全 文 ：毛细管电泳-电化学检测法测定蜘蛛香中多元酚类化合物
傅　亮1　楚清脆1　黄宝康 2　郑汉臣 2　叶建农* 1
1(华东师范大学化学系 ,上海 200062)　　2(第二军医大学药学院 ,上海 200433)
摘　要　采用毛细管电泳-电化学检测法(CE-ED)同时测定了蜘蛛香根中香叶木素 、山奈酚 、芹菜素 、绿原酸
和咖啡酸等 5种主要生物活性成分的含量 , 考察了运行缓冲液酸度 、浓度 、分离电压 、氧化电位和进样时间等
实验参数对分离 、检测的影响。在最佳实验条件下 , 以直径 300 μm的碳圆盘电极为工作电极 ,检测电位为 +
950 mV(vs. SCE), 在 50 mm ol /L的硼砂缓冲溶液(pH 9. 23)中 , 上述各组分在 23 m in内能完全分离。 5种组
分在两个数量级的范围内呈良好线性关系 ,检测下限(S /N =3)达 1. 7×10- 4 ～ 1. 8×10- 5 g /mL。 该法已成功
地应用于蜘蛛香根中活性成分的分离检测 ,结果令人满意。
关键词　毛细管电泳 , 电化学检测 , 蜘蛛香 ,多元酚
2004-03-09收稿;2004-06-15接受
本文系华东师范大学 2004年优秀博士生培养基金资助课题
1　引　　言
蜘蛛香 (Valeriana ja tamansi Jones)又名马蹄香 、老虎七 、印度缬草等 ,系败酱科缬草属植物 ,主产于
四川 、贵州等地。其入药部分一般为干燥根茎 ,具有镇静安神 、理气止痛 、祛风除湿 、消炎止泻等功效 ,可
用于治疗脘腹涨痛 ,消化不良 ,腹泻 ,痢疾 ,风湿痹痛 ,腰膝酸软等病症 [ 1] 。对其化学成分进行的大量研
究发现 ,环烯醚萜类 、黄酮类和酚酸类化合物是其主要的生物化学成分 [ 2] 。现代药理实验表明 ,黄酮类
化合物能预防癌症[ 3, 4] ,咖啡酸和绿原酸等酚酸类物质则具有抗氧化性 、抗诱变性和抗癌活性 [ 5, 6] 。
目前 ,蜘蛛香中挥发性成分 、脂肪酸和萜类化合物等成分的检测 ,主要有薄层扫描法 [ 7] 、 GC-MS[ 8] 、
高效液相色谱法 [ 9]和气相层析-质谱联用[ 10]等方法。毛细管电泳 (CE)具有分离效率高 、分析速度快 、
重现性好 、样品和试剂用量少等优点 ,是一种高效的分离分析技术。与电化学检测方法联用 , CE-ED对
电活性物质具有很高的灵敏度和选择性 [ 11] 。本研究首次采用 CE-ED ,分别测定了不同产地蜘蛛香根中
香叶木素 、山奈酚 、芹菜素 、绿原酸以及咖啡酸等 5种多元酚类化合物 ,建立了一种分离检测蜘蛛香根
中活性成分的简便 、可靠 、灵敏的新方法。
2　实验部分
2. 1　仪器
毛细管电泳电化学检测系统(CE-ED)为自组装[ 12] 。包括 ±30 kV高压电源 (中国科学院上海应用
物理研究所 );BAS LC-4C安培检测器 (美国生物分析系统公司 );EB100型台式单笔记录仪 (上海大华
仪表厂 );M ode l 14901三维微定位器(斯特拉特福 , 美国康涅狄格州 );75 cm长熔融石英毛细管 (内径
25 μm ,外径 360μm ,河北永年锐沣色谱器件有限公司 );毛细管 、检测池和三电极体系均组装在一个带
有微动开关的树脂玻璃框架中 ,以保证仪器和操作人员的安全。当框架打开时 ,微动开关会自动切断电
源 。工作电极为 300 μm 的碳圆盘电极 , 使用前先用金相砂纸抛光 ,并置于二次蒸馏水中超声清洗
5 m in ,然后借助三维微定位器 ,使工作电极与毛细管出口在一条直线上 ,并尽可能靠近毛细管的末端。
铂丝为辅助电极 ,饱和甘汞电极为参比电极 。用 BAS LC-4C安培检测器检测氧化电流 ,电泳图谱由单
笔记录仪记录。采用电迁移进样 ,使用 16 kV电压从毛细管阳极端进样 8 s,检测池为阴极电泳池 。
2. 2　试剂
山奈酚 、芹菜素 、绿原酸和咖啡酸标准品购自 Sigm a公司;香叶木素购自中国药品生物制品检定所。
5种标准储备液浓度均为 1. 00×10-3 g /mL,用无水乙醇(分析纯)配置 ,避光 4℃保存。其它不同浓度
第 33卷
2005年 2月　　　　　　　　　　　　
分析化学 (FENXI HUAXUE)　研究报告
Ch inese Journa l o f Ana ly tica l Chem istry
　　　　　　　　　　　　 第 2期
161 ～ 164
的工作液 ,用运行缓冲液(pH值 8. 7 ～ 9. 5 ,浓度为 50. 0 mmo l /L的硼砂溶液 )稀释得到 。所有分析样品
均经 0. 22 μm聚丙烯滤膜过滤后进样 。四川蜘蛛香根由第二军医大学药学院提供 ,贵州蜘蛛香根购自
贵阳市药店 。
2. 3　试液的配制
将两种产地蜘蛛香的根磨成粉状 ,分别准确称取 2. 0 g,用 10 mL、80%乙醇溶液∶去离子水 =4∶1
(V /V)超声萃取 1 h后 ,先用滤纸过滤 ,再用 0. 22 μm聚丙烯滤膜过滤 ,将得到的滤液放于阴暗处保存 。
