全 文 ：植物分类学报 46 (5): 682–691 (2008) doi: 10.3724/SP.J.1002.2008.07135
Journal of Systematics and Evolution (formerly Acta Phytotaxonomica Sinica) http://www.plantsystematics.com
真正柑橘果树类植物基于AFLP分子标记的分类与进化研究
1,2谢让金 1,2周志钦* 1邓 烈
1(中国农业科学院-西南大学柑橘研究所 重庆 400712)
2(西南大学园艺园林学院 重庆 400716)
Taxonomic and phylogenetic relationships among the genera of
the True Citrus Fruit Trees Group (Aurantioideae, Rutaceae)
based on AFLP markers
1,2Rang-Jin XIE 1,2Zhi-Qin ZHOU * 1Lie DENG
1(Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400712, China)
2(College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract Fifty-nine genotypes representing six genera of the True Citrus Fruit Trees Group (Aurantioideae,
Rutaceae) were analyzed using AFLP technique to study their taxonomic and phylogenetic relationships. Fifteen
primer combinations (out of 64 screened) were selected based on the polymorphism and quality of the bands
produced by the primer and used in the present study. A total of 312 bands were obtained, of which 305 (97.8%)
were polymorphic. The UPGMA tree of all genotypes was constructed based on the AFLP data using PAUP* beta
version 4.0b8 software. Our AFLP molecular tree clearly confirms that the True Citrus Fruit Trees Group is
monophyletic and supports the division of the group into genera mainly based on morphological characters,
except that the genus Fortunella was nested within the genus Citrus cluster (as a monophyletic sub-branch). The
subdivision of the genus Citrus into subgen. Papeda and subgen. Eucitrus as suggested by W. T. Swingle based
on morphological characters and the point of view that C. medica, C. grandis and C. reticulata are the three basic
species of the subgen. Eucitrus were also supported by our molecular data. In addition, contrary to the expectation
based on morphological data, however, our molecular data demonstrated that C. ichangensis is more closely
related to C. junos of the subgen. Eucitrus than to the C. hystrix of the subgen. Papeda. Furthermore, our study
provided the first evidence that C. mangshanensis is basal to all the loose-skin citrus types. Finally, the taxonomic
and phylogenetic relationships among the six genera and the important genotypes of the genus Citrus were dis-
cussed in detail.
Key words AFLP, evolution, molecular phylogeny, the True Citrus Fruit Trees Group.
摘要 用AFLP分子标记技术对芸香科Rutaceae柑橘亚科Aurantioideae真正柑橘果树类(the True Citrus Fruit Trees Group) 6属
植物的59个生物类型以及九里香Murraya exotica L.、蚝壳刺Severinia buxifolia Tenore和酒饼簕Atalantia buxifolia Oliv.进行了
分析。从64对引物组合中筛选出15对分辨率好的引物对全部材料进行了扩增, 共获得312条带, 其中多态型带305条, 多态位
点达97.8%。利用PAUP软件构建了全部材料基于AFLP数据的UPGMA距离树。结果表明, AFLP证据支持基于形态特征建立的
真正柑橘果树群以及群内各属的划分, 只是金柑属Fortunella Swingle作为一个独立的分支嵌于柑橘属Citrus L.内。对于柑橘
属, 我们的分子证据支持Swingle关于亚属的划分以及Scora等关于C. medica、C. grandis和C. reticulata是真正柑橘亚属subgen.
Eucitrus三个基本种的观点。AFLP分子证据显示宜昌橙C. ichangensis Swingle位于真正柑橘亚属中, 与香橙C. junos Sieb. ex
Tanaka的亲缘关系最近, 而与大翼橙亚属subgen. Papeda中马蜂柑C. hystrix DC.相隔甚远。另外, 莽山野橘C. mangshanensis S.
