全 文 ：寡核苷酸芯片在微生物检测中的应用
刘旭光1, 2 宋福平1 张杰1
( 1中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100094;
2连云港师范高等专科学校初教系, 连云港 222206)
摘 要: 近几年来发展起来的基因组研究技术 基因芯片技术为微生物检测提供了一种强有力的手段。
目前国内外已广泛地开展了利用寡核苷酸芯片对多种微生物(主要是病毒和细菌,少量有真菌)进行相关检测的研
究,并在对微生物病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等方面获得了成功。由
于寡核苷酸探针具有可根据研究需要任意设计、特异性高等特点, 寡核苷酸芯片在微生物检测中有着巨大的应用
价值,具有广阔的应用前景。
关键词: 微生物 检测 寡核苷酸芯片
Application of Oligonucleotide Microarray to Microbial Detection
Liu Xuguang
1, 2 Song Fuping1 Zhang Jie1
(1 State Key Laboratory of Biology for Plant Di seases and Insect Pests, Institute of Plant Protection , Chinese Academy
of Agricultural Sciences, Beijing 100094; 2 Lianyungang Teachers College, Lianyungang 222206)
Abstract : Microarray, a recently developed genomic technology has been shown to be a powerful tool for studying of detect-
ing microbe. Now, oligonucleotide microarray has been used and succeeded in many fields of microbe such as pathogen detection,
species identification, function genes detection, genotyping, mutational analysis and revealing genome differences. Oligonu-
cleotide microarray may be useful in detecting microbe and have a broad prospect because of the high specificity of oligonucleotide
probe, which can be designed freely.
Key words: Microbe Detection Oligonucleotide microarray
目前比较常用的微生物检测方法有培养技术、
核酸检验技术如 PCR、免疫学检验技术如 EIA 与
ELISA 等, 另外还有一些其它技术如适配子、肽核
酸、生物传感器等。虽然这些技术在实验和应用中
已发挥了巨大的作用, 但随着微生物基因组计划的
进展,这些技术并不能实现大规模、高通量、快速、准
确、平行地检测和鉴定各种微生物及其功能基因。
而基因芯片技术为微生物检测适应基因组时代提供
了一种强有力的技术平台。
基因芯片是指采用光导原位合成或微量点样等
方法, 将大量的 DNA探针如基因、PCR产物、人工合
成的寡核苷酸等有序地固定在载体表面, 形成储存
有大量信息的高密度 DNA 微阵列。该微阵列与标
记的核酸样品杂交后, 能快速、准确、大规模地获取
样品核酸序列信息。微生物检测基因芯片是指用来
检测样品中是否含有微生物目的核酸片段的基因芯
片。基于高通量、微型化和平行分析的特点,微生物
检测基因芯片在微生物病原体检测、种类鉴定、功能
基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等研究
