全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
植酸酶是一类能水解植酸(phyticacid)及盐类的磷酸单酯酶的总称。它能将植酸及盐类降解为无机磷和
肌醇.作为动物饲料主要成份的植物性饲料中含有相当数量的磷,但其中 50%以上是以植酸磷(六磷酸肌醇)
的形式存在的,单胃动物缺乏分解植酸所必需的酶而不能有效地利用植酸磷。植酸磷是一种抗营养因子对
无机离子、蛋白质等都具有螯合作用,从而影响动物对营养物质的吸收。磷是动物生长、繁殖、骨骼矿化及代
谢所必需的矿物因素之一,如在单胃动物的饲料中直接添加磷必然会造成磷源浪费、形成高磷粪便而造成
环境污染;如不在单胃动物的饲料中直接添加磷,这势必将影响到动物生长、发育和繁殖。正是植酸酶解决
了上述不可调和的矛盾,植酸酶作为一种单胃动物的饲料添加剂,它可使植物性饲料中磷的利用率提高
60%。粪便中磷排泄量减少 40%,同时还可降低植酸的抗营养作用,植酸酶作为一种饲料添加剂,有着广泛的
应用前景。但由于天然来源的植酸酶或者提取困难、或者分泌量太低、或者成本太高,难以满足现实实验、生
产的需要。由此构建基因工程菌作为一个微型生物反应器,从而获得能高效表达植酸酶的菌株,成为解决这
一问题途径。
巴氏毕赤酵母(P.pastoris)重要生物学特性是能利用甲醇作为惟一的碳源和能源。甲醇代谢首先必须在
毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达植酸酶基因及其
表达物的酶学性质比较
李健 彭远义
(西南大学动物科学技术学院,重庆 400716)
摘 要: 将本实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体 pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴
氏毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在 MM和 MD平板上的生长情况以及 PCR
菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His+Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut+
重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut+和MutS重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上
都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。
关键词: 植酸酶 MutS重组子 Mut+重组子 酶学性质
ExpressionofPhytaseGeneinPichiaPastorisMutsand
Mut+RecombinantsandEnzymePropertiesofPhytase
Lijian PengYuanyi
(ColegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716)
Abstract:TheexpresionvectorpPIC9KincludingphytasegenewaslinearizedandthentransformedintoPichiapastoris
GS115bymeansofproducingplasmatosome.TheMutsrecombinantwasscreenedbyphenotypeandPCRandtheexpresionof
phytasewascomparedwithMut+recombinantinPichiapastorisunderthesamecondition.SDS-PAGEresultsindicatedthat
therewasacleartargetbandinMutsandMut+recombinantCulturesupernatantafter48hoursculturerespectively.Enzyme
propertiesoftestsshowedthattherewasnosignificantdiferencebetweenthem.
Keywords:Phytase MutsrecombinantMut+recombinantEnzymeproperties
收稿日期:2005-12-19
作者简介:李健(1978-),男,研究生,研究方向:微生物次生代谢及制药工程
