全 文 ： 技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
原位杂交技术及其在果树研究中的应用
刘宏 牛建新* 韩晓燕
(石河子大学农学院园艺系,石河子 832003)
摘 要: 原位杂交技术是近年来快速发展起来的一门新技术, 本文介绍了原位杂交技术的基本原理、方法
及其发展前景, 以及该技术与其它生物学技术相结合而形成的一些新技术。综述了这些技术在果树研究中的应用
情况。
关键词: 原位杂交 果树
In Situ Hybridization and Its Application on Fruit Tree
LiuHong N iu Jianx in Han X iaoyan
(D epar tm ent of H orticu lture, Agricultural College of Shihez i University, Shihez i 832003)
Abstrac:t The In situ hybr idiza tion was a new techno logy w hich fast developed in recent years, th is a rtic le intro
duced the basic pr inciple, the me thod and the prospects fo r its deve lopm en t of In situ hybr id ization, as w ell as som e new
techniques wh ich are re lated w ith it. F ina lly, summ ar ized the ir app lication on fru it tree.
Key words: In s itu hybridization F ruit tree
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 30060053、30360066 ) ; 国家科技攻关计划引导项目 ( 2003BA546C ) ; 兵团科委项目
( NKB 02SDXNK01SW )
作者简介:刘宏 ( 1980)女,在读硕士,从事果树生物技术研究方面的研究
* 通讯作者:牛建新 ( 1962) ,男,博士,教授,博士生导师,从事果树与生物技术研究, Em ai:l n jx105@ 163. com
原位杂交技术 ( In situ hybridization, ISH )是分
子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门
新兴技术。 1969年美国耶鲁大学的 Ga ll和 Par
due
[ 1, 2]首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞
杂交, 将该基因进行定位, 与此同时 Buong io rno-
N ardelli和 Ama ld i等 ( 1970) [ 3]相继利用同位素标记
核酸探针进行了细胞或组织的基因定位, 从而创造
了原位杂交技术。自此以后,分子生物学技术发展
迅猛, 至 20世纪 80年代初, 分子克隆、质粒和噬菌
体 DNA构建成功,为原位杂交技术的发展奠定了深
厚的技术基础。
1 原位杂交的基本原理
原位杂交技术是应用已知碱基顺序并带有标记
物的核酸探针 ( nuc leic acid probe)与组织、细胞中的
待测核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成
杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过
组织化学或免疫组织化学方法显示核酸在细胞内的
定位和分布。此项技术为研究某个细胞中编码某种
蛋白质或多肽的相应 mRNA的分布提供了有效的
手段,可从分子水平研究某种细胞或组织内的基因
表达及有关因素的调控作用。为显示特定的核酸序
列必须具备 3个重要条件:组织、细胞或染色体的固
定;具有能与特定片段互补的核苷酸序列 (即探
针 ); 有与探针结合的标记物 [ 4 ]。
2 原位杂交的基本方法
原位杂交技术基本上包括: 探针标记、组织固
定、包埋、切片、粘片、脱蜡、蛋白酶消化、乙酰化、预
杂交、杂交、洗片、免疫检测、封片、照相等步骤。
2. 1 杂交前准备
2. 1. 1 固定 原位杂交技术在固定剂的选择和应
用上要兼顾 3个方面: ( 1)保持细胞结构; ( 2)最大
限度地保持细胞内 DNA或 RNA的水平; ( 3)使探
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
针易于进入细胞或组织。一般认为 DNA是比较稳
