全 文 ：第27卷 第1期
2015年1月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 27, No. 1
Jan., 2015
文章编号：1004-0374(2015)01-0030-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2015006
收稿日期：2014-09-29
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”计划)
(2013CB945600)
*通信作者：E-mail: guangshuo.ou@gmail.com
基于人工核酸酶的遗传修饰技术在线虫中的应用
张贤亮，欧光朔*
(清华大学生命科学学院，清华大学-北京大学生命科学联合中心，北京 100084)
摘　要：近年来，基于人工核酸酶 TALEN或 CRISPR-Cas9的遗传编辑技术表现出高效、快捷和靶向性修
饰等特点，已迅速成为生物学研究中的重要手段。在经典的遗传学模式动物线虫中，这两项技术的应用主
要包括：生殖腺基因敲除、条件性基因敲除、定点突变以及单拷贝基因插入等。将介绍这方面研究进展，
并展望这两项技术在线虫遗传学研究中的应用前景。
关键词：线虫；遗传修饰技术；TALEN ；CRISPR-Cas9；基因突变
中图分类号：Q789；Q819 文献标志码：A
Applications of engineered endonuclease in Caenorhadits elegans genome editing
ZHANG Xian-Liang, OU Guang-Shuo*
(Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)
Abstract: The engineered nucleases TALEN and CRISPR-Cas9 based genome editing techniques have recently
become valuable genetic tools, featured by their high efficiency, low cost and targeted gene editing. These two
techniques have been used in C. elegans research, including germline gene knockout, conditional gene knockout,
site directed mutation and single copy knockin. Here we review the recent progresses of the application of TALEN
and CRISPR-Cas9 in C. elegans and propose that both techniques will change C. elegans genetics.
Key words: C. elegans; genome editing; TALEN; CRISPR-Cas9; gene mutations
欧光朔，博士，清华大学生命科学学院研究员。以线虫的 Q神经前
体细胞为对象，研究细胞骨架和信号转导蛋白如何调控神经系统的发育。
Q神经前体细胞经历不对称分裂、长距离迁移、细胞凋亡及神经丝的形成，
发育成触觉神经元和中间神经元。欧光朔课题组建立了活体荧光显微成
像方法，在细胞器和分子水平上实时记录 Q细胞发育过程，并且发展了
基于体细胞 TALEN技术或体细胞 CRISPR-Cas9技术对线虫野生型基因
组进行条件性突变方法，研究 Q细胞发育分子机制。
20世纪 60年代，英国科学家 Sydney Brenner
首次将秀丽隐杆线虫 (Caenorhadits elegans)引入发
育和神经生物学研究领域，随后，其应用被广泛拓
展到其他生命科学领域，成为遗传学、发育生物学
和细胞生物学等学科研究的经典模式生物。线虫基
因组编码约 2万个基因，其中约 40%和人类基因
组具有同源性 [1]。历史上诺贝尔奖曾三度授予以线
虫为模型的科学家，以分别褒奖他们对于器官发育
和细胞程序性死亡的探索、RNAi现象的发现以及
GFP报告基因在生物学的首次应用。时至今日，线
虫是神经发育、行为认知、寿命与衰老、细胞凋亡，
以及细胞分裂等前沿生命科学研究的重要实验材料。
