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Identification and classification of cut-flower “Huangyinghua”using DNA marker techniques

利用分子标记技术对鲜切花“黄莺花”的鉴定和分类


rch Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract “Huangyinghua” is a popular cut-flower in China, but it is unclear as to whether
“Huangyinghua” is an invasive Solidago canadensis or not. The genetic relationship of a total
of 45 samples of “Huangyinghua” with S. canadensis, and S. decurrens were investigated
using AFLP technique so as to determine the identity of “Huangyinghua”. Genomic DNA was
digested with EcoRI and MseI enzymes and amplified with six E+3 and M+3 primer
combinations. AFLP analysis produced 661 endonucleotide discernable bands, of which 639
(96.61%) were polymorphic. Cluster analysis through using UPGMA method indicated that
“Huangyinghua” and S. canadensis were clustered into the same group that was different
from S. decurrens. Sequence analysis based on the ITS regions showed that their sequences of
5.8S rDNA were the same, and the differences were found only in the ITS1 and ITS2 regions.
ITS phylogenetic trees of the tested samples and closely-related species were reconstructed
based on our sequence data in combination with those from GenBank. Based on the trees,
“Huangyinghua” was found to belong to S. canadensis complex, but not to S. decurrens.
Moreover, it was found that there were considerable genetic variation in both
“Huangyinghua” and S. canadensis. Therefore, the cut-flower “Huangyinghua” may be
invasive, and proper measures should be taken to control the further spread of its propagules.


全 文 :植 物 分 类 学 报 45 (4): 497–504(2007) doi:10.1360/aps06135
Acta Phytotaxonomica Sinica http://www.plantsystematics.com
———————————
2006-08-28收稿, 2006-12-04收修改稿。
基金项目: 国家基础研究(973)项目(2002CB111402); 江苏省科技攻关项目(BE2005349)(Supported by the National Basic
Research and Development Program of China, Grant No. 2002CB111402; and the science and technology brainstorm project of
Jiangsu Province, Grant No. BE2005349)。
* 通讯作者(Author for correspondence. E-mail: wrl@njau.edu.cn, qiangs@njau.edu.cn; Tel: 86-25-84395117)。
利用分子标记技术对鲜切花“黄莺花”
的鉴定和分类
马 玲 强 胜
(南京农业大学杂草研究室 南京 210095)
Identification and classification of cut-flower
“Huangyinghua”using DNA marker techniques
MA Ling QIANG Sheng*
(Weed Research Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract “Huangyinghua” is a popular cut-flower in China, but it is unclear as to whether
“Huangyinghua” is an invasive Solidago canadensis or not. The genetic relationship of a total
of 45 samples of “Huangyinghua” with S. canadensis, and S. decurrens were investigated
using AFLP technique so as to determine the identity of “Huangyinghua”. Genomic DNA was
digested with EcoRI and MseI enzymes and amplified with six E+3 and M+3 primer
combinations. AFLP analysis produced 661 endonucleotide discernable bands, of which 639
(96.61%) were polymorphic. Cluster analysis through using UPGMA method indicated that
“Huangyinghua” and S. canadensis were clustered into the same group that was different
from S. decurrens. Sequence analysis based on the ITS regions showed that their sequences of
5.8S rDNA were the same, and the differences were found only in the ITS1 and ITS2 regions.
ITS phylogenetic trees of the tested samples and closely-related species were reconstructed
based on our sequence data in combination with those from GenBank. Based on the trees,
“Huangyinghua” was found to belong to S. canadensis complex, but not to S. decurrens.
Moreover, it was found that there were considerable genetic variation in both
“Huangyinghua” and S. canadensis. Therefore, the cut-flower “Huangyinghua” may be
invasive, and proper measures should be taken to control the further spread of its propagules.
Key words Huangyinghua, Solidago canadensis, Solidago decurrens, AFLP, ITS sequence,
genetic relationship.