定的, mRNA是相对稳定且易被酶合成和降解的,
RNA却非常容易被降解的。因此对于 DNA的定位
来说, 固定剂的种类和浓度并不十分重要, 相反在
RNA定位上, 如果要使 RNA的降解减少到最低限
度,不仅要考虑固定剂的种类和浓度,而且取材后应
尽快予以冷冻或固定。在固定剂中, 最常用的是多
聚甲醛。与其他的固定剂 (如戊二醛 )不同, 多聚甲
醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接, 因而不会影
响探针穿透进入细胞或组织。其他如醋酸 酒精混
合液和 Bou in s固定剂也能获得较满意的结果。在
实际操作过程中,常需要加入较强的增强组织通透
性的试剂,如应用酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、淀
粉酶等,可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性,
提高杂交信号,但同时也会减低 RNA的保存和影响
组织结构的形态,因此在用量及孵育时间上应小心
掌握。至今多聚甲醛仍被公认为原位杂交中比较理
想的固定剂 [ 3]。
2. 1. 2 玻片和组织切片的处理
2. 1. 2. 1 玻片的处理 玻片包括盖玻片和载玻片。
应用热肥皂水刷洗,自来水清洗干净后,置于清洁液
中浸泡 24h,清水洗净烘干, 95%乙醇中浸泡 24h后
蒸馏水冲洗、烘干 (烘箱温度最好在 150 以上过夜
以除去任何 RNA酶 ) [ 5 ]。由于 ISHH 实验程序繁
杂,因此,要用黏附剂预先涂抹在玻片上, 干燥后待
切片时使用,以保证在整个实验过程中切片不致脱
落。常用的黏附剂为多聚赖氨酸。
2. 1. 2. 2 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
增强组织通透性常用的药剂有稀释的酸、清洗剂
TritonX100、乙醇、胶原蛋白酶、淀粉酶等。这种广
泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探
针的穿透性,提高杂交信号, 但同时也会减低 RNA
的保存量和影响组织结构的形态, 因此在用量及孵
育时间上应小心掌握。
蛋白酶 K ( Pro te inase K )的消化作用在 ISH中
是应用于蛋白消化的关键步骤, 其浓度及孵育时间
视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚度而定。一
般应用蛋白酶 K 1g /m l(于 0. 1mo l/L Tris/50mmo l/
L EDTA, pH8. 0缓冲液中 ) , 37 孵育 15~ 20m in,
就可以达到充分的蛋白消化作用而不致于影响组织
化学形态 [ 5]。
2. 1. 2. 3 减低背景染色 ISH中背景染色的形成
是诸多因素构成的, 杂交后的 ( post hybrid izat ion)酶
处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。预杂
交是减低背景染色的一种有效手段。预杂交和杂交
液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织
切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异杂交的目
的,从而减低背景染色 [ 6]。
2. 2 杂交
ISH的整个实验周期比较长, 实验程序也比较
繁杂,杂交前的准备只是为杂交成功奠定基础,而杂
交在整个实验中是最重要的一步。
杂交条件主要包括温度、探针浓度、长度和杂交
持续时间,对杂交信号的特异性及敏感性影响很大。
它们随探针长度及溶液与组织对探针的竞争性不同
而变化。常用杂交温度为 40 和 45 ,但其范围可
以为 37~ 60 [ 7]。探针的浓度以达到与靶核苷酸
的最大饱和度为原则,依其种类和实验需要而定,一
般浓度为 05~ 5g /m l。探针的最佳长度应在 50~
100个碱基之间。探针短易于进入细胞,杂交率高,
杂交时间短。尽管杂交信号在几小时内就可检测
到,但杂交的时间过短会造成杂交不完全,一般杂交
反应时间为 16~ 20h,为了方便起见, 可在湿盒内孵
育过夜。
杂交液成分在不同的研究中有些变化, 但都含
有盐、甲酰胺、葡聚糖、二硫苏糖醇和 RNA传递体
(如 poly(A )和酵母 tRNA )等。高浓度盐促进稳定;
甲酰胺降低杂交所需温度; 葡聚糖逐渐析出杂交液
中的水分而相应增加探针浓度以提高杂交效率; 二
硫苏糖醇减少探针的非特异性杂交背景; RNA传递
体使探针均匀分布。另外, 还有一些成分如 Den
hardt s液能减少探针的非特异性杂交, 但常被去