选择线虫为模式生物具有许多优势 [2]：线虫形
张贤亮，等：基于人工核酸酶的遗传修饰技术在线虫中的应用第1期 31
体小 (成虫长度仅 1 mm)且身体透明，适合大规模
培养和显微观察；线虫生活周期短 (3天左右 )；线
虫的基因组相对较小，每个母体能产生大量的后代
(约 300个 )，适合遗传筛选和分析；Sulston和
Horvitz [3]于 30多年前建立了线虫从受精卵发育到
成虫的完整细胞谱系，记录下包括细胞不对称分裂、
长距离细胞迁移、细胞凋亡以及细胞融合等多种重
要细胞生物学事件，使得对线虫的研究具有单细胞
分辨率。
线虫研究长期以来采用的基因组遗传学方法，
主要包括以遗传诱变为基础的正向遗传筛选和依赖
RNA干扰技术的反向遗传操作。正向遗传操作采
用物理射线、EMS诱变剂等对线虫进行诱变，再根
据特定的表型进行遗传筛选，得到相关突变体，进
而对诱变得到的突变体进行突变基因遗传定位，找
到突变的基因及位点。正向遗传操作成熟可靠，但
缺点是其过程需要大量的遗传定位工作，即使与全
基因组高通量测序结合，整个过程也至少需要一个
月的时间。另外，对于大量胚胎致死的基因，用遗
传诱变得到的突变体虽然可以用“balancer”技术
进行保存，但是操作繁琐 [4]。RNAi技术是基于小
RNA干扰现象发展起来的遗传学手段。在线虫中
对单个基因构建一段小干扰 RNA，通过显微注射、
浸泡或饲喂等方式使小 RNA进入线虫的细胞，降
解目的基因的 RNA，从而降低基因表达量。与传
统正向遗传学诱变筛选方式相比，RNAi技术具有
快速、便捷、靶向性等优点，弥补了传统诱变手段
的不足之处 [5]。然而，线虫某些特定类型的细胞，如
神经细胞，对于 RNAi的手段不敏感，可能原因是
线虫的神经元不能将小 RNA从胞外转运到胞内 [6]，
造成 RNAi较难应用于线虫神经生物学等研究。
鉴于以上传统遗传方法的不足之处，人们开始
致力于条件性基因人工编辑技术的研究。基于重组
酶 Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术在线虫中
曾有一例成功的报道 [7]，但其采用的方法步骤繁琐，
且须依赖于基因功能缺失型突变体。在实际应用中，
由于线虫 DNA同源重组效率非常低，需要首先获
得目标基因的缺失突变体，然后将含有 LoxP位点
的目标基因通过转基因的方式引入到该突变体内，
整合到其基因组中，最后将组织特异性启动子表达
的 Cre酶通过遗传杂交的方法引入含目标基因 LoxP
位点的线虫中，才能实现条件性基因突变。整个过
程，即使顺利也至少需要半年左右的时间。
综上所述，便捷高效的条件性基因敲除技术的
缺乏成为制约线虫研究领域发展的技术瓶颈。近年
来发展的人工核酸内切酶可以为实现高效、大规模
的条件性基因敲除提供有效的工具。人工核酸酶是
可以对基因组中特定位点进行修饰的序列特异性核
酸内切酶，目前广泛使用的有两类：转录激活子样
效应因子核酸酶 (transcription activator-like effector
nuclease, TALEN)和 II型成簇规律间隔短回文重复
序列 [type II clustered regularly interspaced short palin-
dromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein
(Cas)9 核酸酶 ]。TALEN 核酸酶采用的是蛋白
质 -DNA相互识别模式 [8]，而 Cas9核酸酶的序列
识别特异性则由 RNA-DNA的碱基互补配对和
PAM区域来共同决定 (图 1)[9]。与基因组上特定的
识别位点结合后，TALEN和 Cas9核酸酶切割识别
位点附近 DNA，产生双链 DNA断裂 (double-strand
DNA break, DSB)。在 DNA修复过程中，非同源末
端连接的修复机制 (non-homologous end joining, NHEJ)
直接将断裂的 DNA双链末端连接起来，可以产生
插入或缺失突变 (indel)，造成移码突变 (frameshift)，
实现基因敲除 [10]；而同源重组的修复 (homologous
recombination)可以将引入的模板 DNA 同源重组
到基因组特定位点，实现精确的基因组编辑 [11]。
TALEN和 Cas9核酸酶在功能基因组等基础研究和
基因治疗等生物医药领域极具应用前景。
近年来，TALEN和 Cas9核酸酶在包括线虫在