领域中发挥着越来越重要的作用。根据这些基因芯
片功能的不同,我们把微生物检测芯片又分为生物
群落鉴定芯片、种类鉴定芯片、功能基因检测芯片
等;根据基因芯片中探针的不同又可以把微生物检
测芯片分为 PCR产物芯片、寡核苷酸芯片和基因组
芯片。表1显示了这几种芯片的区别。
虽然PCR产物芯片以及基因组芯片已被广泛
收稿日期: 2004-09-13
基金项目: 973计划项目(编号: 2003CB114201、2001CB109005)
作者简介:刘旭光( 1973-) ,男,江苏连云港人,研究方向: Bt功能基因的分子生物学研究, E-mail: lxgssq@ 163. com
通讯作者:张杰, Tel : 86-010-62896634; E-mail: dfh313@ public. bta. net . cn
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 1期
应用于各个研究领域,但是由于其特异性较差,容易
在杂交的过程中产生错配从而形成假阳性, 因而限
制了它的进一步应用。而寡核苷酸芯片弥补了 PCR
产物芯片的不足。寡核苷酸芯片的探针来源于十几
到几十mer的寡核苷酸, 它可以由研究人员根据需
要进行任意设计,因而具有很强的特异性;针对其灵
敏度低的特点, 研究人员主要采用了在 PCR扩增样
品时进行 Taq 酶聚合掺入荧光物法标记样品。目
前,寡核苷酸芯片已广泛应用于包括环境微生物、微
生物生态,人类、兽医、食品和植物的诊断,以及水质
监控、工业微生物等等[ 1, 2]。由于探针的特异性与
灵敏度是实验成功与否的关键; 另外,尽管有其它标
记技术和检测方法的不断尝试和发展, 标记样品仍
然是杂交型基因芯片所检测的主要目标底物。标记
样品的质和量对基因芯片的检测效果影响很大, 因
而标记样品的制备也是检测基因芯片的关键环节之
一。为此,本文将从探针和标记入手着重介绍微生
物检测芯片研究和应用的一些进展。
表 1 PCR 产物芯片、寡核苷酸芯片和基因组芯片的比较
PCR产物芯片 寡核苷酸芯片 基因组芯片
探针来源 PCR产物 人工合成 培养提纯
探针大小 大,几百 bp到 2kb 小,十几mer 到 70mer 大,整个基因组
样品标记 Taq 酶聚合掺入、随机引物、切刻转移、化学标记
Taq 酶聚合掺入、随机引物、末端转移法、化
学标记 随机引物
灵敏度 高 低 高
特异性 一般 高 低
应用 功能基因检测、病原体检测及种类鉴定、基因组差异性检测
基因组监测、功能基因检测、病原体检测及
种类鉴定、基因分型、突变检测 生物群落检测
1 基因组监测
虽然目前检测病毒的常用方法众多, 但是这些
方法都无法检测出病毒全基因组变化并监测病毒基
因组的变异。而由于病毒的基因组较小, 因此在实
践中就可以人工用合成的寡核苷酸探针覆盖病毒的
全基因组以制成病毒全基因组检测芯片。这种病毒
全基因组芯片不仅能够更灵敏地和更准确地检测出
相关病毒。更为重要的是, 在检测病毒的同时可以
给出病毒基因组的更详细的信息。这些对于监测病
毒不同分离株之间的变异以及病毒在传染过程中可
能发生的自然变异具有重要意义。
2003年范保星[ 3]和周琦[ 4]等分别应用北京本元
正阳基因技术公司的 SARS 冠状病毒全基因组芯片
成功地进行了 SARS病毒的检测并监测出不同样本
中该病毒全基因组变化的特点。SARS 冠状病毒全
基因组芯片由 660条按照 5到 3基因组序列顺序排
列成矩阵的寡核苷酸探针制成。这些探针长约
70mer,以国际上公布的 SARS 冠状病毒全长基因组
序列为标准。相邻的探针序列之间有一定长度( 5~
30mer)的重复。实验中同时采用的标记方法为 RT-
PCR,扩增时Taq 酶聚合掺入荧光物法。但是由于这
些探针只是在长度上保持一致,并没有考虑到 GC%
和Tm 值,因此在杂交时并不能十分准确地监测基因
组的相关变化, 因此应用寡核苷酸芯片对基因组进
行监测还需要进一步研究。
2 功能基因检测
对微生物中的功能基因进行检测主要是能够灵
敏、特异地得到杂交信号。虽然应用 PCR产物芯片
检测功能基因具备大规模、平行化、高通量的特点,
但是由于 PCR产物芯片灵敏度有余而特异性不足,
