全 文 ：亚麻直接分化再生系统的初步建立
姬妍茹 田玉杰 宋淑敏 关向军
(黑龙江省亚麻原料工业研究所,双城 150111)
摘 要: 在亚麻愈伤分化再生系统基础上对诱导培养基和生根培养基加以改良。创立了一套新的亚麻再生
系统 直接分化再生系统。该系统使外植体不经过愈伤组织阶段直接获得分化芽,且在个别品种上绿苗诱导率
最高达 242. 11% ,移栽成活率达 60%以上 ,这为纤维亚麻遗传转化提供了良好的受体系统。
关键词: 亚麻 再生系统 直接分化 遗传转化 受体系统
Preliminary Creation on Regenerational Flax System
of Shoot Differentiate Directly from Explant
Ji Yanru T ian Yujie Song Shumin Guan Xiangjun
( H ei long j ian g P rov ince r aw Mater ial an d In dust ry I nsti tute of f la x , S huangcheng 150111)
Abstract: A new regener ational sy stem of fiber flax w as created, it w as called direct differ entiation r egenera
tional system. This sy st em base an improvement on regener ational system of shoo t differ entiated from callus. On the
medium of dir ect differ ent iation, the explant didnt produce callus, but had direct differentiation of shoot, moreover
on some genotype, the percent age of shoot inducement reach 242. 11% , the per centag e of transplant w as more than
60% . This w ill be pr ov ide a good accepto r sy stem fo r g enetic t ransfo rm on fiber flax .
Key words: Flax Regenerational system Dir ect different iation Genetic t ransfo rm Accepto r system
组织培养是进行生物技术育种的必要手段和有效途径。多年来,国内外关于亚麻组培基础理论方面的
报道很多, 大多集中在愈伤组织再生系统方面。关于亚麻直接分化现象在文章中虽有涉及 [ 1] ,但是关于直接
分化再生系统方面还未见报道。
愈伤组织再生系统是指外植体细胞经过脱分化和再分化过程获得分化芽, 在此过程中容易产生嵌合体,
而且体细胞无性系变异的可能性较大; 直接分化再生系统是未经脱分化的细胞直接分化芽。因此,体细胞无
性变异小,在遗传转化过程中能较好地保持受体植物的遗传稳定性, 而且培养周期短, 可以说是遗传转化的
理想受体系统[ 2] 。我们在原有的亚麻愈伤组织再生系统基础上,经过大量试验, 对培养基成分加以研究和改
进,建立了一套亚麻直接分化再生系统,以期能够对亚麻的转基因工作有所帮助。
1 材料与方法
1. 1 植物材料及处理方法
参试亚麻品种为黑龙江省亚麻原料工业研究所培育的双亚五号(以下简称双五)和引进的法国品种
Ariane(以下简称 A r)。
将饱满的亚麻种子先用 75%酒精浸泡 30分钟,再用 0. 1% HgCl2消毒 10 分钟,无菌水冲洗 3~ 4次,接
种到不含激素的 B5培养基上,室温 20~ 25 ,光周期 8小时,培养 7天后,切取无菌苗的子叶(去掉基部) ,茎