3　结果与讨论
3. 1　电泳条件的选择
3. 1. 1　工作电极电位的影响　电化学检测是基于被测物质能够在碳电极上发生电化学氧化的性质。
　图 1　5组分的流体伏安图
F ig. 1　H ydrodynam ic vo ltammog ram (HDV) of
five ing redien ts
石英毛细管( fused-si lica cap illary):25 μm .i d. ×75
cm;工作电极(w ork ing e lectrode):300μm直径碳圆
盘电极(300μm d iam eter carbon disk electrode);运行
缓冲溶液(runn ing buf fer):50. 0 mm ol /L硼砂缓冲溶
液(borate buffer) (pH 9. 23);分离电压 (separation
voltage):16 kV;进样( in ject ion):16 kV /8 s;分析物
浓度 (analyte concent ration):2. 0×10 - 5 g /m L each。
分析物(analy tes):1. 香叶木素 (d iosm etin);2. 绿
原酸 (ch lorogen ic acid);3. 山奈酚 (kaem p ferol);
4. 芹菜素 (ap igen in);5. 咖啡酸 (caffic acid)。
上述 5种组分由于带有酚羟基 ,均具有较好的电化学活性 ,
且电极电位直接影响被分析物的电化学响应 ,因此为了选
择最佳工作电位 ,对 5种组分的流体伏安曲线进行了测定
(如图 1)。当电极电位超过 +500mV(vs. SCE)时 , 5种组
分均产生氧化电流。随着电极电位的增大 ,香叶木素和芹
菜素的氧化电流增加迅速 ,而其它 3组分的响应受氧化电
位影响较小 。当电极电位大于 +950 mV时 ,虽然香叶木素
和芹菜素的氧化电流仍稍有增加 ,但此时本底电流大幅增
加 ,噪音明显提高 ,而导致基流不稳。所以选择检测电位为
+950 mV(vs. SCE),此时信噪比较高 ,电极的稳定性好。
3. 1. 2　运行缓冲液酸度和浓度的影响　在碱性溶液中 ,硼
酸盐能与待测物螯合生成配位阴离子来增加溶解度[ 13] ,减
少了因吸附造成的峰拖尾等影响 ,所以选用硼砂作为缓冲
体系。如图 2所示 ,在 pH 8. 7 ～ 9. 5范围内 5种组分随着
pH值的提高 ,迁移时间明显延长 , 且 pH值为 9. 2 ～ 9. 5
时 , 5组分可实现基线分离。当 pH值低于 9. 00时 ,绿原酸
与山奈酚不能实现分离 ,而 pH 值过高会导致待测物被氧
化 。故选择缓冲溶液的酸度为 pH 9. 23。此时被测物可以
完全分开 ,且分析时间较短 。
毛细管内壁的 ze ta电位与运行缓冲液的 pH值和浓度
　图 2　运行缓冲溶液 pH对分析物迁移时间的影响
F ig. 2　E ffec t o f the ac id ity of the runn ing buffe r on the
m igration tim e o f ana ly tes
工作电位 (w orking electrode po ten tial):+950 mV (vs. SCE);
其余和曲线编号条件同图 1 (other condition s and cu rre No. are
the sam e as in Fig. 1)。
或离子强度有关 。在固定的 pH 值下 ,有效 ze ta电
位随着缓冲液浓度的增加而降低 ,从而降低了电渗
流 ,使迁移时间变长。本实验在 pH 9. 23、缓冲溶液
浓度 20. 0 ～ 100. 0mmo l /L范围内 ,研究了运行缓冲
液浓度对被测物迁移时间的影响 ,最佳缓冲液浓度
为 50. 0mmol /L。
3. 1. 3　分离电压和进样时间的影响　在一定的毛
细管长度下 ,分离电压决定电场强度。而电场强度
影响电渗流速度和荷电物质迁移率 ,继而决定了分
析物的迁移时间 。分离电压越高 , 5组分迁移时间
越短。当分离电压超过 18 kV时 ,实际样品中待测
物不能与其它物质达到基线分离 ,且基底噪音增大 。
因而 ,选择 16 kV为最佳分离电压 ,在 23 m in中内
所有组分即可得到很好的分离 。
162　　 分 析 化 学 第 33卷
进样时间决定分析样品的进样量 ,影响峰电流和峰形 。在 16 kV下 ,研究了 2 ～ 12 s范围内进样时
间对进样量的影响。峰电流随着进样时间的增加而增加 (如图 3)当进样时间大于 8 s时 ,峰高趋于稳
定 ,但峰扩展明显 。故在此实验中 ,选择 8 s(16 kV)作为最佳进样时间。在优化条件下 ,香叶木素 、绿
原酸 、山奈酚 、芹菜素和咖啡酸在 23m in内即可达到基线分离 ,所得标准溶液的电泳图谱见图 4(A)。
　图 3　进样时间对分析物峰电流的影响
