聚
为 1组, 说明这 2组内的各居群间遗传相似性较高, 而2
组间的遗传差异较大; C居群单独聚为1组, 说明该居群
与其它居群之间存在较大差异。
3 讨论
关于高野居群的遗传结构分化研究, 在形态学和分子遗
传学方面已有报道。王净等(2004)对高野现存群体的分
布、生态及其形态性状进行了详细的调查分析, 认为高
野群体没有种的变异, 不同组之间的差异主要是由居群
间的分化造成的。杨庆文等(2004)利用 SSR引物对来
自福石、朋山和泊水(分别对应于本研究中的 A、B、
E)的3个高野居群进行了遗传多样性分析和遗传分化研
究。结果表明, 平均每个 SSR位点在高野中的等位变
异数只有 4.05, 总体遗传多样性为 0.61, 3个群体既存
在着高度的遗传相似性,又具有一定程度的遗传分化, 其
中朋山居群的分化最大, 福石与泊水居群的相似性较
高。李晨等(2005, 2006)对高野 5个居群进行SSR分
析, 得到的平均基因多样性为0.844, 各居群间已经出现
了较显著的分化, 其中朋山(B居群)高野的遗传多样性最
高。在本研究中, 平均各位点在高野 7个居群中的等位
变异数达到 7.75, 明显高于前人的研究结果; 遗传多样
性为 0.65, 介于杨庆文等(2004)和李晨等(2006)的研究
结果之间。造成本研究结果与前人研究结果有所不同
的主要原因在于所检测 SSR位点的数量和分布以及所
增加的高野居群材料多样性的差异。杨庆文等(2004)
的研究结果表明居群内的遗传多样性为居群间的3倍多,
因此认为高野总的遗传多样性主要来自居群内; 居群间
表 3 高州普通野生稻各居群间的遗传距离
Table 3 The genetic distance among Oryza rufipogon populations f rom Gaozhou
A B C D E F G
A 0.000 0 0.311 8 0.519 7 0.565 6 0.200 6 0.447 2 0.347 1
B 0.311 8 0.000 0 0.446 9 0.553 4 0.338 7 0.463 1 0.365 6
C 0.519 7 0.446 9 0.000 0 0.637 5 0.465 0 0.535 9 0.440 6
D 0.565 6 0.553 4 0.637 5 0.000 0 0.480 9 0.526 4 0.472 8
E 0.200 6 0.338 7 0.465 0 0.480 9 0.000 0 0.434 2 0.338 9
F 0.447 2 0.463 1 0.535 9 0.526 4 0.434 2 0.000 0 0.418 5
G 0.347 1 0.365 6 0.440 6 0.472 8 0.338 9 0.418 5 0.000 0
各居群编号及来源见表1。
The code for each population w as indicated in Table 1.
图 2 高州普通野生稻各居群间的遗传聚类分析
各居群编号及来源见表1。
Figur e 2 The c lustering of all Oryza rufipogon populations
from Gaozhou
The code for each population w as indicated in Table 1.
434 植物学通报 25(4) 2008
的遗传分化系数为 0.242, 分化并不显著。而在本研究
中, 高野7个居群内平均多样性指数为 0.431, 居群间平
均多样性指数为0.392, 两者之间差异不显著, 居群内多
样性略大于居群间 , 居群间的平均遗传分化系数为
0.611。因此我们认为高野群体的遗传差异是由居群内
和居群间的遗传分化共同作用的结果, 高野各居群间的
遗传分化比较明显。对比前人的研究结果来看, 高野
群体中朋山居群的分化程度最高已成为共识。本研
究中各居群材料数量差异较大, D和 E居群都不到10
份, 我们今后将增加这 2 个居群的材料数量以开展进
一步研究。
结合高野 7个居群的地理分布示意图进行分析, 发
现高野居群的遗传结构与其分布的地理环境有一定关
系。如图 3所示, A、B 和 E 居群分布于上游水库下面
的2条分支河沟中, 地理位置接近, 这3个居群在聚类图
上聚为 1个组, 而且从遗传结构图(图 1)上看, B 和 E 居
群都含有大量位于下游的 A 居群基因。对此我们认为
有2种解释。其一, 因为这3个居群处于同一个水系, 最
早本来就是一个大的群体, 后来由于种种原因彼此分开
并发生不同程度的分化; 其二, 杨庆文等(2004)曾指出该
区域河流之间修建的道路为实心路,只有当上游流水溢出
公路时才能到达下游河流, 上游的野生稻种子随水流传
播到下游的可能性很小。因此, 花粉传播也很可能是造
成这种具有方向性的基因渗透的直接原因, 因为该地区
东部临海, 多以东偏南风为主, 能够把 A 居群的花粉带
到上游原本遗传结构相对较独立的 B 和 E 居群。G居
群同时存在分别位于其东、南部的 A、C 居群的基因
渗入, 这也可能与它的位置有关, 因为其刚好处于 A、
C居群之间, 而 A和 C居群相对较远, 从遗传结构上看
分化也较小。D和 F 居群之间地理位置相距甚远, 分别
位于高野分布区的最北和最南端, 但从遗传结构(图1)上
分析, 两者具有较大的相似性, 聚类图上也聚为一类。
通过对原生境调查资料分析发现, 造成这一现象的原因
是多年来D和F居群与其周围的栽培稻田隔离相对较差,
图 3 高州普通野生稻各
居群地理分布示意图