容易出现假阳性结果, 从而限制了它的应用。而寡
核苷酸芯片则弥补了 PCR产物芯片的不足, 广泛地
应用于功能基因的检测。
Taronche-r Oldenburg[ 5]利用 70mer 长的寡核苷酸
作为探针来检测河水、海湾等环境中氮循环基因的
多样性, 这些基因包括 amoA, nifH , nirK 和 nirS
等。他们用 PCR扩增这些基因的全长片段并同时进
行荧光标记。研究表明, 每种对象的检测灵敏度为
10pg DNA,大约是 107拷贝数。
Chizhikov
[ 6]等通过多重 PCR扩增标记所检测细
菌基因组DNA, 然后与根据每个基因所设计的两条
寡核苷酸探针组成的芯片杂交。成功检测了 15种
30 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
志贺氏杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌中的 eaeA , slt-I ,
slt-II , f liC, rfbE 和 ipaH 等毒性基因。
由于某些功能基因属于一些微生物所特有的基
因,因此人们常通过检测功能基因来检测、鉴定微生
物种类或进行分型。这些基因包括 rpoB、gyrB 和
C23L/ B29R等。具体应用见病原体检测及种类鉴定
相关内容。
3 病原体检测及种类鉴定
同功能基因的检测相似, PCR 产物芯片由于其
特异性较差而限制了其的应用范围, 而寡核苷酸芯
片则可以广泛应用于各种微生物类型的检测与鉴
定,包括有较近亲缘关系的一些种类。表 2所列出
的是近年来应用寡核苷酸芯片对进行微生物检测与
鉴定的一些进展。从表 2中可以看出, 目前用于细
菌检测和鉴定的芯片所用探针大多来自于 16S
rRNA, 部分来自于 gyrB 等功能基因, 而对于病毒,探
针都来自于病毒基因组本身。标记的方法则有多种
类型,但最主要的方法仍然是在 PCR过程中进行标
记。
表 2 应用寡核苷酸芯片进行病原体检测及种类鉴定的部分研究进展
检测对象 探针大小( mer) 来源 标记
参考
文献
20种人肠道细菌 40 16S rDNA PCR扩增样品 16S rDNA 全长时 Taq 酶
聚合掺入荧光物或地高辛
[7]
硫酸还原微生物 18 16S rRNA 随机引物法标记样品 16S rRNA 的PCR
产物
[8]
5种较近亲缘关系的杆菌 20 16S rRNA 化学方法标记样品 16S rRNA 的PCR扩
增
[9]
玫瑰杆菌等 6种水表面细菌 15~ 20 16S rRNA 使用 indocarbocyanine 和生物素标记的
引物 PCR扩增样品 16S rRNA
[ 10]
鸡粪便中的弯曲菌 27~ 35 弯曲菌 16S rRNA 与 23S
rRNA间区域及特有基因
荧光引物 PCR扩增标记 [ 11]
30种菌血症血液中细菌 21~ 31 23S rDNA 地高辛引物 PCR扩增标记 [ 12]
17种细菌及空气中细菌 20 RDP中所有的 SSU rRNA 末端转移法生物素标记 PCR产物 [ 13]
厌氧型甲苯乙苯降解微生物 17~ 22 16S rRNA lissamine rhodamine 标记碱性磷酸酯酶处
理过的片段化的 PCR 产物
[ 14]
大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌
等 14种细菌
13~ 17 gyrB PCR扩增时Taq酶聚合掺入荧光物 [ 15]
14种分枝杆菌 13~ 17 gyrB T7 RNA 聚合酶掺入荧光物 [ 16]
6种利斯特氏菌 17~ 35 Iap , hly , inlB , plcA ,
plcB 及 clpE等基因
PCR扩增时Taq酶聚合掺入荧光物 [ 17]
流感病毒 17~ 29 Viral RNA 化学偶联法荧光标记经氨烯丙基修饰
的RT-PCR 产物
[ 18]
鼻病毒、副流感病毒、腺病毒等 70 Viral RNA 随机引物标记 PCR 产物 [ 19]
病人血清肝脏中的HBV、HCV 13~ 18 病毒基因序列 荧光引物 PCR扩增标记 [ 20]