内的许多物种中被广泛使用，实现了对基因组不同
类型的修饰。其中，基于 TALEN和 CRISPR-Cas9
的遗传修饰技术目前在线虫中的应用主要包括：生
殖腺基因敲除、条件性基因敲除、定点突变以及单
拷贝基因插入等。
1　生殖腺基因敲除
在线虫中，通过传统的化学诱变及物理射线照
射等诱变手段，可以筛选到目标基因的各种突变体，
对于线虫中基因功能的研究发挥了重要的作用。经
过多年的积累，线虫具备了丰富的遗传资源 [13]，但
依然有很多基因没有突变体。2011年，Wood 等 [14]
利用锌指核酸酶和 TALEN在线虫中首次实现了靶
向的生殖腺基因敲除。他们将锌指核酸酶 (zinc
finger nuclease, ZFN)和 TALEN的 DNA结合结构
域与 Fok I核酸内切酶结构域进行融合，当 DNA结
合结构域特异性识别 12~15 bp长度的靶基因序列并
形成二聚体时，内切酶活性被激活，从而切割靶序
列，产生的 DNA损伤被 DNA修复系统修复，产
生命科学 第27卷32
图1　TALEN(a)和CRISPR/Cas9核酸内切酶(b)模式图[12]。
生移码突变，实现了基因敲除。实验中利用线虫生
殖腺特异表达的启动子 Ppie-1驱动融合蛋白的表
达，实现生殖腺基因敲除。
CRISPR-Cas9基因编辑技术以 21 bp左右的
sgRNA(single guide RNA)作为基因识别原件，当
sgRNA与基因组特异性结合后，内切酶 Cas9识别
PAM (protospacer adjacent motif)结构，对靶基因进
行切割，内源的非同源末端连接修复机制修复
DNA后，会产生插入或缺失，造成移码突变。利
用这一原理， Friedland等 [15]在线虫中首次发展了可
遗传的 CRISPR-Cas9生殖腺基因敲除技术，他们使
用生殖腺特异表达的启动子 Peft-3驱动 Cas9内切
酶的表达，用 U6启动子驱动 sgRNA表达，成功敲
除了 unc-119、dyp-13、klp-12和 Y61A9LA.1等基因。
随后，其他研究文献也报道了类似的 CRISPR-Cas9
生殖腺基因敲除技术 [16-21]。这些技术主要在 3个方
面有所不同：CRISPR-Cas9效应复合物的引入形式
(质粒、RNA或者蛋白质 )、DNA损伤修复的方式
(NHEJ或者同源模板介导的修复 )，以及对基因敲
除的检测和筛选手段 (基于 PCR的分子检测或者基
于筛选 marker的检测 )。其中，通过注射体外转录
RNA的方法需要对每一个靶序列进行体外 sgRNA
的转录，注射蛋白质 Cas9也需要体外纯化，成本
较高；而直接注射携带有 CRISPR-Cas9及 sgRNA
序列的质粒最为方便和快捷。同时，CRISPR-Cas9
质粒构建较之 TALEN质粒的构建也更为简单，可
大大减少工作量和时间 [22]。表 1中总结了使用
TALEN和 CRISPR-Cas9技术在线虫中成功敲除的
基因及其策略。
2　条件性基因敲除
许多线虫基因的突变体是胚胎致死的，对这些
基因在胚胎后发育，如神经系统发育和功能中的研
究需要条件性基因敲除的方法。2013年，Cheng等 [24]
建立了体细胞 TALEN技术，在线虫体细胞中诱导
表达 TALEN核酸酶，实现了条件性基因敲除。实
验通过线虫热激启动子或组织特异性启动子表达靶
向 dpy-5、lon-2和 mab-5等基因编码区的 TALEN
融合蛋白，条件性地诱导产生线虫身体变短 (dpy-5)、
变长 (lon-2)、Q细胞迁移方向错误 (mab-5)等预期
的表型。CRISPR-Cas9技术以其高效和时间短的特
点，也已成为线虫中条件性敲除的快捷手段 [16]。目
前，基于该技术，发展出两种不同策略用于线虫的
条件性基因敲除。2014年，Shen等 [22]利用热激启
动子和组织特异性启动子驱动 Cas9，并将编码
sgRNA的序列与 Cas9构建到同一质粒中，再将该
质粒直接显微注射到线虫生殖腺，建立了更加高效
快捷的条件性基因敲除手段。该研究成功敲除了
dpy-5、lon-2、unc-76、unc-104、mab-5、egl-44、
mig-13、cor-1和 gfp等多个基因。同年，Liu等 [25]
报道了另一策略，即将热激启动子或组织特异性启
动子驱动的 Cas9显微注射到线虫中，通过整合到
基因组得到可以条件性表达 Cas9核酸酶的转基因
线虫，同时将目标 sgRNA构建到细菌中，通过类
似于 RNAi的喂食 (feeding)手段，将 sgRNA导入