2006年第3期 李健等:毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较
醇氧化酶的作用下将甲醇氧化成甲醛。醇氧化酶对氧的亲和力很弱,所以在甲醇为碳源的培养基上生长时,
毕赤酵母代偿性地大量产生这种酶。在毕赤酵母中有两种基因编码醇氧化酶 AOXl和 AOX2,两者的序列相
似,有 92%的同源性,其编码蛋白有 97%同源性和几乎相同的特异催化活性,但细胞中绝大多数醇氧化酶的
活力由 AOXl基因提供,AOX2基因只承担很少一部分活力。当外源基因通过重组替换了染色体上的 AOX1
基因时,造成AOX1基因的缺失,而此时只存在 AOX2基因,则大部分的醇氧化酶活力将丧失,细胞利用甲醇
能力降低,因而细胞在甲醇介质上生长很慢,这种菌株被称为 MutS。当外源基因通过重组插入到酵母染色体
上时,AOX1基因仍然保留,AOXl基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在甲醇介质上生长较快,这种菌株
被称为 Mut+。以甘油或葡萄糖为碳源时 MutS和 Mut+,生长速度并无区别;而以甲醇为碳源时,Mut+的生长显
著快于 MutS[1],本实验室已把改造过的黑曲霉的植酸酶基因克隆到表达载体 pPIC9K中,经 XbaⅠ酶切后并
通过电击转化整合到毕赤酵母中,得到 Mut+重组子,在摇瓶中发酵,诱导表达出高酶活性的植酸酶。本实验
利用DraⅠ酶切质粒并通过原生质体转化方法,得到表型为MutS重组子。经初步测定酶活后,选择一株MutS重
组子与本实验室已构建好的一株Mut+重组子,在相同培养条件下比较了它们在表达植酸酶方面的异同。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 大肠杆菌 DH5" 由西南农业大学蚕丝学院赠予,巴氏毕赤酵母 (P.pastoris)GSl5菌株
(Mut+His-)购自 Invitrogen公司,Mut+重组菌株(Mut+His+)和表达质粒载体 pPIC9K-phyA为本实验室构建。
1.1.2 主要试剂 DraⅠ限制性内切酶购自上海生工;zymolyase,蛋白质 Marker,YNB,胰蛋白胨和酵母提
取物购于 Sigma公司;TaqDNA 聚合酶,dNTPs等购于 Promega公司;DNA Marker购自 TaKaRa公司;质
粒小量制备试剂盒购自上海博亚生物工程公司;SDS、TEMED、丙烯酰胺、双丙烯酰胺和过硫酸铵购于华美
生物工程公司;琼脂糖购于 Biowest公司;其它试剂均为国产分析纯级。
1.1.3 培养基 Amp-LB液体培养基 (胰蛋白胨 10g/L,酵母提取物 5g/L,NaCl10g/L,用 5mol/LNaOH调
pH至 7.4灭菌后待液体培养基冷却至 50℃后,加入 Amp液体至终浓度 100μg/ml),RDB平板 (山梨醇 186
g/L,YNB13.4g/L,生物素 4×10-4g/L,葡萄糖 20g/L,氨基酸 0.5g/L,琼脂粉 20g/L),RD琼脂糖平板(山梨醇
186g/L,YNB13.4g/L,生物素 4×10-4g/L,葡萄糖 20g/L,氨基酸 0.5g/L,琼脂糖 10g/L),YPD液体培养基(酵母
提取物 10g/L,蛋白胨 20g/L,葡萄糖 20g/L),MD平板(YNB13.4g/L,葡萄糖 20g/L,生物素 4×10-4g/L,琼脂粉15g/
L),MM平板(YNB13.4g/L,甲醇 5ml/L,生物素 4×10-4g/L,琼脂粉 15g/L),BMG(YNB13.4g/L,生物素 4×10-4g/L,
甘油 l0ml/L,0.1mol/LPBS,pH6.0),BMM (YNB13.4g/L,生物素 4×10-4g/L,甲醇 5ml/L,0.1mol/LPBS,
pH6.0)。
1.2 方法
1.2.1 载体 pPIC9K-phyA的提取及线性化 用质粒少量制备试剂盒提取 pPIC9K-phyA质粒 DNA,用 DraⅠ
酶切 pPIC9K-phyA质粒,电泳检测酶切彻底后,用酚/氯仿抽提,加入 3mol/LNaAc溶液以及无水乙醇,进行
沉淀回收,并用 10μlTE溶解,经紫外分光法检测 DNA浓度达 500ng/μl。
1.2.2 毕赤酵母(GS115)的转化 GS115原生质体的制备:参照 Invitrogen公司 Pichia操作手册。原生质体
转化:100μl原生质体液中加入 10mg线性化的质粒 DNA,室温下放置 10min后加入 1ml现配的 1:1PEG/
CaT溶液,轻轻混合,室温放置 10min后离心,小心吸出 PEG/CaT溶液并把转化细胞重新悬于 150μlSOS培