尖( 3~ 5mm) ,下胚轴( 1cm 左右)用于实验。
1. 2 培养基
收稿日期: 20041213
作者简介:姬妍茹( 1971 ) ,女,高级农艺师,从事亚麻生物技术育种研究
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 3期
1. 2. 1 诱导培养基 B5无机成分+ 改良的 N 6有机成分+ IAA( 4. 0mg / L ) + 6BA( 2. 0mg/ L)
1. 2. 2 分化培养基 B5无机成分+ 改良的 N 6有机成分+ IAA( 0. 5mg / L ) + 6BA( 2. 0mg/ L)
1. 2. 3 直接分化培养基(设三种处理) Ⅰ. B5无机成分+ 改良的 N 6有机成分+ IAA( 0. 5mg/ L ) + 6BA
( 2. 0mg/ L) + 蛋白胨( 25mg/ L ) + 麦芽糖( 25mg / L ) + 活性炭( 1. 5g/ L)
Ⅱ. B5无机成分+ 改良的 N 6有机成分+ IAA ( 2. 0mg/ L ) + 6BA( 2. 0mg/ L ) + 蛋白胨( 25mg/ L ) + 麦芽
糖( 25mg / L ) + 活性炭( 1. 5g/ L )
Ⅲ. B5无机成分+ 改良的 N6有机成分+ IAA ( 4. 0mg / L ) + 6BA( 2. 0mg/ L ) + 蛋白胨. ( 25mg/ L ) + 麦
芽糖( 25mg/ L ) + 活性炭( 1. 5g / L )
1. 2. 4 生根培养基(设三种处理) a. B5 + NAA(0. 1mg/ L) + H3 BO3 ( 15mg/ L) + NaMoO4 .H 2O( 0. 5mg/ L )
b. B5+ IAA( 0. 1mg/ L) + H 3BO3 ( 15mg/ L ) + NaMoO4 . H 2O( 0. 5mg/ L)
c. B5+ IAA( 0. 1mg/ L ) + NAA( 0. 1mg / L ) + 多效唑( 0. 0004mg/ L ) + H 3BO3 ( 15mg/ L ) + NaMoO 4 ( 0. 5
mg/ L)
1. 3 培养条件
外植体接种在培养基上之后, 置于室温 20~ 25 培养室内培养,每天用 2 000勒克斯荧光灯补照 10小
时。
1. 4 再生植株移栽方法
采用二次移栽法。首次移栽时,采用直径 10cm左右的小花盆(图 7) ,基质体积配比为草炭: 珍珠岩:腐
殖质土= 1: 1: 3,用透明薄膜罩住盆口, 并在其上扎孔通风, 3天后, 揭开一角逐渐通风, 7 天后撤去薄膜, 12
天左右,将确认已经成活并已生长的苗进行二次移栽。再次移栽时,采用直径 30cm 左右的大花盆(图 8) ,基
质为腐殖质土。将首次移栽成活的再生植株带土移入盆内。
1. 5 计算公式
1. 5. 1 外植体分化率计算公式 外植体分化率( %) = 分化外植体数/接种外植体数 100%
1. 5. 2 绿苗诱导率计算公式 绿苗诱导率( %) = 分化成苗数/接种外植体数 100%
1. 5. 3 无根苗生根率计算公式 生根率( % ) = 生根苗数/再生无根苗数 100%
1. 5. 4 移栽成活率计算公式 移栽成活率= 成活苗株数/移栽苗株数 100%
2 实验结果与分析
2. 1 直接分化培养基中激素水平搭配试验结果
从表 1可以看出,在亚麻外植体分化率和绿苗诱导率方面,对于两个不同的亚麻品种, 三个处理呈现的
规律是一致的。
( 1)外植体分化率方面:茎尖分化率均为 100%, 不存在差异;下胚轴分化率则是处理Ⅰ和Ⅱ之间效果相
近,外植体分化率达 88%以上,处理Ⅲ效果明显低于处理Ⅰ和Ⅱ。因而可以认为处理Ⅰ和Ⅱ比较适于外植
体的芽诱导。
( 2)绿苗诱导率方面:无论外植体是茎尖还是下胚轴,处理Ⅱ和Ⅲ效果明显好于处理Ⅰ,尤以处理Ⅱ效果
最佳,诱导率最低的 Ar 轴都已达到 154. 28% ,而诱导率最高的双五尖达242. 11%。可以认为处理Ⅱ比较适
