全 文 ：矮化早熟高粱突变体的 RAPD分析*
潘宁1 赵琦1* 王振莲1 杨奇志1 王小菁2
( 1首都师范大学生物系,北京 100037; 2华南师范大学,广州 510631)
摘 要: 以随机扩增多态 DNA( Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD )标记方法对航天搭载得到的
矮化早熟高粱突变体进行遗传特性分析,利用适合玉米的引物对高粱进行引物筛选, 从 31 种随机引物中共扩增出
4 条多态性片段, 反映出突变体的遗传差异性。
关键词: 矮化早熟 突变体 RAPD分析 遗传差异
RAPD Analysis of Dwarfing and Early Ripening Kaoliang Mutant
Pan Ning 1 Zhao Qi1* Wang Zhenlian1 Yang Qizhi1 Wang Xiaojing2
( 1Dep artment of Biology , Cap ital N ormal Univ ersi t y , B eij in g 100037 ;
2H ua-nan N or mal Univ ersi ty , G uangZh ou 510631)
Abstract: By t he marking method of RAPD w e analy sed the dw ar fing and early r ipening kaoliang mutant
which go t from space shuttle. A fter selected the compatible kaoliang pr imer fr om plentiful corn pr imers, w e gained
four polymo rphic f ragments from thirt y- one random primer s. This r eflected t he genetic differ ence of the mutant .
Key words: Dwarfing and Early r ipening Mut ant RAPD Analysis Genetic differ ence
1996年选用高粱( Sorghum bicolor L . M oench)纯系种子进行卫星搭载。飞行 15天。1997 年经田间
实验筛选出有益突变体。与对照相比,突变体提前 15~ 20天成熟, 株高降低 30~ 50cm, 千粒重增加 7g ,叶
色浓绿,长势良好。以后连续 7年分别单穗播种, 避免杂交,仍表现早熟矮杆稳定遗传性状。
目前已完成对该突变体的农艺性状(生育期、株高、节间长度、穗部性状、叶形变异等)和品质分析(籽粒
蛋白、氨基酸、糖、单宁、淀粉等)研究。
自 1987年以来,我国利用返回式卫星搭载了 50多种植物种子。获得了大量的有益突变体。但至今未
见经搭载筛选出高粱突变体的报道。该突变体为研究航天环境与植物变异提供了宝贵材料,也为作物资源
增加了可遗传的矮化早熟基因 [ 1, 2]。
近年来生物技术迅猛发展,利用突变体对作物进行改良,已得到普遍关注。此研究项目旨在利用分子标
记技术对该突变体的变异进行深入研究。RAPD分子标记基于碱基序列差异来显示 DNA 特定的标记。目
前已在物种分类、遗传特性、基因定位和分子辅助育种中得到广泛应用 [ 3]。试验项目的研究关键是大量筛选
高粱的寡核苷酸引物。此试验成功地利用适合玉米的引物对高粱进行引物筛选,获得了与正常植株有差异
性的 DNA碱基序列。
1 材料和方法
1. 1 材料
实验材料为对照( R111) , 突变体( SP )种子, 2003年 5月播种,常规田间管理。待植株长到第五片叶片,
分别取对照和处理幼苗心叶下第二叶完全展开叶片, 0 e 冷藏待测。
收稿日期: 2004-11-23
* 国家自然科学基金资助项目( A 30170558)
**责任作者:赵琦,女,首都师范大学生物系教授。Tel: 010-68901494 E- mail : z haoqi@ mail. cn u. edu. cn
通讯作者:潘宁,女, 24岁,首都师范大学生物系分子生物学及基因工程专业硕士生。T el: 13683288399
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 2期
PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程技术公司。
1. 2 方法
采用 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)方法提取幼叶 DNA,与 Marker 对照电泳检测浓度后进行不同引
物的 RAPD扩增,引物由中国农业科学院作物所提供, RAPD扩增体系由 Maize Bio tech 查阅获得。
1. 2. 1 叶片 DNA 的提取和纯化 用 CTAB 法[ 4] 分别提取对照和突变体高粱植株叶片 DNA, 将提取的
DNA 稀释 50倍进行琼脂糖凝胶电泳检测, 直至浓度适合进行随机引物扩增。与标准的 20ng/ Ll DNA 及
Marker对照检测。
1. 2. 2 进行 RAPD分析 a. 按照下列反应体系及反应程序进行 PCR反应扩增: [ 4, 5] (表 1)
扩增程序按照: 1轮循环(变性) 94 e , 1分钟; 35轮循环(退火) 94 e , 30秒, 37 e , 45 秒, 72 e , 1 分钟; 1
轮循环( 延伸) 72 e , 10分钟。