W. He & G. F. Liu在系统树上居于宽皮柑橘类的基部。最后, 对真正柑橘果树群6属植物间以及柑橘属各主要类型(种)的进化
关系进行了详细的讨论。
关键词 AFLP; 进化; 谱系关系; 真正柑橘果树类
Swingle和Reece (1967)根据雄蕊数目及汁胞构
造将6属植物归为真正柑橘果树类(the True Citrus
Fruit Trees Group)。真正柑橘果树类植物共有6个属,
———————————
2007-10-16 收稿, 2008-04-09 收修改稿。
* 通讯作者(Author for correspondence. E-mail: zqzhoubj@yahoo.com;
Tel: 86-23-68250029)。
谢让金等: 真正柑橘果树类植物基于 AFLP 分子标记的分类与进化研究

683
包括原产中国的金柑属Fortunella Swingle、枳属
Poncirus Raf.和柑橘属Citrus L., 以及产自澳大利亚
和新几内亚的澳沙檬属Eremocitrus Swingle、澳枳
檬 属 Microcitrus Swingle 和 多 蕊 檬 属 Clymenia
Swingle。在分类上, 该类植物属于芸香科Rutaceae
柑橘亚科Aurantioideae柑橘族Citreae的柑橘亚族
Citrinae。迄今, 柑橘属及其近缘属植物的系统进化
关系一直是柑橘分类和进化研究的重要问题之一。
柑橘属植物是世界最重要的经济作物之一, 该属的
分类、进化和重要栽培(杂)种的起源等问题一直未
有统一观点, 是迄今有待解决的科学难题。自林奈
1753年订立柑橘属至今, 在过去250余年里, 国内
外学者对柑橘属植物的分类和进化从形态到分子
展开了一系列研究, 但现有的柑橘分类系统在亚属
划分和种的数目等问题上分歧依然很大, 柑橘属植
物中真正原始野生类型的种类及数目仍无定论, 大
翼橙Papeda Swingle、宜昌橙C. ichangensis Swingle、
枸橼C. medica L.、柚C. grandis (L.) Osbeck和宽皮柑
橘C. reticulata Swingle等柑橘属主要原始野生种类
间的系统进化关系仍模糊不清, 柑橘属植物系统进
化的基本框架仍有待建立。
在形态上, 真正柑橘果树类6属植物果实汁胞
高度特化, 与柑橘亚族其他类群明显不同(Swingle
& Reece, 1967)。叶绿体DNA序列分析也证明真正
柑橘果树类是一个单系类群(Morton et al., 2003)。然
而, 在以往的研究中除真正柑橘果树类的6属植物
之外, 原始柑橘类的蚝壳刺属Severinia Tenore、近
似柑橘类的酒饼簕属Atalantia Corrêa、甚至黄皮族
Clauseninae的九里香属Murraya Koenig等都被认为
是柑橘属的近缘属植物(陈力耕等, 1991; 方德秋等,
1993; Federici, 1998; 庞晓明等, 2003)。同时也有分
子证据显示酒饼簕属和蚝壳刺属与真正柑橘果树
类有非常密切的关系(Federici, 1998)。鉴于柑橘类
果树具有很高的经济价值, 柑橘属植物种类繁多,
准确地弄清柑橘及其近缘属植物之间的系统进化
关系, 具有重要的科学和实践价值。
AFLP (amplified fragment length polymorphism)
作为一种高效、快速、可靠的DNA分子标记, 近年
来被广泛用于葡萄Vitis spp. (Nami, 2000)、李Prunus
salicina (Luis et al., 2001)和荔枝Litchi chinensis (易
干军等, 2003)等作物亲缘关系研究。尽管RFLP、
RAPD、AFLP、SSR等DNA分子标记已被用于柑橘
属及其近缘属植物的起源、进化、谱系关系和遗传
多样性的研究, 但以往的研究在材料的选取等方面
各不相同, 其结果也不尽相同。本研究在前人工作
的基础上, 通过仔细选择真正柑橘果树类以及九里
香属等62份代表材料, 采用AFLP分子标记和分子
系统学的分析技术, 旨在: (1)研究真正柑橘果树类
各属间的系统进化关系 , 寻找柑橘属的姊妹群
(sister group); (2)分析柑橘属植物各主要类型间系
统进化的基本关系, 为最终解决柑橘属的进化和分
类问题提供新的信息。
1 材料和方法
1.1 材料
用于DNA提取的叶片材料分别采自中国农业
科学院柑橘研究所国家果树种质资源(重庆)柑橘圃
(CRI) 和美国国家柑橘与枣椰子种质资源圃
(USDA-ARS National Clonal Germplasm Repository
for Citrus and Dates, CAL)。全部材料包括真正柑橘
果树类6个属以及九里香、酒饼簕和蚝壳刺, 共计62
个生物类型, 详见表1。
1.2 实验方法
叶片总DNA提取采用改良的CTAB法(刘勇等,
2005)。AFLP分析参考Vos等(1995)的方法, 银染分
析参考Bassam等(1991)的方法。
1.3 数据分析
将AFLP图谱上清晰可靠的条带记为1, 同一位
置没有出现带的记为0, 获得0, 1矩阵。用PAUP*
beta version 4.0b8软件 , 采用非加权组平均法
(unweighted pair-group method with arithmetic
means, UPGMA)构建全部材料的UPGMA树。
2 结果和分析
2.1 AFLP扩增片段的多态性
从64对选择性引物组合中筛选出15对分辨能
力强的引物, 分别为:
E-AAC/M-CAA、E-AAC/M-CAC、E-AAC/M-
CAT、E-AAC/M-CTA、E-AAC/M-CTT、E-AAG/M-
CAC 、 E-ACT/CTT E-ACG/M-CTA 、 E-AGC/M-
CAA、E-AGC/M-CAC、E-AGC/M-CAG、E-AGC/M-
CTA、E-AGC/M-CTC E-AGG/M-CAA、E-AGG/M-
CTG。对62份供试材料的基因组DNA进行扩增, 共
植物分类学报 Journal of Systematics and Evolution 2008 46卷5期 684
表1 材料来源
Table 1 Plant materials used in the present study
分类群 Taxon 采集地 Locality 凭证标本 Voucher
九里香 Murraya paniculata L. CRI 江东（J. Dong）LB0003
蚝壳刺 Severinia buxifolia (Poir.) Tenore CAL Robert R Krueger Accession No. PI 539795
酒饼簕 Atalantia buxifolia (Poir.) Oliv. CRI 江东（J. Dong）LB0006
富民枳 Poncirus polyandra S. Q. Ding, X. N. Zhang, Z. R. Bao & M. Q. Liang CRI 江东（J. Dong）LT0129
枳 P. trifoliata (L.) Raf. CRI 江东（J. Dong）LT0021
飞龙枳 P. trifoliata var. monstrosa (T. Ito) Swingle CRI 江东（J. Dong）LT0083
多蕊柑 Clymenia polyandra Tanaka CAL Robert R Krueger Accession No. PI 263640
澳砂檬 Eremocitrus glauca (Lindl.) Swingle CAL Robert R Krueger Accession No. PI 539717