于分化芽的生长并促其形成外观极佳的无根苗。
另外,我们可以看出,在两个不同的亚麻品种之间,除了Ⅱ处理中茎尖的绿苗诱导率相近外, 其余处理
中, Ar iane的绿苗诱导率明显低于双亚五号,这可能与基因型不同有关。
综上所述, 我们认为处理Ⅱ既有利于外植体(包括茎尖和下胚轴)的芽分化,又可以保证绿苗诱导率,可
使芽的分化和成苗过程在同一培养基上完成,是比较理想的直接分化培养基配方。单就下胚轴段为外植体
而言,为了提高分化率,也可采用在处理Ⅰ上诱导芽分化,再转至合适的培养基上促进苗生长的方法,以保证
42 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
绿苗诱导率的提高。
2. 2 愈伤分化再生系统与直接分化再生系统情况比较
2. 2. 1 外植体接种后的表现 在诱导培养基上, 外植体(茎尖或下胚轴)在接种 2~ 3天后,开始膨大, 10天
左右开始在切口处产生愈伤组织, 产生的愈伤组织有三种类型: 一种是绿色坚硬、块状的胚性愈伤组织
(图 1) ; 第二种是结构松软的淡黄色或黄白色的非胚性愈伤组织; 第三种是水浸状、块状比较坚硬的愈伤组
织。胚性愈伤组织在诱导及分化培养基上均可分化出苗,但不易继代保存。第二种愈伤组织易于继代, 但不
能直接分化出苗;第三种愈伤组织虽可分化出苗, 但多为玻璃苗。
在直接分化培养基上,外植体接种 2~ 3天后,茎尖表现为生长点向上生长并长出两片新叶,几天后基部
产生细长的不定根; 下胚轴段表现为 U形生长趋势(两端向上生长)。略微膨大, 但未产生愈伤组织,一周
后陆续在轴段上产生细密的芽点, 经过适当的培养长成再生绿苗(图 2) ;子叶表现为 2~ 3天后开始膨大, 5
天左右,从切痕处长出细长的不定根,约 20天后才开始有苗分化,但分化率极低。
2. 2. 2 如何保持芽的分化 在愈伤分化再生系统中, 对于在诱导培养基上不能再分化的愈伤组织, 针对其
类型分别对待, 胚性愈伤组织转至分化培养基上, 进行分化培养;非胚性愈伤组织则继代保存,通过调整培养
基(主要是调节激素配比) ,有一部分可转化为胚性愈伤组织再行分化。
在直接分化再生系统中, 由于外植体不产生愈伤组织, 培养基使用较少, 可以将其在原有培养基上切取
再生苗后,适当改变位置即可,不必频繁更换培养基,也能使外植体保持较好的芽分化能力。
2. 2. 3 两种培养基苗诱导情况比较 从表 2可以看出,直接分化培养基的绿苗诱导频率远远高于愈伤诱导
培养基,尽管愈伤组织可以在分化培养基上继续分化产生绿苗, 但据以往的经验第一培养基上诱导的绿苗占
主要地位,以后随继代时间加长,分化率降低且分化苗的品质较差,而直接分化培养基可以在极短的周期内
获得很高的绿苗诱导率, 这一点正是基因转化过程中良好的受体系统所应具备的条件。
2. 3 三种生根培养基配方的效果比较
从表 3可以看出,在生根率方面,三种培养基的效果无明显差异, 但是在苗和根系生长状况及移栽成活
率方面,培养基 c明显优于 a 和 b。在培养基 c 上,再生苗长势良好, 茎秆粗壮,叶色浓绿;再生根系密集、粗
壮,在移栽操作时,不容易造成根系的折断,移栽成活率大幅度提高。对于双五而言, c培养基上生根的苗其
移栽成活率是 a的 3. 49倍,是 b的 3. 88 倍; 对于 Ar 而言, c培养基上生根的苗其移栽成活率是 a 的 2. 76
倍,是 b的 3. 17倍。这一切主要是在培养基中添加了微量多效唑的结果。
表 1 不同激素水平搭配的直接分化培养基外植体分化及苗诱导情况
项目
处理
外植体:茎尖(个)
下胚轴(段)
分化的*
外植体数
再生
植株数
外植体分化率
( % )
苗诱导率
( %)
Ⅰ
双五尖 19 19 28 100. 00 147. 37
双五轴 35 31 47 88. 57 114. 28
Ar 尖 14 12 6 100. 00 42. 86
Ar 轴 35 32 21 91. 43 60. 00
Ⅱ