F ig. 3　E ffec t o f in je ction time on peak currents o f analy te s
其它条件和曲线编号同图 1 (oth er cond itions and cu rre N o. are
th e sam e as in F ig. 1)。
　图 4　标准溶液(A)、四川 (B)和贵州(C)产蜘蛛香样
品溶液毛细管电泳图
F ig. 4　E lec trophe rogram s of a standa rd solution containing
five ana ly tes(20 m g /L each) (A), Va leriana jatamansi
Jones (S i Chuan) (B) and Va leriana jataman si Jones
(Gui-zhou) (C) Sam ple so lutions
条件同图 2 (condition s are the sam e as in Fig. 2)。 1.香叶木素
( diosm etin); 2. 绿原酸 ( ch lorogenic acid); 3. 山奈酚
(kaem pferol);4. 芹菜素 (apigen in);5. 咖啡酸 (caf fic acid)。
3. 2　重现性 、线性及检出限
3. 2. 1重现性　在上述优化条件下 ,将标准混合溶
液 (每种标准品的浓度均为 2. 0 mg /L)连续进样 7
次 ,重现性良好。峰高的相对标准偏差 (RSD)按照
出峰次序分别为:1. 1%(香叶木素 )、3. 7%(绿原
酸 )、2. 2%(山奈酚 )、1. 3%(芹菜素)和 3. 0%(咖啡酸 )。
3. 2. 2　回归方程 、线性范围及检出限　在最佳分离检测条件下 ,对一系列不同浓度(5. 0×10-4 ～ 0. 2 g /L)
的各组分的混合标准溶液 ,要分别测定。实验发现 ,香叶木素 、山奈酚与芹菜素的浓度与电泳峰电流在
5×10-4 ～ 0. 1 g /L范围内均呈现良好线性关系;绿原酸与咖啡酸的浓度与电泳峰电流在 1×10-3 ～ 0. 1 g /L
范围内均呈现良好线性关系。以 y表示峰电流 (nA), x表示样品浓度 (g /mL),线性回归方程分别为
y =1. 70×105x +0. 07(香叶木素 , r=0. 9994);y =8. 90×104 x - 0. 16(绿原酸 , r=0. 9991);y =1. 39×105x -
0. 10(山奈酚 , r=0. 9995);y =3. 10×105x - 0. 10 (芹菜素 , r=0. 9998)和 y =9. 21×104x +0. 07(咖啡酸 ,
r=0.9994)。以信噪比 S N/ =3对应浓度确定检出限分别为3. 8×10- 5 g /L(香叶木素)、2. 0×10- 4 g /L(绿
原酸 )、4. 6×10-5 g /L(山奈酚 )、1. 9×10-5 g /L(芹菜素)和 1. 0×10-4 g /L(咖啡酸)。
3. 3　样品测定及回收率实验
在选定的测定条件下 ,对四川和贵
州蜘蛛香样品中的 5种组分进行了测
定 ,电泳图谱见图 4(B)和 (C)。与标准
物质电泳图 4(A)相对照 ,四川产蜘蛛
香的根中确实含有香叶木素 (1)、绿原
酸 (2)、山奈酚(3)、芹菜素(4)和咖啡酸
(5);而产自贵州的蜘蛛香根中未检出
咖啡酸 。测定结果见表 1。
以州蜘蛛香的根进行了回收率实
验 。采用标准加入法 , 3次测得的回收
率均在 97% ～ 104%之间 ,平均回收率
和相对偏差 (RSD)分别为香叶木素
(98. 6%, 4. 7%)、绿原酸 (100. 9%,
表 1　分析样品的测定结果(n =3)a
Table 1　The a ssay results of sam ples(n=3)
样品
S am ples
组分
Ingredien ts
测得值
Found (μg /g) RSD(%)
蜘蛛香(四川)
Va leriana jatamansi
Jon es(S ichu an)
香叶木素 D iosm etin 26. 7 4. 6
绿原酸 Ch lorogenic acid 3990 2. 1
山奈酚 Kaem p ferol 39. 1 4. 3
芹菜素 Ap igenin 836 2. 3
咖啡酸 C affeic acid 141 4. 0
蜘蛛香(贵州)
Va leriana jatamansi
Jon es(Gu izhou)
香叶木素 D iosm etin 68. 8 4. 4
绿原酸 Ch lorogenic acid 2800 1. 7
山奈酚 Kaem p ferol 58. 7 4. 3
芹菜素 Ap igenin 889 1. 5
咖啡酸 C affeic acid -
　 a. 工作条件与图 2相同 (w ork ing cond itions are the sam e as in Fig. 2); -.