除 [ 8]。
2. 3 杂交后处理
杂交后处理包括系列不同浓度,不同温度的盐
溶液的漂洗,其目的是通过严格的清洗而去除过量
的探针,也可有效地减低背景染色,获得良好的反差
效果。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数
和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而异。
盐溶液的浓度一般由高到低,而温度由低到高。在
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2006年增刊 刘宏等:原位杂交技术及其在果树研究中的应用
漂洗的过程中, 切勿使切片干燥。干燥的切片即使
大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合, 从而增
强了背景染色。
2. 4 显色
根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显
影或利用酶检测系统进行不同显色处理。应用地高
辛标记的核酸探针时, 常用的免疫酶学检测方法有
两种: 一是 D igHRP(辣根过氧化物酶 )检测体系,
以 DAB(四氢氯化二氨基联苯胺 ) H 2O2为底物, 结
果为蓝色。另一是 D igAKP检测体系, 以 BCIP /
NBT为底物, 结果为蓝紫色沉淀。显色的时间和温
度、探针量、靶序列的丰度、底物浓度等因素都会影
响颜色深浅 [ 9]。
3 原位杂交技术的进展
随着分子生物学技术的迅速发展, 在最初的原
位杂交技术的基础上发展起来许多新的技术,包括
荧光原位杂交 ( fluorescence in situ hybrd ization ,
FISH ), 基因组原位杂交 ( Genom ic in situ bybridiza
t ion, G ISH ), 染色体显带技术与原位杂交技术相结
合创建了原位杂交显带技术, PCR与原位杂交技术
结合创建了原位 PCR技术 ( In situ PCR)。
3. 1 荧光原位杂交 ( fluorescence in situ hybrdiza
tion, FISH )
P inkel等 ( 1986 ) [ 10, 11]首次报道了荧光原位杂
交,即用荧光素标记探针以检测杂交信号的技术。
其原理是利用特异的 DNA探针, 标以生物素、地高
辛或荧光素,对细胞的染色体铺片或切片进行 DNA
- DNA原位杂交,其杂交定位信号用荧光显示。与
其它的 ISH方法相比, 它周期短、灵敏度高, 还可以
用不同颜色的荧光素标记 DNA探针对同一张切片
进行原位杂交,同时观测不同的 DNA探针在染色体
上的杂交位置。应用 F ISH 技术可以准确快速地构
建物理图谱,得到探针之间的顺序、方向和真实的物
理距离,是基因定位的重要手段。
3. 2 基因组原位杂交 ( Genom ic in situ bybridiza
tion, G ISH )
Landegent等 ( 1987) [ 12, 13]创建了染色体原位抑
制杂交 ( Chromosom e in situ suppression, C ISS )。这
一方法的技术关键是用重复 DNA封闭重复序列,可
避免非特异性杂交信号的干扰。提高杂交特异性和
准确性。由抑制杂交进一步衍生出来的基因组原位
杂交 ( G ISH ),可以在细胞分裂的各个时期来检测不
同染色体组的染色体, 并且可以检测出不涉及带型
明显变化的染色体断裂点及其外源染色体片段的大
小。该技术利用某个多倍体或某个杂种的一个亲本
标记的总 DNA作探针, 而另一亲本的基因组 DNA
作封阻与该多倍体或杂种的染色体进行杂交, 在杂
交的过程中标记的 DNA优先与完全同源的 DNA序
列杂交,根据杂交结果来推测异源多倍体的染色体
组成或异源染色体片段的渗入状况。因此, 它可用
于分析植物基因组结构,确定外源 DNA的插入位置
及定量分析,鉴定外源染色体片断,分析植物杂交品
种染色体成分来源以及进行近种属或品系的比较研
究 [ 14]。
3. 3 原位杂交显带技术 ( in situ hybrd izat ion ban
ding, ISHB )
Neslson等 ( 1989 )创建了原位杂交显带技术。
他利用染色体上短的、散在重复序列 ( SINES)的一
种 A luDNA基因家族作为探针与染色体标本杂交,
结果得到了类似于 R带的带型 [ 15 ]。这样进行基因
定位时,只需将目的基因探针与染色体上 SINES探
针同时应用,用不同颜色的荧光标记,便可以同时显
示出杂交信号和杂交体带型, 排除了杂交与显带之
间的相互影响。 Jiang等 ( 1993) [ 16]将染色体显带技
术与原位杂交技术相结合,首次将重复的 DNA序列