41株正痘病毒属病毒 13~ 21 C23L/ B29R基因 PCR扩增时 Taq 酶聚合掺入荧光物 [ 21]
Methanotrophs及相关细菌 15~ 25 pmoA 基因 T 7 RNA 聚合酶体外转录 pmoA 基因的
PCR产物时掺入荧光标记
[ 22]
SARS病毒 60 病毒基因序列 RD-PCR技术荧光标记 [ 23]
虽然表 1中所列举的技术方法在微生物检测及
种类鉴定中应用范围很广,但是下面的一些研究在
芯片检测的灵敏度和系统性上作了一些研究。
Small 2001年[ 24]应用包含了通用和特异寡核苷
酸探针的芯片对土壤中 Geobacter chapellei、Desulfovib-
rio desulfuricans 等微生物进行直接检测。研究发现,
虽然通过 PCR扩增能够简单特异地进行检测,但是
通过使用一种伴侣检测双探针系统能够重复特异地
检测 16S rRNA而不用通过 PCR扩增。此系统包含
312005年第 1期 刘旭光等:寡核苷酸芯片在微生物检测中的应用
了一个打印在芯片上的物种特异性的捕获寡核苷酸
探针和一个在末端已生物素化的最接近捕获探针的
检测寡核苷酸探针。他们对捕获探针和检测探针之
间的距离以及杂交的信号强度和特异性进行了相关
的研究,结果表明应用基因芯片技术而不通过 PCR
扩增标记可以直接检测环境中的微生物。Chandler
2003年[ 25]等在此基础上构建了一个最接近的双探
针伴侣检测系统可直接用于环境样品中微生物的检
测与鉴定而不必通过 PCR 扩增。他们把样品总
RNA、杂交液和检测探针混合与芯片杂交对异化金
属和硫酸盐还原生物( dissimilatory metal and sulfate re-
ducer) 16S rRNA进行检测,研究了捕获探针和最接近
的伴侣检测探针之间的物理间隔和错配容忍度。检
测结果表明虽然降低二级结构是成功地捕获和检测
16S rRNA的关键, 但是捕获探针的序列比降低二级
结构更为重要。
Wilson [ 26]发展了一种可以鉴定细菌、病毒和真菌
等18种病原体的鉴定芯片,此芯片包含 53 660个寡
核苷酸探针, 这些探针相互重叠, 覆盖整个诊断区
域。他们设计引物扩增这 18种病原体的 142个独有
诊断区域( unique diagnostic regions) , 将这些产物片段
化在 100bp以下, 然后用末端转移酶在 3端连接上
氯化钴,与芯片杂交后进行洗涤并偶联上 SAPE 进行
荧光染色。在研究了杂交的特异和灵敏度后他们得
出此芯片可以高质量地鉴定这 18种病原体。
4 基因分型
微生物的一些功能基因具有复杂的多态性, 对
其进行正确的分型有着非常重要的意义。而目前所
采用的方法如 RFLP、多重 PCR、测序以及 SSCP 等都
有一些局限性。而利用基因芯片技术可以大规模、
平行化、高通量对功能基因进行分型。
Chizhikov
[ 27]应用寡核苷酸检测芯片成功地对
G1-G4和G9等 5种人轮状病毒进行检测并分型。他
们以轮状病毒中非常保守的VP7基因作为寡核苷酸
探针的来源,每种类型设计 9~ 10条寡核苷酸探针,
以轮状病毒 RT-PCR产物为模板进行巢式 PCR扩增
VP7基因片段, 在扩增的同时进行 Taq 酶聚合掺入
荧光物。杂交显示, 通过寡核苷酸芯片检测 20株病
毒株与通过测序和血清型等方法进行检测所得的结
果完全一致。
Cho [ 28]、Kim [ 29]和 Hwang[ 30]应用 Biomedlab公司制成
的含有 22种人类乳突病毒( HPV)特异性寡核苷酸探
针的芯片分别对 685例、140例和 234例感染 HPV病
人的病毒样本进行了分型检测并与 HC- 、PCR-
RFLP等其它方法进行了比较。他们用此芯片与经
过 PCR扩增和荧光标记的病毒核酸样本进行杂交。
实验结果表明, 利用 HPV 寡核苷酸芯片可以成功地
对HPV分型检测。
Gingeras 等[ 31]利用结核分枝杆菌 rpoB 基因保
守区 705bp 特异寡核苷酸序列探针与基因芯片杂
交,对 10种 121株分枝杆菌进行基因分型与菌种鉴
定。他们通过 PCR扩增保守区序列并进行荧光标记