未检出(not found)
163第 2期 傅　亮等:毛细管电泳-电化学检测法测定蜘蛛香中多元酚类化合物 　　
2.1%)、山奈酚(103. 7%, 4. 5%)、芹菜素 (100. 6%, 4. 3%)和咖啡酸(97. 9%, 3. 4%)。
上述结果表明 ,该方法无需事先富集或衍生化反应 ,过滤后即可直接进样 ,方法简单可靠 ,能够准确地
将不同产地的同种药材区加以区分 ,从而为传统中草药分离检测提供了一种行之有效的分析方法。
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Determ ination of Polyphenolic Constituents in Valeriana Ja tamansi Jones
by Cap illary E lectrophoresis w ith Electrochem ica lDetection
Fu L iang1 , Chu Q ingcui1 , Huang Baokang2 , Zheng H anchen2 , Ye Jiannong*1
1(D epartm ent of Chem istry, East China Norma lUniversity, Shanghai 200062)
2(S chool of Pharmacy, SecondM ilitary M edical University, Shanghai 200433)
Abstract　A high-perfo rmance capillary e lectrophoresisw ith electrochem ica l de tection (CE-ED)method has
been deve loped fo r the determ intion o f five bioac tive ingredients inVa leriana jatamansi Jones, name ly d io sme-
tin, kaemp fero l, apigenin, chlorogenic acid, and caffeic acid. The effects o f several factors such as the acidity
and concentra tion of runn ing buffer, the separation vo ltage, the applied po tentia l and the in jec tion time on
CE-ED we re investigated. Under the op timum cond itions, these five components can be separated in a 50. 0
mmo l /L borax runn ing buffer (pH 9. 23)w ithin 23m in. A 300 μm diame te r carbon disk electrode w as used
as the w ork ing e lec trode positioned care fully opposite the ou tle t of the capillary in a w all-je t configura tion a t
potential of +950mV (vs. SCE). Good linea r re latonship w as established be tw een peak curren t and concen-
tration o f ana ly tes over tw o orders o fm agn itude. The detection lim it(S N/ =3) ranged from 1. 7×10-7 to 1.8
×10-8 g /mL for all five t ana ly tes. The me thod has been successfu lly used for the determ ination o f these
analytes in Va leriana jatamansi Jones samp le s after a relatively simp le ex traction procedure, and the assay
resu lts we re satisfac to ry.
Keywords　Capilla ry electrophoresis, e lec trochem ical detection, Va leriana jatamansi Jones, polyphenols
(Received 9M arch 2004;accepted 15 June 2004)
164　　 分 析 化 学 第 33卷