摘要 鲜切花“黄莺花”是否就是加拿大一枝黄花Solidago canadensis存在争议。本文应用AFLP技术
对“黄莺花”、加拿大一枝黄花以及本地产一枝黄花Solidago decurrens Lour.共计45份样品的亲缘关系
进行了研究, 以便对这种鲜切花进行鉴定和分类。选择EcoRI/MesI的酶切组合, 应用6对E+3/M+3引物
组合进行选择性扩增, 共扩增出多态位点639个, 占总位点数的96.61%。UPGMA聚类分析结果表明:
“黄莺花”与加拿大一枝黄花聚为一大类, 并与野外采集的种群相聚较近, 与一枝黄花相区别。通过对
其5.8S rDNA及其两侧的ITS1区和ITS2区进行序列分析, 结果表明, 5.8S rDNA序列完全一致, 变异位
点位于ITS区; 通过将上述样品的ITS区序列与一枝黄花属Solidago的多个近缘种相比对, 建立系统进化
树。结果表明, “黄莺花”和加拿大一枝黄花都存在丰富的遗传变异, 但明确了“黄莺花”属于加拿大
一枝黄花复合种, 具有潜在的入侵性, 应当引起有关部门的重视。
关键词 黄莺花; 加拿大一枝黄花; 一枝黄花; AFLP; ITS区; 亲缘关系
植 物 分 类 学 报 45卷 498
近年来, “黄莺花”被作为鲜切花的配花在中国甚至世界范围内大量销售, 也被广泛
地引种栽培。它具有和入侵种加拿大一枝黄花Solidago canadensis L.十分相似的形态学特
征。因此, 关于“黄莺花”的分类地位一直存在争议, 河南和云南还因此出现了执法纠纷
(高明, 2005; 冯保军等, 2006)。一种观点认为它就是加拿大一枝黄花, 因为从形态学特征
上该花与加拿大一枝黄花的确十分相似, 如叶边缘具锐齿, 离基三出脉, 头状花序小, 单
面着生, 在花序分支上排成蝎尾状, 再组合成开展的大型圆锥花序等; 微小的区别仅表
现在数量性状上, 如茎上部被毛多少和植株茎、叶粗糙程度等, 所以仅从形态上很难区
分。另一种观点认为它是仅供栽培观赏的“黄莺花”, 不是加拿大一枝黄花。当然, 还有
另一种可能就是“黄莺花”是包括2个以上种的复合类群。
加拿大一枝黄花又名金棒草, 英文俗名Canada goldenrod, 是菊科Compositae一枝黄
花属Solidago L.植物。加拿大一枝黄花原产于北美的加拿大和美国, 1935年从日本作为花
卉引入台北, 后来上海、庐山相继引种, 20世纪80年代扩散蔓延成杂草(吴海荣, 强胜,
2005)。由于其植株高大、生长茂密, 能释放化感物质, 竞争、占据本地物种的生态位, 使
本地种失去生存空间; 并破坏景观的自然性和完整性, 造成景观污染(吴海荣, 强胜,
2005); 能通过形成大面积单优群落, 降低物种多样性, 破坏生态系统, 影响遗传多样性,
造成近亲繁殖和遗传漂移及本地种的遗传侵蚀(方芳等, 2004; 徐海根等, 2004); 还能侵
入果、茶、桑园, 农田, 菜地及旷野, 与果、茶、桑树和作物争夺营养物质和水分, 造成
经济作物、农作物的减产甚至绝收(徐富康等, 2005)。因此, 加拿大一枝黄花的危害已经
引起了广泛的关注。日前农业部发起了在全国范围内的清除行动, 投入了大量的人力、
物力和财力, 对遏制其蔓延扩散的势头起到了一定的作用。
如果“黄莺花”不是加拿大一枝黄花及其他入侵种, 则可以继续利用该花发展鲜切
花产业; 但若“黄莺花”就是加拿大一枝黄花, 则将增加这种植物向新区域迅速扩散的
风险。加强管理是控制其扩散蔓延所能采取的一个重要途径, 但目前其分类地位存在的
争议给管理带来一定的困难。所以, 迫切需要对其进行科学鉴定, 以确定其分类地位。在
传统的分类结果存在争议的背景下, 通过现代分子生物学手段进行鉴定是解决这一科学
问题的可选方法。
本文运用AFLP(Amplified fragment length polymorphism)技术、5.8S rDNA及其两侧的
ITS1区和ITS2区序列分析的分子标记技术对市场出售的“黄莺花”样品和在中国广泛发
生的加拿大一枝黄花的亲缘关系进行研究, 并以原产加拿大的加拿大一枝黄花和中国原
产的一枝黄花Solidago decurrens Lour.为对照, 试图阐明市场出售的“黄莺花”鲜切花样
品的分类地位, 明确其是否是具有入侵性的加拿大一枝黄花。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为2005年10月12日至2006年1月18日收集的南京市场销售的33份“黄莺花”
样品, 编号分别为No. 13–No. 45; 2005年8月至12月采集在华东地区入侵生长的10份加拿
大一枝黄花样品, 采集地点分别是: No. 1, 上海; No. 2, 安徽铜陵; No. 3, 安徽合肥; No.