到线虫中，达到基因条件性敲除的目的。喂食的方
式虽然方便，但敲除效率与前一方法比较存在局限
性。根据这两篇文献中报道的数据，通过喂食方式，
张贤亮，等：基于人工核酸酶的遗传修饰技术在线虫中的应用第1期 33
在基因 dpy-5位点能对 16%的线虫进行敲除，低于
用 RNAi的手段实现的 67%的敲除效率，而直接注
射质粒，在 dpy-5位点实现了 91%的敲除效率。基
于直接注射 CRISPR-Cas9系统的高敲除效率，Shen
等 [22]还报道了一次性对多个基因同时进行条件性
敲除的方法。
TALEN和 CRISPR-Cas9条件性敲除技术策略
的建立和成熟应用，使得胚胎致死基因在线虫胚胎
后的功能研究成为可能。例如，体外实验表明，
Coronin是一种微丝结合蛋白，可以促进微丝的解
聚。但对 Coronin体内功能的研究则一直存在很大
争议：有研究认为 Coronin可通过调节微丝的动态
影响小鼠免疫系统 T细胞的迁移和归巢；而另外一
些研究则认为，Coronin以独立于微丝的方式调控
钙离子信号通路，从而影响 T细胞的存活。在线虫
中，Coronin的同源基因 cor-1突变体胚胎致死，导
致长期以来对其在线虫中功能的研究非常有限。
Cheng等 [24]和 Shen等 [22]分别利用发展的 TALEN
和 CRISPR-Cas9条件性基因敲除技术，在 Q细胞
中特异地敲除 cor-1，绕过了胚胎对于 cor-1的需要，
发现 cor-1特异地通过调控微丝结构影响细胞迁移，
而对细胞的存活没有影响。结合活体显微成像，
Shen等 [22]进一步对 cor-1的细胞骨架调控功能研
究发现，cor-1敲除会造成细胞迁移过程中胞内微
丝束异常粗大，同时细胞前导端过大，胞体不能跟
随前导端一起进行正常迁移。unc-60是线虫中
Cofilin的同源基因，负责解聚微丝。该研究还发现
活化形式的 unc-60(S3A)可以恢复 cor-1突变后的表
型，说明 cor-1通过调控微丝细胞骨架的周转
(turnover)，保持游离状态 G-actin和聚合状态 F-actin
之间的动态平衡，确保迁移细胞的正确形状和迁移
距离。
3　基因定点突变
在线虫中，通过经典的化学和物理诱变手段产
生的基因点突变缺乏位点靶向性。为研究特定的基
因的关键位点，体内定点突变成为重要的技术方向。
Dickinson等 [12]首次在线虫中利用 CRISPR-Cas9系
表1　使用TALEN和CRISPR-Cas9技术在线虫中成功敲除的基因及策略总结
靶基因 注射成分 表达组织 基因编辑类型 使用的核酸酶 参考文献
ben-1 mRNAs 生殖细胞系 敲除 TALEN [14]
ben-1 mRNAs + ssOligo 生殖细胞系 敲入 TALEN [20]
rex-1 mRNAs/mRNAs + ssOligo 生殖细胞系 敲除/敲入 TALEN [20]
smo-1 mRNAs + ssOligo 生殖细胞系 敲除/敲入 TALEN [20]
rex-32 mRNAs + ssOligo 生殖细胞系 敲除 TALEN [20]
lin-5 RNA(T7)+DNA(U6) 体细胞 敲除 Cas9 [18]
rol-1 RNA(T7)+DNA(U6) 体细胞 敲除 Cas9 [18]
dpy-11 RNA(T7)+DNA(U6) 体细胞 敲除 Cas9 [18]
unc-119 RNA(T7)+DNA(U6) 体细胞 敲除 Cas9 [18]
unc-1 mRNA(T7) 生殖细胞系 敲除 Cas9 [23]
dpy-3 mRNA(T7) 生殖细胞系 敲除 Cas9 [23]
unc-119 质粒 生殖细胞系 敲除 Cas9 [15]
dyp-13 质粒 生殖细胞系 敲除 Cas9 [15]
klp-12 质粒 生殖细胞系 敲除 Cas9 [15]
Y61A9LA.1 质粒 生殖细胞系 敲除 Cas9 [15]
dpy-5 质粒 体细胞 敲除 TALEN/Cas9 [22,24]
lon-2 质粒 体细胞 敲除 TALEN/Cas9 [22,24]
gfp 质粒 Q细胞谱系 敲除 TALEN/Cas9 [22,24]
mab-5 质粒 Q细胞谱系 敲除 TALEN/Cas9 [22,24]
egl-44 质粒 Q细胞谱系 敲除 Cas9 [22,24]
mig-13 质粒 Q细胞谱系 敲除 Cas9 [22,24]
cor-1 质粒 Q细胞谱系 敲除 TALEN/Cas9 [22,24]