扩增产物中加入 5Ll 5 @ SGB,取 15Ll样品在 1. 2%琼脂糖凝胶电泳(取 5Ll 100ng /Ll的 KDNA/ EcoRI
+ H ind为分子量 Marker) , 1 @ TAE 电泳缓冲液, 100v 恒压电泳两小时。凝胶于 1Lg/ m l溴化乙锭溶液
中染色 20分钟,清水漂洗 10分钟。紫外扫描成像。
表 1 PCR反应扩增体系
扩增体系 终浓度 25Ll体系用量
dd H2O ---- 15. 15Ll
T ag Buf fer( 10x; Mg- fr ee) 1@ 2. 5Ll
MgCl 2( 25mM) 1. 5 mM 1. 5Ll
dNT PMix ( 25mM) 100 Meach 0. 1Ll
T ag Enzym e( 2 L/ Ll ) 1U 0. 5Ll
Primer( 10LM) 0. 4LM 1. 25Ll
DNA( 20ng/Ll) 80ng 4Ll
b.引物B17, B7, G5, B19 序列( 5c----3c)分别
是:
引物 B17: AGGGAACGAG
引物 B7: GGTGACGCAG
引物 G5: CT GAGACGGA
引物 B19: ACCCCCGAAG
2 结果与讨论
2. 1 结果
实验中分别对正常高粱植株叶片 DNA( CK)及高粱突变体( SP )进行 B2, B3, B4, B6, B7, B8, B9, B10,
B11, B12, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B19, B20, A17, Y8, Y15, Y18, H7, F14, G4, G5, G7, G9, G10, G19等
引物的扩增,引物是从中国农科院亚洲玉米生物技术协作网选取的适合高粱的引物。
在这 30种引物中,经过电泳得到 4条差异性条带,如图 1所示:
从图 1中可以看到正常高粱植株叶片 DNA( CK)及高粱突变体( SP )在进行引物 B17, B7, G5, B19 扩增
时存在明显的条带差异性,这就表示在此序列内可能发生了基因的突变,产生了差异性。同时也说明了太空
微重力环境条件的影响下会导致植物内部发生基因的突变从而影响植物品质特征的改变。
2. 2 讨论
实验中第一次采用玉米引物筛选高粱,这在国内尚属首例。玉米引物是由中国农业科学院作物所/亚洲
玉米协作网0所提供,从中我们筛选适合于高粱的引物序列, 经过实验分析结果得到四条差异性条带。与正
常高粱植株相比,经过航天条件处理的高粱突变体在分子水平上初步显示了遗传差异性,这就说明在太空微
重力等环境影响下高梁植株可能发生了基因突变,从而产生了差异性扩增条带。从这 4条差异性条带还可
进一步对突变体进行分子水平分析,从而获知太空环境的影响下植物种子变异的性状特征。
RAPD分子标记技术是一种随机扩增技术, 具有简单、快速、灵敏等优点, 并具有很高的多态性,在水稻、
玉米等植物作物上已得到了广泛的应用,但在航天诱变高粱突变体分析实验中还是首次[ 6] 。通过初步研究
30 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期
图 1 利用高粱引物 B17, B7, G5, B19 等进行 PCR扩增后电泳图
取得了较好的实验结果, 从而也说明了
RAPD分子标记技术在高粱检测中的应用
是可行的。由于 RAPD分子标记技术稳定
性不太好,只能作为初步筛选鉴定材料的一
种手段,要进行深入分析,就需要进一步利
用分子生物学的技术和方法,如等位特异性
PCR或特殊序列扩增的方法 [ 7]。由于时间
和条件限制, 本实验仅初步从分子水平上对
航天条件下高粱突变体进行分析, 发现了遗
传差异, 要进行深入分析就需要利用更新更
准确的分子手段进行检测。
通过对航天诱变高粱突变体的初步分
析, 结果证明了具有高真空、微重力和强辐
射的太空环境,能直接影响植物的生长和发
育, 从而改变植物的遗传特征。太空环境对
种子所产生的诱变作用可能是太空环境中
各种诱变因素综合作用的结果, 究竟哪种因
素起主导作用, 以及它如何起作用, 都有待
于进一步研究。航天条件引起植物的变异,
也能为农作物改良和优良品种遗传开辟新
的天地。
实验在分子水平上对航天环境诱导产
生的矮化早熟高粱突变体进行了分析,证实
太空环境使突变体产生了基因突变。我们
首次采用玉米引物筛选高粱序列, 为进一步
研究突变体高粱的遗传特性奠定了基础。
参 考 文 献
1 荆玉祥,匡廷云,李德葆.植物分子生物学(第一版) . 北
京:科学出版社, 1995, 200~ 218.
2 刘新芝, 彭泽斌, 傅骏骅, 等. 中国农业科学, 1997, 30
( 3) : 44~ 51.
3 Clark MS.植物分子生物学实验手册 (第一版) .北京:
高等教育出版社和施普林修出版社, 1998, 236~ 252.
4 李 莹,赵姝华,刘世强.福建农林大学学报(自然科学
版) , 2001, 21( 2) : 12~ 15.
5 姜自锋,林乃铨,徐梅.福建农林大学学报(自然科学版) , 2002, 31( 3) : 356~ 359.
6 [美] F.奥斯伯等著,颜子颖,王海林,译.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社, 2001, 587~ 596.
7 Williams JGK, et al. Nucleic Acids Research, 1990, 18( 3) : 6531~ 6535.
312005年第 2期 潘宁等: 矮化早熟高粱突变体的 RA PD分析