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4, 江苏南京栖霞区; No. 5, 江苏南京中山植物园; No. 6, 江苏海门; No. 7, 江苏苏州; No.
8, 浙江瑞安; No. 9, 浙江嘉兴; No. 10, 浙江杭州; No. 12为原产于加拿大Alberta,
Vegreville的种子苗; No. 11为本地一枝黄花, 采于江苏南京紫金山。
所有采集到的叶片材料迅速置于液氮罐中速冻后置于–20 ℃冰箱, 用于后续研究。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取和检测 方法采用段惠等改良的CTAB提取法(段惠等, 2005)。幼叶用
液氮研磨成细粉, 加入2% CTAB提取液, 65 ℃水浴1–1.5 h后, 加入等体积的氯仿异戊醇,
轻轻颠倒混匀10–15 min, 12000 r/min离心15 min, 取上清液加入等体积异丙醇沉淀DNA,
待TE缓冲液溶解沉淀后加入适量的RNaseA酶, 37 ℃温浴30 min, 用等体积苯酚氯仿异戊
醇抽提, 取上清液, 再用等体积氯仿异戊醇抽提1次, 取上清液, 加入1/10体积的3 mol/L
的NaAc, 2倍体积的无水乙醇沉淀过夜, 离心后用75%乙醇洗数次, 加适量TE溶解。
1.2.2 AFLP分子标记技术流程及数据收集、处理方法 取300 ng基因组DNA, 采用
EcoRI和MseI双酶切。酶切体系在37 ℃放置2 h。在T4连接酶作用下, 人工接头与酶切产
物在16 ℃下连接过夜。选用E-A和M-C引物对连接产物进行扩增, 产物稀释相应倍数后
作为选择性扩增的模板。选用6对选择性引物对稀释的预扩增产物进行选择性扩增, 6对引
物组合分别为E-ACC/M-CTG、E-ACC/M-CAT、E-ACC/M-CTA、E-ACA/ M-CTG、E-ACA/
M-CAT、E-ACA/M-CTA(人工接头和引物购于上海生工公司)。选择性扩增产物95 ℃变
性5 min后, 上样于6%的聚丙烯酰胺凝胶, 60 W恒功率电泳3.5 h (测序电泳槽为BioRad公
司产品)。
电泳后的凝胶于2 L 10%冰醋酸中固定轻摇30 min, 然后用双蒸水清洗3次, 每次2
min, 沥干水后转至2 L染色液(2 g AgNO3+3 mL甲醛)中轻摇30 min, 再用双蒸水洗1次8 s,
迅速放到2 L预冷的显影液(60 g Na2CO3+3 mL甲醛+1% Na2S2O3)中至电泳条带清晰出现
后加入10%的冰醋酸终止显影, 双蒸水洗后的凝胶自然晾干。
AFLP显带的记录方法为: 记录凝胶上清晰的条带, “有”记作“1”, “无”记作“0”,
将6对选择性扩增引物产生的DNA扩增带数据输入到数据矩阵。通过Jaccard (1908)的方
法将电泳带矩阵转化为遗传相似性系数矩阵, 进行UPGMA聚类分析。
1.2.3 ITS区分析 根据UPGMA聚类分析的结果, 从每个分支上选取一个样品进行ITS
区序列的分析, 选取的样品号为No. 1、No. 11、No. 12、No. 19、No. 20、No. 31、No. 38、
No. 41、No. 42、No. 44。
选用50 µL体系, 包括: 10×PCR缓冲液5 µL, Mg2+(25 mmol/L)、dNTPs (2.5 mmol/L)
各4 µL, 引物(10 µmol/L)各1 µL, 20–50 ng模板DNA, Taq聚合酶(5 U/µL) 0.5 µL, 补足
ddH2O。ITS1 5′端引物ITS1序列: 5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3′, ITS2 3′端
引物ITS2序列为: 5′-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3′。扩增程序为: 95 ℃预变