澳圆檬 Microcitrus australis (Planch.) Swingle CAL Robert R Krueger Accession No. PI 306117
澳指檬 Microcitrus australasica (F. Muell.) Swingle CRI 江东（J. Dong）LB0005
马蜂柑 Citrus hystrix DC. CRI 江东（J. Dong）LP0009
小花大翼橙 C. micrantha Wester CAL Robert R Krueger Accession No. PI 539694
马来西亚 C. macroptera Montr CRI 江东（J. Dong）LP0095
墨西哥莱檬 C. aurantifolia (Christm.) Swingle CRI 江东（J. Dong）LM0003
西里伯大翼橙 C. celebica Koord CAL Robert R Krueger Accession No. PI 539182
枸橙 C. medica L. CRI 江东（J. Dong）LM0029
佛手 C. medica var.sarcodactylis Swingle CRI 江东（J. Dong）LM0019
香圆 C. medica L. CRI 江东（J. Dong）LP0012
巴柑檬 C. bergamia Risso CRI 江东（J. Dong）LM0069
尤力克 C. limon (L.) Burm. CRI 江东（J. Dong）LM0084
费米耐劳 C. limon (L.) Burm. CRI 江东（J. Dong）LM0078
广西土黎檬 C. limonia Osbeck CRI 江东（J. Dong）LM0032
红黎檬 C. limonia Osbeck CRI 江东（J. Dong）LM0002
兰卜 C. limonia Osbeck CRI 江东（J. Dong）LM0001
粗柠檬 C. jambhiri Lush. CRI 江东（J. Dong）LM0094
卡西大翼橙 C. latipes (Swing.) Tan. CAL Robert R Krueger Accession No. PI 230987
琯溪蜜柚 C. maxima (Burm.) Merrill CRI 江东（J. Dong）LG0038
晚白柚 C. grandis (L.) Osbeck CRI 江东（J. Dong）LG0026
沙田柚 C. grandis (L.) Osbeck CRI 江东（J. Dong）LG0002
长寿金柑 Fortunalla obovata Tanaka CRI 江东（J. Dong）LF0030
圆金柑 F. japonica Swingle CRI 江东（J. Dong）LF0011
金豆金柑 F. hindsii Swingle CRI 江东（J. Dong）LF0024
金弹金柑 F. crassifolia Swingle CRI 江东（J. Dong）LF0006
罗浮金柑 F. margarita (Lour.) Swingle CRI 江东（J. Dong）LF0005
江北香橙 C. junos Sieb. ex Tanaka CRI 江东（J. Dong）LP0002
香橙 C. junos Sieb. ex Tanaka CRI 江东（J. Dong）LP0003
大种橙 C. ichangensis Swingle CRI 江东（J. Dong）LP0043
4号宜昌橙 C. ichangensis Swingle CRI 江东（J. Dong）LP0057
宜昌橙 C. ichangensis Swingle CRI 江东（J. Dong）LP0055
莽山野橘 C. mangshanensis S. W. He & G. F. Liu CRI 江东（J. Dong）LR0405
三保柑 C. sulcata Hort. & Tan CRI 江东（J. Dong）LG0133
代代 C. aurantium L. CRI 江东（J. Dong）LA0003
构头橙 C. aurantium L. CRI 江东（J. Dong）LA0008
马叙 C. paradisi Macf. CRI 江东（J. Dong）LG0093
邓肯 C. paradisi Macf. CRI 江东（J. Dong）LG0092
普通甜橙 C. sinensis (L.) Osb. CRI 江东（J. Dong）LS0306
伏令夏橙 C. sinensis (L.) Osb. CRI 江东（J. Dong）LS0049
路比甜橙 C. sinensis (L.) Osb. CRI 江东（J. Dong）LS0037
本地广橘 C. reticulata Blanco CRI 江东（J. Dong）LR0326
槾橘 C. tardiferax Hort. ex Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0029
温州蜜柑 C. unshiu Marcow. CRI 江东（J. Dong）LR0111
瓯柑 C. suavissima Hort. ex Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0082

谢让金等: 真正柑橘果树类植物基于 AFLP 分子标记的分类与进化研究

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表1 (续) Table 1 (continued)
分类群 Taxon 采集地 Locality 凭证标本 Voucher
焦柑 C. tankan Hayata CRI 江东（J. Dong）LR0022
立花橘 C. tachibana (Mak.) Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0215
印度野橘 C. indica Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0419
南丰蜜橘 C. reticulata Blanco CRI 江东（J. Dong）LR0012
朱橘 C. succosa Hort. ex Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0144
朱红橘 C. erythrosa Hort. ex Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0032
土橘 C. chuana Hort. ex Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0347
红橘 C. tangerina Tanaka CRI 江东（J. Dong）LR0633
酸橘 C. sunki Hort. ex Tanaka. CRI 江东（J. Dong）LR0039
道县野橘 C. daoxianensis S. W. He & G. F. Liu CRI 江东（J. Dong）LR0050
CAL, 美国国家柑橘与枣椰子种质资源圃; CRI,中国农业科学院柑橘研究所。
CAL, USDA-ARS National Clonal Germplasm Repository for Citrus and Dates; CRI, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences.