养基中,在时温下放置 20min后,向其中加入 850μl1mol/L山梨醇,把此混合液与 50ml放置于 45℃水浴锅
中的熔化的 RD琼脂糖混合,倒于 2~3个大的 RDB平板上,倒置于 30℃培养直至转化子出现。
1.2.3 转化子的表型筛选和 PCR鉴定 等到原生质体转化的细胞在 30℃生长直至长为大小适中的单菌
落,在 MM和 MD平板上进行表型筛选。在 MD平板上生长正常而在 MM平板上生长缓慢的为 MutS型;在
MD和 MM平板上均生长正常的转化子为 Mut+型。提取转化子的总 DNA,用 5AOXl引物和 3AOXl引物进
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
行 PCR扩增。
1.2.4 MutS重组子和 Mut+重组子培养和诱导表达 将 MutS重组子和 Mut+重组子分别接种于 40mlBMG增
殖培养基中,30℃培养条件下,进行增殖培养,当吸光度 OD600=3~6时,离心收集菌体,加入 20ml诱导培养
基 BMM,30℃下继续诱导培养。
1.2.5 MutS重组子和 Mut+重组子表达植酸酶的 SDS-PAGE分析 直接取诱导表达产物的上清液进行 SDS-
PAGE分析。
1.2.6 植酸酶的酶活定义及其酶活测定方法 植酸酶活力单位(U)定义:在 37℃、最适 pH条件下,1min从
0.0051mol/L的植酸钠溶液中释放 1nmol无机磷所需的酶量为一个酶活单位。植酸酶活测定方法:向每支干
净的 10ml离心管中加 1ml经适当稀释的发酵液,然后再加 2ml0.0076mol/L植酸钠溶液(对照加入 2ml颜
色/终点混合液),将离心管放入 37℃的恒温水浴中,反应 60min后,向每支离心管中加入 2ml颜色/终点混合
液 (对照加入 2ml0.0076mol/L植酸钠溶液),在分光光度计上测 OD415nm值。与标准磷曲线比较,可知释
放出的无机磷量(nmol/ml),从而算出其酶活。
1.2.7 MutS重组子和 Mut+重组子表达的植酸酶酶学性质测定
1.2.7.1 最适 pH值 分别取 MutS重组子和 Mut+重组子诱导 7d表达产物的上清液,按 1.2.6方法,测不同
pH处酶活力。
1.2.7.2 最适反应温度 分别取 MutS重组子和 Mut+
重组子诱导 7d表达产物的上清液,按方法 1.2.6测
37℃、45℃、50℃、5℃、60℃、70℃和 80℃不同水浴温度
下最适 pH处酶活力。
2 结果与分析
2.1 质粒 pPIC9K-phyA的线性化
利用 DraⅠ对质粒 pPIC9K-phyA进行线性化,用
1%琼脂糖电泳,结果如图 1。
质粒 pPIC9K-phyA总长为 10.6kb左右,其上具
有六个 DraⅠ的酶切位点,5AOX1和 3AOX1区域上
的两个 DraⅠ的酶切位点经酶切后,获得 7.6kb左右
的 DNA片段其中包含完整的目的基因。其他酶切位
点经酶切后分别获得大约为 1200bp、1000bp、600bp
和 100bp大小片段的 DNA。
2.2 转化子的 PCR鉴定
pPIC9K-phyA用 DraⅠ酶切线性化,经原生质体
法转化 GSl5(Mut+His-)。原生质体转化的细胞在 30℃
生长至大小适中的单菌落,在 MM、MD平板上进行表
型筛选。经初步测定酶活,选择了一株酶活较高的转
化子,利用 PCR鉴定阳性重组子,结果见图 2。
PCR产物只有目的基因 1条带,说明 AOXl基因
在整合过程中被破坏,阳性重组子的表型为 Muts。如
果 PCR产物有 2条带,一条为 AOXl基因的 2.2kb
条带,另一条为目的条带,说明 AOXl基因没有被破
坏,阳性重组子的表型为 Mut+;如果 PCR产物只有
AOXl基因一条带,说明该转化子为假阳性。
1 2 M
图1 质粒的线性化分析
1. 线性化产物
2.Marker "-HindII
图2 重组子的PCR鉴定
1.Mut“阳性重组子”
2. 阴性对照
M.MarkerDL2000
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2006年第3期 李健等:毕赤酵母Mut+和MutS重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较
图4 Mut+重组子表达产物的SDS-PAGE分析
M:蛋白质Marker 1:阴性对照 2~9:1~8的表达产物
图3 Mut3重组子表达产物的SDS-PAGE分析
M:蛋白质Marker 1:阴性对照 2~9:1~8d的表达产物
图5 植酸酶的最适pH
图6 植酸酶的最适反应温度!