unc-76 质粒 体细胞 敲除 TALEN/Cas9 [22,24]
unc-104 质粒 体细胞 敲除 TALEN/Cas9 [22,24]
生命科学 第27卷34
统对 LIN-31蛋白 C端的 4个磷酸化位点进行了定
点突变。该方法在 lin-31基因编码 C端磷酸化位点
序列附近设计 sgRNA，利用 CRISPR-Cas9技术在
靶位点附近造成 DNA损伤；与此同时，针对要突
变的位点，设计携带有突变后碱基序列的 DNA同
源模板，当 DNA损伤发生后，细胞内 DNA修复
过程中发生一定概率的同源重组，就可以将携带有
突变后序列的同源模板重组到内源的野生型基因位
点，替换掉原来的序列，达到定点突变的目的。
Zhao等 [26]对这项技术进行了发展，他们使用直接
合成的携带有突变序列的同源寡核苷酸短序列作为
同源重组的模板，与之前的方法中需要通过长片段
PCR构建质粒相比，节省了时间。同时，该研究还
发展了基于 PCR和酶切的分子检测手段进行突变
体的筛选。在之前的报道中，对突变体的筛选是基
于基因突变后所产生的可观测表型，因而只能对表
型已知或可简单观测的基因进行突变。而利用 PCR
和酶切的分子检测手段进行筛选，只要突变后该位
点附近能产生新的酶切位点，就可以进行筛选。利
用这一原理，Zhao等 [26]成功对 mec-4(u231)突变
体进行了恢复突变，得到了野生型表型线虫。这种
筛选手段拓展了可进行人工定点编辑的基因范围。
4　单拷贝基因插入
转基因线虫的获得是利用线虫为模式进行生物
学研究的前提。通过显微注射，使线虫获得可以稳
定遗传的染色体外 DNA阵列是目前最为通用的线
虫转基因技术 [27]。DNA阵列是多个拷贝的转基因
形成的串联序列，在线虫中可以稳定遗传，但因为
拷贝数多，在线虫的生殖腺中往往被沉默难以表达。
另外，这种携带 DNA阵列的转基因线虫中转基因
的高拷贝数，可能会造成目的基因过量表达而导致
发育缺陷，甚至死亡，使得研究陷入困难。在线虫
中实现基因的单拷贝插入，为解决此类问题提供了
新的方向。2008年，Frøkjær-Jensen 等 [28]首次利用
MosI转座子在外源转座酶的帮助下，将外源序列
插入到目的染色体位点。这种转座子插入的方法既
可以随机插入，也可以定点插入，他们利用该方法
实现了多个启动子驱动的荧光蛋白的表达，用 unc-
18、unc-122、spe-11等不同组织特异性启动子在不
同组织中实现了单拷贝插入表达的效果。2013年，
Dickinson 等 [12]首次报道了在线虫中利用 CRISPR-
Cas9及同源重组在目标基因位点插入 gfp的方法：
首先在需要插入 DNA的染色体附近设计 sgRNA，
并利用生殖腺中表达的 eft-3启动子驱动 Cas9表达；
而后将携带插入片段的同源臂 DNA和 CRISPR-
Cas9相关质粒共注射到线虫生殖腺；当插入位点附
近发生 DNA损伤及修复时，携带插入片段的同源
臂会和损伤基因组发生同源重组，最终将同源序列
插入到基因组中。MosI定点插入技术需要事先在
目的位点附近整合有MosI插入位点，目前全基因
组中仅有 14 000多个MosI插入位点可供选择，而
使用 Cas9进行插入，位点的选择更为丰富，随机
DNA序列中平均每隔 32 bp就可以有一个 CRISPR-
Cas9位点。但 Cas9插入技术也存在一定缺陷，即
线虫中同源重组的效率很低，该方法需要经过比较
大量的筛选过程。
5　展望
本文对近几年 TALEN和 CRISPR-Cas9技术在
线虫中的应用进行了介绍。我们认为 TALEN和
CRISPR-Cas9基因修饰技术将在线虫中得到广泛的
应用。例如，基于 TALEN和 CRISPR-Cas9，目前
已经开发出适用于不同系统的文库，将来使用针对
线虫基因组的 TALEN和 CRISPR-Cas9文库进行遗
传筛选，可以弥补 RNAi文库筛选时敲除效率不高
和持续时间短等限制。同时，TALEN、CRISPR-
Cas9、Cre/loxp和 FLP/FRT联合使用可以相互补充
验证，避免由于单个技术的脱靶或者某些位点效率
不高而造成的困难。TALEN和 CRISPR-Cas9基因
敲除技术在线虫中不同基因位点的编辑效率差别较
大，并且存在潜在的脱靶效应。如何提高这些技术
在有些基因位点效率低的问题，进一步提高特异性，
减少脱靶效应，将成为未来线虫基因敲除技术的重
要问题。
[参　考　文　献]
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