图1 引物组合E-ACT/M-CTT获得的全部材料AFLP图谱
Fig. 1. AFLP fingerprints of 62 accessions produced by E-ACT/M-CTT primer combination.


扩增出312条带, 其中多态性带305条。平均每组引
物扩增出20.8条带, 多态性条带平均为20.3条, 多
态位点百分率达97.8%。图1是引物E-ACA/M-CTG
对62份材料的扩增结果。
2.2 聚类分析
基于AFLP分子标记的0, 1数据矩阵, 用PAUP*
beta version 4.0b8软件中UPGMA方法进行聚类分
析, 构建了本实验62份种质材料的树状图(图2)。从
图2可以看出, 除Murraya、Atalantia和Severinia以
外, 真正柑橘果树类6属植物构成一个单系类群,
并得到99%的统计支持。在真正柑橘果树类内部,
枳属的3份代表材料, 枳Poncirus trifoliata (L.) Raf.、
富民枳P. polyandra S. Q. Ding, X. N. Zhang, Z. R.
Bao & M. Q. Liang和飞龙枳P. trifoliata var. mon-
strosa (T. Ito) Swingle首先形成单一分支(支持率
99%)并同其他属分离开。然后, 分布于澳大利亚和
新几内亚的澳沙檬属Eremocitrus Swingle、澳枳檬
属Microcitrus Swingle和多蕊檬属Clymenia Swingle
构成一分支(支持率84%), 并与柑橘属和金柑属全
部材料所组成的分支构成姊妹群关系。在这两属构
植物分类学报 Journal of Systematics and Evolution 2008 46卷5期 686


图2 全部材料基于AFLP数据的UPGMA聚类图
Fig. 2. The UPGMA of the citrus accessions analyzed in this study based on AFLP markers.

成的分支内部 , 金柑属的代表材料罗浮金柑F.
margarita (Lour.) Swingle 、圆金柑 F. japonica
Swingle、金豆金柑F. hindsii Swingle、金弹金柑F.
crassifolia Swingle和长寿金柑F. obovata Tanaka构
成一单系分支(支持率90%), 与柑橘属的柚形成没
有统计支持的姊妹群关系。在柑橘属内部, 马蜂柑
C. hystrix、小花大翼橙C. micrantha以及马来西亚大
翼橙C. macroptera先成一单支与其他类型分离(支
持率82%), 而形成Swingle系统中的大翼橙亚属和
真正柑橘亚属关系。在Swingle系统的真正柑橘亚属
(Subgenus Eucitrus)中 , 枸橼C. medica、柠檬C.