性4 min; 再经以下程序: 95 ℃变性30 s, 52 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s, 共30个循环; 最
后72 ℃延伸7 min。
各PCR产物直接送到上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)进行序列测定。
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2 结果和分析
2.1 AFLP引物组合的扩增结果
选用6对选择性扩增的引物组合对45份样品进行扩增, 经6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳
共分离出661条清晰条带, 检测出639个多态性位点, 多态性比率为96.61% (表1)。每对引
物组合平均扩增多态性位点数为110个。所用的每一对引物组合均可产生各自特有的分离
图谱, 这也表明AFLP分子标记在揭示基因组组成差异上具有极高的检测效率。


表1 所用引物组合及其检测效率
Table 1 Amplification efficiency of screened primer combinations
引物组合
Primer combinations
总带数
Number of bands
多态带
Number of polymorphic bands
多态率(%)
Polymorphism (%)
E-AAC M-CTG 98 95 96.91
E-AAC M-CAT 97 94 96.61
E-ACA M-CTG 118 114 96.43
E-ACA M-CAT 84 81 95.24
E-ACA M-CAA 126 120 97.83
E-AAC M-CAA 138 135 96.67
总带数Total bands 661 639 –
平均Average 110 107 96.61


2.2 遗传相似性分析
遗传相似系数揭示, 供试材料的遗传相似系数变化范围在0.138–0.759, 说明供试材
料遗传变异很大。其中No. 11本地一枝黄花与其他所有供试材料的遗传相似系数较低, 仅
为0.138–0.276; 与国内野外采集材料的遗传相似系数在0.175–0.276; 与No. 12加拿大样
品的遗传相似系数为0.211。这与一枝黄花和加拿大一枝黄花属于同属不同种的分类地位
是吻合的。所有“黄莺花”和No. 11一枝黄花的遗传相似系数在0.138–0.244, 是很低的, 说
明“黄莺花”与一枝黄花亲缘关系较远。“黄莺花”与所有加拿大一枝黄花遗传相似系数
在0.174–0.432, 表明鲜切花与加拿大一枝黄花的亲缘关系较一枝黄花近。加拿大一枝黄
花各种群之间的遗传相似系数在0.211–0.759, 表明种群间丰富的遗传多样性。
2.3 UPGMA聚类分析结果
对45份样品扩增出的661条带用MVSP3.1软件进行UPGMA(Unweighted Pair Group
Method Using Arithmetic Average)聚类分析, 得到聚类图(图1)。首先, 当取截集水平在
0.138时, 可将No. 11本地一枝黄花与其他所有供试样品分开, 这说明其他样品之间亲缘
关系较近, 和本地一枝黄花亲缘关系较远; 图中所有国内野外采集的样品聚在一起, 说
明各采集样品亲缘关系较近; 而从花卉市场收集的各种鲜切花聚为复杂的6类, 除少数
样品外, 大致具有一段时间所取样品聚为一类的规律性, 这可能是由于一批样品来自于
一个花农, 而同一个花农的这些产品则来自相似遗传背景的繁殖体。有趣的是, 加拿大采
集的样品No. 12在聚类图中分在鲜切花的中间。因此, 我们推测除No. 11本地一枝黄花样
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图1 45个供试样品的聚类图
Fig. 1. UPGMA dendrogram based on the similarity of AFLP patterns of all materials.