与芯片杂交后比较杂交图像分析了 10种分枝杆菌
种间与种内的序列多样性并确证了几种特异性单核
苷酸变异多态性。Troesch 1999 年[ 32]又将 16S rRNA
和 rpoB 2种基因高密度寡核苷酸探针芯片用于分
枝杆菌种属的鉴定和利福平抗药性的测定, 结果 27
种70株不同分枝杆菌中 26种得到了正确鉴定。
Call 2001年[ 33]研究了对大肠杆菌 O157H7进
行检测和分型的寡核苷酸芯片的特异功能性和灵敏
度。此芯片的寡核苷酸探针长 25~ 30mer, 来源于
eaeA、stx1、stx2和 hlyA 四种毒性基因。从细胞或纯
化的总 DNA中使用 5 生物素化的引物通过单重或
多重 PCR扩增标记目标DNA。PCR产物未经过进一
步的修饰和纯化而直接与芯片杂交, 结果显示此芯
片检测灵敏度比电泳高 32 倍同时能够检测出一个
细胞中小于 1fg 的基因组 DNA。随后他们应用此芯
片对四个大肠杆菌O157H7和一个 O91H2菌株进
行了正确的分型。
2004年刘旭光等[ 34]应用寡核苷酸芯片进行 Bt
cry 基因分型检测。根据每条 cry 基因的保守序列
设计三种分级探针, 共涉及 cry1、cry2、cry9 基因
100余条序列共62条探针。与上述芯片建立在 PCR
- 基础的方法不同, 此实验未经过 PCR扩增样品和
标记,而是通过高浓度 Klenow 酶随机引物直接标记
基因组 DNA,将标记样品纯化浓缩后与寡核苷酸芯
片杂交。杂交结果显示, 对于基因组中拷贝数多的
基因能够较好地检测分型。
5 突变检测
Gingeras 1998年[ 31]在对 10种121株分枝杆菌进
32 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
行基因分型与菌种鉴定的同时对 44株临床上对利
福平有抗药性的结核分枝杆菌进行 rpoB 基因突变
检测, 共涉及到 41株 8个密码子 12种突变,突变中
40株为错义突变, 1 株为 6 碱基缺失突变, 3 株在
rpoB 基因 705bp内未检测到任何突变。测定结核分
枝杆菌利福平抗药性基因,可以区别鉴定非结核分
枝杆菌,为微生物的群体结构提供了资料。
6 结束语
寡核苷酸芯片在微生物检测方面发挥了重要的
作用, 但目前由于一些不足也限制了它的进一步应
用,最主要的一点就是其灵敏度[ 32] , 由于玻片上的
探针结合效率比膜上的要低的多, 建立在玻片上的
芯片杂交不仅比 PCR扩增的灵敏度要低 100到 10
000 倍[ 36] , 还比建立在膜上的杂交低 10 到 100
倍[ 37]。为解决这一不足, 研究人员在扩大信号方面
做了相关的研究, 目前液相反应中较为常用的多重
标记技术是值得借鉴的一种有效的信号放大技术。
多重标记技术是通过增加单个分子上标记的荧光分
子数目使荧光信号得到增强, 用来提高对特定分子
(如抗体、抗原、基因等)的检测灵敏度。例如, 分支
DNA( branched DNA, bDNA)探针技术[ 38]利用多检测
位点探针的预放大和 bDNA 探针再放大, 可以通过
化学发光的方法检测出 500拷贝HIV 病毒。滚环放
大免疫分析法 ( ImmunoRCA: immunoassays with rolling
circle amplification)
[ 39]通过特异性延长单链 DNA, 增
加检测位点,再与标记探针杂交实现多重标记,能在
芯片上检测出 1pg/ ml的 PSA。
综上所述, 由于寡核苷酸芯片在微生物检测中
具有快速、灵敏、高通量、自动化等特点,我们有理由
相信寡核苷酸芯片在微生物检测中将有着更广泛的
应用前景,发挥更大的作用。
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致 读 者
经上级有关部门批准,原中国农业科学院科技文献信息中心更名为中国农业科学院农业信息研究所,同
时,银行户名改为中国农业科学院农业信息研究所,开户银行、账号、电话、通讯地址等不变。
特此敬告!
生物技术通报编辑部
2005年 1月
112005年第 1期 李海权等:基因组细菌人工染色体文库( BAC)的构建及应用