limon、莱檬C. aurantifolia和黎檬C. limonia形成一
分支 (枸橼类 , 71%); 宜昌橙与香橙形成一分支
(54%); 柑类和橘类形成一分支(宽皮柑橘类, 无支
持率); 柚与卡西大翼橙成为一分支(柚类, 无支持
率)。在这些分支中, Scora (1975)提出的真正柑橘亚
属三个基本种枸橼C. medica、柚C. grandis和宽皮柑
橘C. reticulata均与其近缘类群形成独立分支(图2)。
3 讨论
3.1 真正柑橘果树类各属间的系统进化关系
Swingle和Reece (1967)根据金柑属、枳属、柑
橘属、澳沙檬属、澳枳檬属和多蕊檬属等6属植物
的果实汁胞高度特化将其归为一群 , 但无论是
Swingle还是Tanaka, 都只有各属间亲缘关系的推
测, 而没有种系发生关系的详细分析。根据枳的落
叶性和三出复叶等独特性状将枳与真正柑橘果树
类的另外5属分离开来, 恢复其属地位, 并认为枳
属是真正柑橘果树类中一个孤立的类群 (Swingle,
1914; Swingle & Reece, 1967)。周志钦(1991)利用分
支分析的方法对这6属植物形态性状的分析结果表
谢让金等: 真正柑橘果树类植物基于 AFLP 分子标记的分类与进化研究

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明, 枳属、金柑属和柑橘属并未构成一个单系类群,
其中枳属一开始就与其余2属分离开了。Federici
(1998)认为枳属与柑橘属之间的关系比澳枳檬属与
柑橘属之间的关系要远。但黄成就(1997)推测, 枳属
可能是从柑橘属分化产生。在本研究中, 枳属与另
外5属首先分离, 形成一独立分支, 这一结果与形
态学证据(Swingle & Reece, 1967; 周志钦, 1991)和
其他DNA分子标记(Federici, 1998; 庞晓明等, 2003)
一致, 而不支持黄成就(1997)关于枳在真正柑橘果
树类中进化关系的推测。
Mabberley (1998)根据形态特征建议将澳枳檬
属和澳沙檬属重新归类到柑橘属中。花粉超微结构
观察(Kozaki & Hirai, 1981)、同功酶分析(Herrero et
al., 1996)以及分子标记研究等研究发现, 澳枳檬属
与柑橘属存在密切的亲缘关系。Federici (1998)认为
除了金柑属以外澳砂檬属与柑橘属之间的亲缘关
系最近。然而, 在形态性状的分支分析中, 与该两
属地理分布近缘的多蕊檬属被认为是柑橘属的姊
妹群(周志钦, 1991), 这与Swingle (1967)从形态上
研究的结果吻合。另外, SSR分子标记研究也表明多
蕊檬属与柑橘属间存在亲密关系(庞晓明等, 2003)。
从地理分布上看, 在多蕊檬属和金柑属的分布区域
内, 均有柑橘属分布, 但却未有枳属、澳枳檬属和
澳砂檬属。在本研究中, 分布于澳大利亚和新几内
亚的澳沙檬属Eremocitrus Swingle、澳枳檬属
Microcitrus Swingle和多蕊檬属Clymenia Swingle构
成一分支(自展支持率84%), 并在枳属之后与柑橘
属和金柑属全部材料组成的分支构成姊妹群。
Swingle和Reece (1967)认为金柑属和柑橘属在
形态上存在明显的差异, 金柑属在真正柑橘果树类
中是最单一和原始的属, 而柑橘属代表了最高级进
化类型。这一观点得到叶绿体DNA (cpDNA)证据的
支持(Green et al., 1986; Nicolosi et al., 2000)。Esen
和Rainer (1977)对柑橘属及其近缘属同工酶研究也
表明, 金柑属存在特有的酶带。然而在DNA水平上,
RFLP、RAPD和SCAR等分子标记无法将金柑属与
柑橘属完全分离(Federici, 1998; Nicolosi et al.,
2000)。据本研究结果表明, 金柑属以单系分支(支持
率90%)嵌在柑橘属内部, 介于柚和宜昌橙之间(图
2), 这与同功酶研究结果一致 (朱立武 , 1988;
Herrero et al., 1996), 并得到了RFLP (Federici et
al., 1998)、RAPD和SCAR (Nicolosi et al., 2000)等证
据支持, 但与形态学证据不一致。根据上述报道可
以看出, 有关金柑属在真正柑橘果树类6属植物中
的进化位置现有的结果仍然分歧很大, 有待进一步
研究。
综上所述, 有关真正柑橘果树类各属间的进化
关系, 现有的证据基本支持枳属是最早分离出来的
原始属, 其次是澳沙檬属和澳枳檬属。多蕊檬属、
金柑属与柑橘属在真正柑橘果树类中的进化关系
仍待进一步查清, 特别是金柑属与柑橘属的关系及
其在真正柑橘果树类中的系统位置仍待进一步研
究。
3.2 柑橘属植物系统进化的基本框架
自林奈1753年订立柑橘属以来, 迄今关于该属
植物中真正原始野生类型的种类和数目仍无定论。
世界两大著名柑橘分类系统 , 美国的Swingle和
Reece (1967)将柑橘属分为真正柑橘亚属subgen.
Eucitrus和大翼橙亚属subgen. Papeda, 包括16个种;
而日本的Tanaka (1969)将柑橘属分为初生柑橘亚属
subgen. Archicitrus Tanaka和后生柑橘亚属subgen.