2.3 MutS重组子和 Mut+重组子的诱导表达和 SDS-PAGE分析
MutS重组子和 Mut+重组子经 BMG增殖培养后,收集菌体重悬于 BMM中,进行诱导表达。每间隔一天
收集诱导表达的上清液,用于 SDS-PAGE分析。SDS-PAGE后考马斯亮蓝 R-250染色,结果如图 3和图 4。
结果表明,MutS和 Mut+重组子在诱导表达 1d后都出现了微弱的带,随着诱导时间的增加,两者都出现
了清晰的带。诱导时间到 7d后,MutS和 Mut+重组子表达的植酸酶的量几乎达到稳定,两者的发酵液中除植
酸酶蛋白外,在电泳图中几乎看不到杂蛋白且分子量都在 70KD~97KD之间。同一诱导表达时间内两者表
达的植酸酶的量几乎无差异。
2.4 最适 pH值的测定
分别取 MutS重组子和 Mut+重组子诱导 7d表达产物
的上清液,按 1.2.6方法,测不同 pH处酶活力结果如图
5。
从图 5可以看出,两者 pH曲线基本吻合。在 pH值
为 2.5处酶活力出现第一个高峰,随着 pH增加,酶活力
出现明显下降趋势,下降到一定值后,酶活力又上升,在
pH值为 5.5处酶活力出现第二个高峰,此时两者的酶活
力都达到最大。随着 pH不断上升,酶活力又出现明显下
降趋势,但在 pH增加到中性或略成碱性时,此时两者的
植酸酶都具一定的酶活力。
2.5 最适反应温度
分别取 MutS重组子和 Mut+重组子诱导 7d表达产物
的上清液,按 1.2.6方法,测不同温度下的酶活力结果如
图 6。
由图可知,两者的最适反应温度曲线变化趋势基本
相同,在 37℃~70℃之间测定两者的酶活,由 MutS重组子
产生的植酸酶酶活略低于 Mut+重组子产生的植酸酶酶
活。两者在 55℃处反应都具有最高酶活,在 37℃~60℃之
间,两者的酶活都较稳定。当反应温度高于 60℃后,两者
的酶活都快速下降,温度超过 70℃后酶活都几乎为零。
2.6 耐热性实验
分别取 MutS重组子和 Mut+重组子诱导 7d表达产物
的上清液,按方法 1.2.6,测植酸酶在不同温度处理后酶 图7 植酸酶的热稳定性
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
活力结果如图 7。
由图可知,两者的耐热性曲线变化趋势基本相同。MutS重组子和 Mut+重组子所产植酸酶经 70℃处理
15min后,酶的活性都快速下降,其相对酶活分别为 57.76%和 60.95%。随着处理温度的增加,MutS和 Mut+重
组子所产植酸酶的酶活性变化趋缓。
3 讨论
巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)由于兼具原核表达系统的高表达量和真核表达系统的翻译后修饰、加
工及折叠的优点,到目前为止,已有上百种蛋白在毕赤酵母中得到成功表达。而影响外源基因在毕赤酵母中
表达的因素很多,其中包括外源基因的特性、启动子的选择、外源表达载体转化到毕赤酵母中的方法、外源
表达载体整合到毕赤酵母染色体上的位点和方式以及发酵条件等等。目前毕赤酵母的转化方法有电穿孔
法,原生质球法以及完整细胞法(需要用到 LiCl和 PEG)。一般来说,原生质体法和电穿孔法的转化效率较
高,而且发现用原生质体法转化可以得到很高的拷贝数。整合位点一般位于 His4区或 AOXl区。整合的方式
有两种:一是单交换,即外源基因通过同源重组插入到染色体的 aoxl和 his4基因位点内;二是置换,即含有
5AOXl与 3AOXl末端序列的表达盒与标记基因(his4)同宿主染色体上的 aoxl基因发生置换,造成 aoxl基因
的缺失。单交换的插入方式得到的转化表型为 Mut+,而置换的方式得到的为 MutS。尽管 MutS菌株达到最高
表达量的诱导时间较长,但它代谢甲醇较少,受氧的限制较小,有时外源蛋白质的表达量比 Mut+菌株还要
高,尤其是在摇瓶培养中[13]。
本实验通过用 DraⅠ酶切,线性化质粒 pPIC9K-Phy,然后原生质体转化将目的基因整合到毕赤酵母的
染色体上,得到表型为 MutS重组子,然后把本实验室已构建好的表型为 Mut+重组子,在相同条件下,进行增
殖、诱导培养。两者的诱导液中几乎不含其它杂蛋白,所产植酸酶含量都较高,这既利于下游的纯化,也利于
进行工业化生产。MutS重组子所产植酸酶,除酶活略低于 Mut+重组子所产植酸酶的酶活外,其它性质几乎无
显著的差异,此实验结果表明利用不同的转化方法和整合方式对毕赤酵母表达植酸酶的酶学性质几乎无多
大影响,但由于 Mut+重组子产植酸酶需要较高浓度的甲醇进行诱导表达,这既不利于植酸酶的纯化,又给植
酸酶的工业化生产带来了不安全隐患,这极大地制约了植酸酶在饲料业、食品行业、医药领域和化装品产业
中的开发和应用。而 MutS重组子为甲醇利用缓慢型,可以弥补 Mut+重组子的不足,为植酸酶的应用提供了
更为广阔的前景。
参 考 文 献
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