双五尖 19 17 46 100. 00 242. 11
双五轴 30 27 70 90. 00 233. 33
Ar 尖 18 18 41 100. 00 227. 78
Ar 轴 35 31 54 88. 57 154. 28
Ⅲ
双五尖 8 7 16 100. 00 200. 00
双五轴 34 24 53 70. 59 155. 88
Ar 尖 15 15 19 100. 00 126. 27
Ar 轴 27 22 35 81. 48 129. 63
* 此结果是在外植体接种 14天调查获得
432005年第 3期 姬妍茹等: 亚麻直接分化再生系统的初步建立
3 讨论
3. 1 影响直接分化的因素
试验所设计的直接分化培养基与与愈伤诱导培养基的区别在于加入了活性炭、蛋白胨、麦芽糖。而这三
个因素与激素配比因素一道成为直接分化的影响因素。在这四者之中, 活性炭的影响是至关重要的。在直
接分化培养基中不同激素水平效果比较过程中我们看到,无论是哪一种激素配比处理, 只要有活性炭的存
在,接种外植体在培养基上的表现是一致的: 经过一段时间培养,均没有愈伤化而是直接分化出芽,只不过分
化率有所不同。也就是说,在直接分化培养基中活性炭是控制外植体是否愈伤化的关键因素。而且据试验
观察加入活性炭的量在一定范围内( 1. 0~ 2. 5g)不会对外植体的芽分化趋势产生影响。有报道指出在培养
基中加入活性炭会产生意想不到的效果。关于出现这种现象的原因有几种猜测和解释: 一是活性炭能从培
养基中吸附许多有机物和无机物分子, 它可以清除培养的植物组织在代谢过程中产生的、对培养物有不良或
毒副作用的物质,也可以调节激素的供应。二是也许因为它的存在使培养基变黑,产生了类似于土壤的效
果,以利于植物的生长,可能会对组培效果有所帮助。三是活性炭有刺激胚胎发生或组织生长和形态发生的
作用[ 3] 。本次试验的结果与后者相符合, 但是活性炭在刺激胚胎发生方面和形态发生方面的真正作用机理
尚待研究。
表 2 诱导愈伤培养基与直接分化培养基绿苗诱导情况比较*
项目
外植体 接种数目 分化成苗数 诱导频率( % ) 培养 基 配方
茎尖(个)
8 7 87. 5 B5无机成分+ 改良 N 6有机成分+ IAA( 4. 0mg/ L)+ 6BA( 2. 0mg/L)
8 16 200. 00
B5无机成分+ 改良 N 6有机成分+ IAA( 4. 0mg/ L) + 6BA( 2. 0mg/
L) + 蛋白胨( 25mg/ L) + 麦芽糖( 25mg/ L) + 活性炭( 1. 5g/ L)
下胚轴(段)
34 6 17. 65 B5无机成分+ 改良 N 6有机成分+ IAA( 4. 0mg/ L)+ 6BA( 2. 0mg/L)
34 53 155. 88
B5无机成分+ 改良 N 6有机成分+ IAA( 4. 0mg/ L) + 6BA( 2. 0mg/
L) + 蛋白胨( 25mg/ L) + 麦芽糖( 25mg/ L) + 活性炭( 1. 5g/ L)
* 此表数据是指一次培养所分化的不定苗数
表 3 三种生根培养基配方的效果比较
项目
处理
参试无根
苗数 苗及其再生根系生长状况 生根苗数
移栽成活
株数 生根率( % ) 移 栽成 活率 ( % )
培养基
a
双五 260
Ar 176
苗略显纤弱,基部产生较多愈伤组织,
根粗,数量少。(图 5)
238
166
46
36
91. 54
94. 32
19. 33
21. 69
c/ a= 3. 49
c/ a= 2. 76
培养基
b
双五 256
Ar 184
苗纤弱,基部产生较多愈伤组织,根细
长,数量少。(图 3)
230
170
40
32
89. 84
92. 39
17. 39
18. 82
c/ b= 3. 88
c/ b= 3. 17
培养基
c
双五 260
Ar 176
苗茎秆粗壮,叶色浓绿, 基部产生较少
愈伤组织,根系粗壮密集。(图 4,图 6)
246
164
166
98
94. 61
93. 18