Metacitrus Tanaka, 并在亚属下面有区、亚区、类和
亚类等次级分类单位, 共分28个基本型, 包括159
种和14个变种。Scora (1975)以及Barrett和Rhodes
(1976)根据化学分类学和形态性状的数值分析结果,
提出Swingle真正柑橘亚属(10种)中只有三个真正
生物学种, 即柚、枸橼和宽皮柑橘, 其余皆是杂种
或后生变异类型。周志钦(1992a)对柑橘属24个分类
群进行形态学分支分析, 结果表明柑橘属内有5个
单系类群, 即马蜂柑C. hystrix、枸橼类Citrophorum、
柚类Cephalocitrus、宽皮柑橘类Acrumen和橘亚类
Microacrumen。方德秋等(1993)根据同工酶和形态
分析结果, 提出大翼橙类、宜昌橙类、枸橼类、柚
类以及小果橘类是柑橘属的5个“基因源”。上述
研究报道表明, 大翼橙、枸橼、柚和宽皮柑橘等是
柑橘属植物的原始野生类型。但同工酶(方德秋等,
1993)和形态学证据(周志钦, 1993)都表明宜昌橙也
是柑橘属植物中一个非常特殊的原始野生类型, 并
且DNA分子证据 (Federici, 1998; Nicolosi et al.,
2000; 庞晓明等, 2003) 显示大翼橙可能不是一个
单系类群。另外, 宽皮柑橘是否单系起源也有待进
一步证实(周志钦, 1992b; 方德秋等, 1993)。事实上,
Swingle和Reece (1967)以Citrus reticulata代表宽皮
柑橘类型, 但同时又给予立花橘C. tachibana和印度
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野橘C. indica种的地位。本研究结果表明, 在前人报
道的有关柑橘属的主要野生类型中大翼橙类、宜昌
橙类、枸橼类、柚类以及宽皮柑橘类均得到支持(图
2)。同时, 我们的AFLP距离树支持宽皮柑橘单系起
源观点。
据报道, 大翼橙是柑橘属植物中最原始的类型
(曾勉, 1960; Tanaka, 1977; 周志钦, 1992a; 方德秋
等, 1993)。Tanaka (1977)认为, 真正柑橘亚属的莱
檬C. aurantifolia由大翼橙演化而来, 莱檬衍生出枸
橼和柚, 柚再产生橙类, 然后是宽皮柑橘的演化。
但Swingle和Reece (1967)认为, 枸橼不可能来源于
莱檬, 而莱檬则可能是枸橼和柚的杂种。叶绿体
DNA的PCR-RFLP分析(Nicolosi et al., 2000)仅支持
真正柑橘亚属起源于大翼橙。肖尊安(1984)提出枸
橼和柚可能来源于大翼橙, 并得到细胞学(梁国鲁,
1988)、化学分类学(朱立武, 1988)以及DNA分子
(Federici, 1998)证据的支持。本研究结果大翼橙类
的马蜂柑等首先同柑橘属的其他类型中分离出来,
这一结果支持大翼橙是柑橘属中最原始的类型, 并
与形态学Swingle和Reece (1967)、细胞学(梁国鲁,
1988)、化学分类学(朱立武, 1988)以及DNA分子
(Federici, 1998)证据一致。Swingle和Reece (1967)以
翼叶大小、汁胞中含有苦油滴等特征, 将宜昌橙与
大翼橙归为一类。然而Tanaka (1969)根据宜昌橙为
单花、无花序等特征, 将其归入后生柑橘亚属的原
始香橙亚区Protosmocitrus Tanaka。有关宜昌橙在柑
橘属中的进化位置, 叶荫民等(1982)认为宜昌橙花
粉具有典型的原始性状, 钟广炎和叶荫民(1993)认
为宜昌橙是柑橘属中独立发生的一个古老种。蛋白
质数量化学分类(朱立武, 1988)和孢粉学研究(叶荫
民等, 1982)也一致认为宜昌橙与大翼橙的关系更近。
但本文研究结果更支持Tanaka的宜昌橙与后生柑橘
亚属的香橙的亲缘关系更近的观点。另据报道, 肖尊
安(1984)利用同功酶研究指出, 橘可能是从宜昌橙
演化而来。李润唐(1992)根据同工酶分析认为宜昌橙
通过中间类型莽山野橘有可能成为宽皮柑橘(立花
橘)的祖先, 并得到叶绿体DNA酶切数据(Torres et
al., 1978)的支持。综合上述信息, 宜昌橙在柑橘属演
化中所起的重要作用仍有待进一步查清, 也不排除
其杂种起源的可能性。真柑橘亚属3个基本种之间分
化的先后在前人的报道中未有涉及, 从本文的结果
看, 其演化顺序是枸橼、柚和宽皮柑橘。但由于缺乏
统计率的支持, 要下明确的结论还需新的证据。
3.3 一些重要柑橘类型的起源问题
由于柑橘的珠心胚、属种间易于杂交、无性变
异以及悠久的栽培历史, 使柑橘分类与进化研究进
展十分缓慢(方德秋等, 1993)。一些重要生物型的起
源问题迄今仍无定论。
葡萄柚 数值分类研究 (Barrett & Rhodes,
1976)、细胞学(梁国鲁, 陈全友, 1994)和同工酶研究