品外的所有样品都属于加拿大一枝黄花的复合种(Melville & Morton, 1982)。
2.4 ITS区分析结果
2.4.1 ITS区和5.8S rDNA PCR产物序列分析 PCR产物经纯化测序后得到628–629 bp
不等长度的片段, rDNA ITS区起始端和终点参考GenBank中登录号为AF477665的加拿大
一枝黄花的ITS区段序列。其中5.8S rDNA片段长164 bp, 且所有供试材料序列完全一致,
碱基差异出现在ITS区。ITS1区片段长度均为252 bp。ITS2区片段长度除No. 11为213 bp,
其余均为212 bp。具体差异列于表2。
2.4.2 系统发育树的构建 从GenBank中查找一枝黄花属的7个近缘种 , Solidago
gigantea Ait.、S. flexicaulis L.、S. juncea Ait.、S. petiolaris Ait.、S. sempervirens L.、Solidago
shortii Torr. & Gray、S. fistulosa Mill.的ITS区序列, 序列登录号分别为DQ005980、
DQ005979、DQ005981、AF046968、AF477668、AY523854、AF477667, 片段长度在625–630
bp之间, 大多是628 bp (Noyes & Rieseberg, 1999; Urbatsch et al., 2003; Beck et al., 2004;
Kress et al., 2005)。
用MEGA 3.1软件分析, 采用最大简约法(Maximum Parsimony, MP)建立系统发生树
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(图2)。


表2 供试材料ITS区差异性位点
Table 2 Variable sites in ITS sequences of samples
变异位点
Variable sites
73 431 469 513 554 594 610 611 612 618
No. 1 C A C T G C G T G –
No. 12 C A C C G C G T G –
No. 19 C A C T G C G T G –
No. 20 T A C T G C G T G –
No. 31 C A C T G C G T G –
No. 38 C A C T G C G T G –
No. 41 T A C T G C G T G –
No. 42 T A C T G C G T G –
No. 44 T A C T G C G T G –
AF477665 C A C T G N G T G –
No. 11 C G A C A C T C A T
–为碱基缺失。–, Indicates a gap.


图2 用MEGA3.1分析得出的系统发生树
Fig. 2. Phylogenetic tree reconstructed using MEGA3.1.


从图2可以看出, 采用最大简约法处理的自展值比较高, “黄莺花”样品和野外采集
样品距离较近聚在一起, 再结合Solidago gigantea成为一支; 同时“黄莺花”之间存在一
定的变异, 根据遗传距离的远近, No. 1、No. 19、No. 31、No. 38聚为一类, No. 20、No. 41、
4期 马玲, 强胜: 利用分子标记技术对鲜切花“黄莺花”的鉴定和分类 503
No. 42、No. 44聚为另一类, 这和AFLP的聚类结果一致; 从图中还可以看出, 加拿大一枝
黄花近缘种各自存在差异, No. 11本地一枝黄花与其他近缘种、鲜切花、加拿大一枝黄花
分开, 独自成为一支。所以可以推测: “黄莺花”非本地一枝黄花, 应该属于加拿大一枝
黄花复合种。
3 讨论
加拿大一枝黄花的危害性受到全社会的日益关注, 鉴定花店里出售的类似加拿大一
枝黄花的“黄莺花”所属种, 对加强外来入侵种加拿大一枝黄花的管理十分必要。河南
因为管理“黄莺花”的种植在执法过程中引发了纠纷(冯保军等, 2006), 云南也有类似事
件, 即关于是否应对种植“黄莺花”作为鲜切花出售加强管理引发争议, 其主要原因就是
因为对中国广泛发生的加拿大一枝黄花和“黄莺花”的遗传背景和分类地位的界定缺乏
科学依据(高明, 2005)。一枝黄花属有100多个种, 属内分类学地位和命名一直就是相当复
杂的, 原因就是存在种内变异和地理渐变群(Werner et al., 1980)。加拿大一枝黄花是一种
具有至少6个染色体数目的亚种或变种组成的多倍体复合体(polyploid complex, Solidago
canadensis L. complex)(Melville & Morton, 1982; 董梅等, 2006)。加拿大一枝黄花复合种
是指一枝黄花属subgen. Virgaurea Nutt.亚属具有三簇脉的近缘种类(Melville & Morton,
1982), 它们包括粗糙一枝黄花S. altissima L.、加拿大一枝黄花S. canadensis、S. elongata
Nutt.、S. gigantea、S. gilvocanescens (Rydb.) Smyth、S. lepida DC.、S. pruinosa Greene、 S.