定位在黑麦染色体进行原位杂交,取得了满意的结
果。在一个片子上显带后再进行原位杂交, 既能确
定特定的染色体,又能确定探针所杂交的具体位点,
应用这种方法把多拷贝的 DNA序列和外源 DNA片
段插入点定位在经过显带的小麦染色体上。
3. 4 原位 PCR( in situ po lymerase cha in reaction, IS
PCR)
H aase等 ( 1990) [ 17]首次报道了原位 DNA多聚
酶链反应,简称原位 PCR ( in situ PCR)。该技术结
合了传统的高效扩增和原位杂交的细胞定位的优
点,能够在组织切片、细胞等样品检测到低拷贝甚至
是单拷贝的 DNA和 RNA, 并在细胞形态学上准确
定位。通过揭示细胞低拷贝核酸的分布, 可进一步
进行病毒感染、基因突变、染色体易位、基因低水平
表达等研究。原位 PCR技术主要有一下几类 [ 18]。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
3. 4. 1 直接原位 PCR ( direct in situ PCR) 使用标
记的引物或游离核苷酸进行原位 PCR反应,这种标
记分子随后进入扩增产物中,扩增结果可直接观察
而不需要进行原位杂交。直接原位 PCR具有操作
简便、流程短、省时的优点。其缺点是特异性差,易
发生引物错配或非特异性退火,易出现假阳性,标记
的引物会降低 PCR效率, 不太适于切片标本。
3. 4. 2 间接原位 PCR( ind irect in situ PCR ) 在没
有标记物的情况下进行 PCR反应, 扩增反应结束
后,再用原位杂交技术来检测扩增的信号。此方法
可以克服直接原位 PCR的缺点,但需要进行扩增反
应后的洗脱和原位杂交过程,因此实验的流程长,操
作繁琐、费时。
3. 4. 3 原位反转录 PCR( in situ reverse transcript ion
PCR ) 在原位 PCR中加上一步反转录 ( RT)过程,
以新形成的 cDNA作为模板用于扩增,这个过程称
为原位反转录 PCR(原位 RTPCR )。该方法结合了
反转录反应和 PCR扩增检测细胞或组织内低拷贝
( 10~ 20拷贝 ) mRNA或特异基因的表达。在原位
RTPCR中,首先要对组织样品进行 DNA酶处理,
以破坏组织细胞中的 DNA。 1991年, Cetus公司推
出了一种酶,可以同时执行 RT和 PCR反应,从而减
少了反应时间。
3. 4. 4 原位再生式序列复制反应 ( self- sustained
sequence rep lication reaction, IS 3SR ) 原位再生式
序列复制反应是由 Zebe等 ( 1994)首先报道的一项
直接进行原位 RNA扩增技术,它能在原位检测出单
拷贝的 RNA。该法类似于 PCR,依赖于在一恒定的
温度 ( 42 )下逆病毒复制所必需的 3种酶的活性
进行体外 mRNA扩增。
4 原位杂交技术在果树研究中的应用
原位杂交技术是分子生物学与组织化学相结合
的一种技术,它从细胞水平上在原位研究特异核酸
的分布、数量以及细胞分化、生理、病理状态、形态特
征演化之间的关系 [ 19]。由于原位杂交能在成分复
杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中
其他成分的影响,而且不需要从组织中提取核酸,而
对于组织中含量极低的外源染色体片段有极高的敏
感性, 因此, 此技术被广泛应用于植物基因组的染色
体物理作图;外源染色体和染色体片段的鉴定;物种
进化和亲缘关系的探讨;染色体变异 (异位和互换 )
的鉴定等。由于果树的遗传基础具有高度杂合性和
生活周期长,目前细胞学的研究仅限于染色体的核
型分析比较以及显带技术。在果树病毒检测方面,
牛建新等 [ 20 ]利用此技术对库尔勒香梨病毒进行了
检测。
5 展望
综上所述,原位杂交技术因其高度的灵敏性和
准确性而日益受到许多科研工作者的喜爱, 并广泛
应用于基因定位、性别鉴定和基因图谱的构建等研
究领域。在植物科学领域, 虽然由于植物组织细胞
有细胞壁覆盖和细胞质对染色体分析的干扰, 使得
该技术在植物染色体的研究上要落后于对人类和哺
乳动物的研究。但近几年来随着探针标记方法和染
色体制片技术的改进,在主要的经济作物 (小麦、玉
米等 )上也取得了大量的研究成果:例如在棉花、麦
类和树木等的遗传育种方面取得了显著的成就。同
其他的生物技术一样, 原位杂交技术在其发展与应
用的过程中会出现一些问题, 但随着原位杂交技术
的不断改进与完善,以及检测手段的改进,原位杂交
技术的优越性越来越突出,其应用也会更加广泛。
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