(吴安仁等 , 1985)均肯定葡萄柚为杂种起源。
Nicolosi等(2000)认为葡萄柚可能是柚和甜橙回交
产生。Scora和Kumamoto (1983)根据化学分类研究
结果肯定了甜橙是一亲本, 并得到多数学者赞同
(Barrett & Rhodes, 1976; Torres et al., 1978)。方德
秋等(1993)分析了柑橘属及其5个近缘属的过氧化
物酶等8种酶系统 , 肯定葡萄柚带有柚的血缘。
cpDNA证据(Nicolosi et al., 2000)支持甜橙是葡萄柚
的亲本。在本文的研究结果中, 葡萄柚与甜橙和酸
橙构成一单系分支(但与甜橙之间的关系更为密切,
图2), 并与除莽山野橘之外的全部宽皮柑橘类型形
成一个具有77%统计支持的单系分支, 这一结果与
前人报道是一致的。
莱檬 Swingle (1913)认为莱檬可能是枸橼和
柚的杂种(Swingle & Reece, 1967), 但Tanaka (1969)
认为莱檬来源于大翼橙。同功酶研究(肖尊安, 1984)
支持Swingle的观点, 但Torres等(1978)支持Tanaka
的观点, 认为莱檬可能是枸橼和大翼橙亚属成员间
的一个杂种。Torres等(1978)认为莱檬可能是大翼橙
与枸橼杂交的后代。数值分类学研究结果表明, 莱
檬可能来自枸橼、柚和澳指檬属Microcitrus的一种
的属间3个种间杂交的产物 (Barrett & Rhodes,
1976)。叶黄酮研究(Dass et al., 1977, 1978 )肯定莱檬
与枸橼的关系。Handa等(1986)分离I蛋白电泳分析
谱带表明, 宽皮柑橘是亲本之一, 另外一个亲本可
能是枸橼、柚和大翼橙之一。在DNA分子水平 ,
Federici (1998)通过RFLP和RAPD分析支持枸橼是
莱檬亲本。另外, 有学者(Barrett & Rhodes, 1976)认
为墨西哥莱檬C. aurantifolia (Christm.) Swingle是杂
种起源, cpDNA (Nicolosi et al., 2000)支持小花大翼
橙是墨西哥莱檬的亲本之一。据上述报道, 现有证
据说明莱檬同柑橘属的枸橼、柚、大翼橙、宽皮柑
橘以及澳指檬属均有联系, 其中形态学、同功酶、
蛋白质、叶黄酮和RFLP等一致支持枸橼是莱檬杂种
谢让金等: 真正柑橘果树类植物基于 AFLP 分子标记的分类与进化研究

689
起源的亲本之一。在本研究中, 墨西哥莱檬首先和
西里伯大翼橙相聚(支持率52%), 然后两者与枸橼
形成一支持率为72%的分支; 该分支与巴柑檬(莱
檬的另一份代表材料)和柠檬形成的分支(支持率
58%)共同组成一个具有71%统计支持的分支(图2)。
这一结果一方面肯定支持枸橼是莱檬的亲本之一,
另一方面也在一定程度上支持Tanaka和Torres等的
观点。弄清莱檬复杂的起源对今后研究柑橘属植物
其他生物型的起源和进化有重要作用。
柠檬 关于柠檬起源现有报道分歧很大。Malix
等(1974)认为, 枸橼、莱檬和另一未知类型为柠檬的
基因来源。Barrett和Rhodes (1976)推测, 柠檬可能
是枸橼、柚和澳枳檬的杂交后代。细胞学的证据(梁
国鲁 , 1988)支持柠檬为杂种起源。同工酶分析
(Torres et al., 1978)认为, 枸橼、莱檬和粗柠檬可能
参与了柠檬的起源。数值分类研究 (Barrett &
Rhodes, 1976)也支持它是一个三亲杂种。然而
Torres 等(1978)则认为该生物类型不是枸橼和莱檬
的杂种, 并猜测酸橙是其亲本之一, 该观点得到
Kozaki和Hirai (1981)的支持。DNA分子标记研究
(Federici, 1998)认为枸橼是柠檬的亲本之一。
cpDNA (Nicolosi et al., 2000)认为香橼是柠檬的父
本, 而酸橙为母本。据上述报道, 现有证据说明柠
檬同柑橘属的枸橼、莱檬、柚、酸橙以及澳指檬属
均有联系, 其中比较一致的观点是枸橼是柠檬杂种
起源的亲本之一, 而对其他亲本存在明显争议。在
AFLP分子树上, 柠檬与黎檬、莱檬先形成一没有高
统计支持率的分支(支持率58 %), 然后与枸橼等构
成一个具有71% 统计支持的分支。这一结果同枸橼
是柠檬杂种起源的亲本之一的观点是一致的, 同时
说明柠檬与黎檬和莱檬有很近的亲缘关系。
香橙 Swingle和Reece (1967) 认为香橙是宽
皮柑橘与宜昌橙的杂种, 并得到同功酶证据(李文
斌等, 1987; 方德秋等, 1993)的支持。在本研究中,
普通香橙和江北香橙首先聚在一起(支持率99%),
然后同宜昌橙构成仅具有54%统计支持的分支(图
2)。这一结果与同功酶证据一致, 支持宜昌橙是香
橙杂种起源的亲本之一。至于香橙与宽皮柑橘的关
系, 朱立武(1988)对叶片蛋白质电泳谱带相似性分