salebrosa (Piper) Rydb.、S. scabra Muhl.和S. serotina Ait.等。它们在形态上十分相似, 很
难区分, 其中许多被看作种下类群(Melville & Morton, 1982)。它们的起源问题也一直是
个“谜”。Gleason和Cronquist (1963)认为加拿大一枝黄花有4个变种, Scoggan (1979)认为
有5个变种, 现在被广泛承认并由官方公布的有6个变种(董梅等, 2006)。从一枝黄花属已
知各个种的ITS区序列分析可以看出, 该属的演化速度是非常慢的。种间差异是存在的,
但是较小。从上述ITS区序列分析的研究结果可以认为“黄莺花”的No. 19、No. 31、No.
38号样品就是入侵的加拿大一枝黄花, 因为它们与后者的样品聚为一类。而No. 20、No.
41、No. 42、No. 44号样品略有差异(图2), 根据其茎秆全被毛, 苞片长2.5 mm以上等形态
特征, 可以推测它们是粗糙一枝黄花。有人将粗糙一枝黄花视为一个独立的种, 也有人将
其视为加拿大一枝黄花的一个变种(Solidago canadensis var. scabra Torr. & A. Gray), 但无
论哪种分类, 它们均属于加拿大一枝黄花复合种。
分子标记技术被广泛应用于亲缘关系、系统发育和分类学研究中(Noyes & Rieseberg,
1999; Urbatsch et al., 2003; Beck et al., 2004; Kress et al., 2005)。从上述研究结果可以看出
“黄莺花”样品与中国广泛入侵生长的加拿大一枝黄花之间存在差异性; 且这两类也各
自存在遗传差异, 说明遗传多样性十分丰富, 从一个侧面也反映出加拿大一枝黄花具有
较强的适应能力, 并已经成为入侵性极强的外来杂草。
本实验中两种不同的方法得到相似的结果, 表明运用AFLP和ITS区序列分析的分子
手段鉴定“黄莺花”的种属关系是切实可行的, 并且得到“黄莺花”和加拿大一枝黄花
是一个复合种, 而并非本地一枝黄花的结果。上述研究所提供的分子证据基本上解决了
植 物 分 类 学 报 45卷 504
加拿大一枝黄花和“黄莺花”身份的争论。加拿大一枝黄花复合种中的加拿大一枝黄花
及其变种以及粗糙一枝黄花均是具有入侵性的植物(Melville & Morton, 1982)。这将为“黄
莺花”种植和市场销售的管理提供可靠的科学依据。
致谢 本实验样品采集工作得到江苏、安徽、浙江各地植保站、环保局领导、工作人员
的鼎力支持和大力帮助。本研究得到国家基础研究项目(973项目: 2002CB111402)和江苏
省科技攻关项目(BE2005349)资助, 在此一并表示衷心的感谢。
参 考 文 献
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