各居群编号及来源见表1。
Figure 3 The geographic
di s tr ib uti on of Or yz a
rufipogon populations in
Gaozhou
The code for each popu-
lation w as indicated in
Table 1.
435陈雨等: 广东高州7个普通野生稻居群遗传结构的SSR分析
都存在着附近栽培稻的基因渗入。对此结论有待于以
增加D居群材料数量并加入当地栽培稻材料进行遗传结
构对比分析的方式进一步证实。
综合以上分析, 在进行高野分布区原生境保护时, 在
人力物力允许的情况下, 务必做好各居群的隔离措施, 使
之保持比较原始的状态。从保护角度出发, 建议对遗传
结构上最纯合的 C居群的保护应成为重中之重, 其次优
先对分化较小的A 和G居群加强保护, 同时加强B、E
居群和 A居群之间, 以及G居群和 A、C居群之间的隔
离。D和 F 居群距离高野集中分布地较远, 更需要纳入
统一管理, 加大宣传力度, 避免人为因素破坏, 并采取相
应措施阻止栽培稻基因渗入。而遗传多样性最大的B和
E 居群应该成为开发利用的优先考虑对象。
致谢 承蒙中国农业大学张洪亮博士和朱作峰博士
的帮助,特此表示由衷的谢意！
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436 植物学通报 25(4) 2008
Analysis of Genetic Structure by Simple Sequence Repeat Markers
in Seven Oryza rufipogon Griff. Populations from Gaozhou
Yu Chen1, 2 , Dajian Pan 1, Yanying Qu 2, Zhilan Fan 1, Jianyou Chen 1, Chen Li 1*
1In sti tute of Ri ce, Gua ngd ong Academy o f Agricultura l Scien ces, Guan gzho u 5 106 40, Chi na; 2Xi nji ang Agricu ltu ral Uni versit y,
Urumq i 8 3005 2, Chi na
Abstr act The genetic struc ture of 217 indiv iduals f rom seven natural populations of Oryza rufipogon Griff . in Gaozhou w as
analyzed by use of 32 pairs of simple sequence repeat (SSR) primers. The populations differed in genetic structure but w ere also
similar to some ex tent because of genetic introgress ion. The genetic diversity index of all populations (Ht) w as 0.65; the diversity
w ithin populations (HS=0.431) w as slightly higher than that among populations (DS=0.392), and the coef f icient of genetic dif feren-
tiation (GST) w as 0.611. Thus, the genetic diff erentiation of O. rufi pogon Gr iff . in Gaozhou w as caused by dif ferentiation w ithin and
among populations. The level of genetic s imilarity w as high among populations A, B, and E and among populations D, F, and G; the
genetic difference betw een population C and other populations w as large. Consider ing the geographic distr ibutions of the popula-
tions w ith the above results , population C, w ith the minimum genetic diff erentiation, and populations B and E, w ith the max imum
genetic divers ity , should be conserved bef ore others.
Ke y w ords g ene tic dif ferent iat ion, ge net ic diversi ty, ge net ic stru ctu re, Oryza ru fip ogo n Grif f., si mpl e sequ ence repe at
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* Author for correspondence. E-mail: lic11111@sina.com
(责任编辑: 刘慧君)