析结果表明, 江北香橙可能是普通香橙和宽皮柑橘
的回交后代。方德秋等(1993)根据同功酶数据认为
江北香橙属于宽皮柑橘的类型, 并推测是香橙进一
步与宽皮柑橘回交的后代。对于这一点, 本研究未
能提供有用信息。
酸橙 细胞学研究(梁国鲁, 1990)认为酸橙为
杂种起源, 并且柚是其可能的亲本之一。方德秋等
(1993)认为酸橙可能是柚与宽皮柑橘的杂交后代。
Scora等(1983)据化学分类研究结果, 认为酸橙是柚
和宽皮柑橘的杂种, 这些观点得到了数值分类学
(Barrett & Rhodes, 1976)、同工酶(Torres et al., 1978;
方德秋等, 1993)、RAPD、SCAR分子标记(Nicolosi et
al., 2000)、化学分类研究(Scora & Kumamoto, 1983;
Dass et al., 1977)和数量化学分类(朱立武, 1988)的
广泛支持。Malix等(1974)对叶精油分析排除了酸橙
可能是甜橙芽变或甜橙与宽皮柑橘杂交产生的可
能性, 而cpDNA (Nicolosi et al., 2000)进一步证实柚
是酸橙杂种起源的母本。在本研究结果中, 酸橙、
葡萄柚和甜橙聚在一统计支持率仅为58%的分支,
并且该分支嵌合在全部宽皮柑橘组成的单系里(图
2)。这一结果支持酸橙与宽皮柑橘的密切关系, 与
前人的证据一致。
甜橙 Scora (1975)提出甜橙和酸橙均是柚和
宽皮柑橘的杂种。Barrett和Rhodes (1976)认为, 甜
橙和酸橙具有相同的起源, 但甜橙是柚与宽皮柑橘
多形种(polytypic species)内不同亚种杂交产生的,
化学分类研究 (Dass et al., 1977)支持Barrett等的观
点。细胞学研究(梁国鲁, 1990)支持甜橙的杂交起源,
并认为柚是其亲本之一, 而蛋白质电泳分析(Malix
et al, 1974)支持宽皮柑橘为其亲本之一。DNA分子
标记(RAPD、SCAR)支持甜橙是柚和橘的杂交而产
生, 而cpDNA证据(Nicolosi et al., 2000)进一步说明
柚是其母本。此外, 同工酶基因型分析(Torres et al.,
1978)指出甜橙不可能是柚和宽皮柑橘的F1杂种。综
合前人研究结果, 甜橙的起源与柚和宽皮柑橘都可
能有关系。在本研究结果中, 酸橙、葡萄柚和甜橙
聚在宽皮柑橘组成的单系里形成一统计支持率仅
为58%的亚分支(图2), 这一结果支持甜橙与宽皮柑
橘的密切关系, 与前人的证据一致。
温州蜜柑 同工酶数据与形态学证据一致支
持温州蜜柑是黄岩本地广橘的实生变异, 但Tanaka
认为温州蜜柑是早橘、本地早橘或槾橘中的一种
(方德秋等, 1995)。本研究结果(图2)表明, 温州蜜
柑、本地广橘和槾橘三者间的亲缘关系很近(图2),
与前人的报道一致。然而, 温州蜜柑既没有同本地
植物分类学报 Journal of Systematics and Evolution 2008 46卷5期 690
广橘, 也没有同槾橘构成单系类群, 三者是一个并
系类群而槾橘处于两者之间。因此笔者认为, 温州
蜜柑有可能是杂种起源, 其与本地广橘或槾橘的关
系有待进一步查清。
印度野橘 Swingle和Reece (1967)在以Citrus
reticulata代表中国原产的全部宽皮柑橘类型的同时
又给予立花橘和印度野橘种的地位。Tanaka (1961)
将印度野橘作为一个小种归入后生柑橘亚属
subgen. Metacitrus的橘亚类subsection Microacru-
men水果蜜柑亚群subgroup Microcarpa中。Federici
(1998)认为, 印度野橘可能是卡西大翼橙或酸橙的
杂种。但RFLP 和RAPD标记 (Federici, 1998)则显
示, 枸橼和印度野橘具有最近的亲缘关系。本研究
结果表明, 印度野橘和立花橘具有很近的亲缘关
系, 其系统位置处于柑和橘之间。这一结果第一次
为印度野橘在柑橘属植物系统进化框架中的基本
位置提供了分子方面的证据。至于他同柑橘属其他
野生种类间的关系还有待新的证据。
致谢 Timothy Schubert (Florida Department of
Agriculture and consumer Services-The Division of
Plant Industry)和 Robert R Krueger (USDA-ARS
National Clonal Germplasm Repository for Citrus &
Dates, USA)提供实验材料; 钟广炎博士提供诸多技
术上的支持和建议, 谨表谢忱。本实验由国家自然
科学基金资助项目(No.30671450)资助。
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