67. 48
59. 76
激素配比是影响外植体分化率的主要因素,试验中发现, 在直接分化培养基中低生长素、高激动素的配
比最有利于下胚轴的芽诱导; 而高生长素、低激动素配比则利于芽的生长; 这一点与前人研究的结果相吻
合[ 3]。本次试验中只是对生长素与激动素的大致配合比例作以研究, 最有利于分化芽诱导的二者的具体配
比浓度还有待于继续偿试。
在培养基中加入蛋白胨和麦芽糖各 25mg / L 左右,可使再生苗具有极佳的外观,接近正常实生苗。有利
于进行生根和移栽, 提高了再生植株的成活率。
44 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
3. 2 多效唑在壮苗、生根和移栽中的作用
获得完整的再生植株并移栽成活是组培的重要环节, 也是一个分化系统是否成功的关键所在。因而分
化的苗能否生根,生根质量的好坏,生根率的高低就显得尤为重要。本项研究中偿试在生根培养基中加入一
定量的多效唑收到了很好的效果。在该培养基上培养的再生苗叶色浓绿, 茎秆粗壮, 植株生长较慢, 能够
图 1 在愈伤诱导培养基上诱导产生的胚性愈伤组织 图 2 在直接分化培养基上从下胚轴上分化产生不定苗
图 3 生根培养基 b的壮苗效果 图 4 生根培养基 c的壮苗效果
图 5 生根培养基 a的生根效果 图 6 生根培养基 c的生根效果
图 7 用小花盆进行第一次移栽已成活的再生植株 图 8 将第一次移栽成活的再生植株移入大花盆内
452005年第 3期 姬妍茹等: 亚麻直接分化再生系统的初步建立
蹲住苗;再生根系密集而粗壮,极大地提高了再生植株移栽的成功率。这一点与师素恩 [ 4]〕等的研究结果
是一致的,再次证实了在生根培养基中加入适宜多效唑可增强根系的活力,提高试管苗的根/冠比值,增强植
物的抗性,提高试管苗对环境条件的适宜能力和移栽成活率这一结论[ 5]。需要注意的是,在使用多效唑时,
一定要控制用量 [ 5]。本次试验中使用的为分析纯制剂,经试验发现用量应控制在( 0. 0004~ 0. 0016mg/ L ) ,
量过大时,试管苗的生长受到影响,叶片颜色变成黄绿至淡绿,生长迟缓,基部愈伤组织产生过多, 影响生根
质量。
另外,对第一次生根未成功的苗,再行诱导生根时,应转至不含多效唑的培养基上进行生根,因为在研究
中发现,再生苗在含多效唑的培养基上培养时间过长, 会在试管中提早成熟,甚至开花,但不能结实。这主要
是多效唑的促进生殖生长作用所致。
3. 3 为基因转化初步创造良好的受体系统
本试验中研制的直接分化培养基及生根培养基配方的有效结合, 大大提高了亚麻组培的绿苗诱导率和
移栽成活率,同时极大地缩短了培养周期,为亚麻的遗传转化初步创造了良好的受体系统。相信, 经过不断
地探索研究,我们会将这一系统加以完善,以期对亚麻转基因育种工作有所助益。
参 考 文 献
1 孙洪涛,等.科学通报, 1985, 30( 2) : 1332~ 1334.
2 王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术(第一版) ,北京:科学出版社, 1998, 179~ 185.
3 崔德才,徐培文,等.植物组织培养与工厂化育苗(第一版) ,北京:化学工业出版社, 2003, 27~ 32.
4 师素恩,等.河北农业大学学报, 1993, 16( 3) .
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(上接第 40页)
4 Bradley DE, Bru neau AH, RQu. In ternat ional T urfgras s Society Resear ch Journal, 2001, 9: 152.
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12 王铖,李青,辛燕.北京林业大学学报, 2004, 26( 1) : 66~ 69.
国内信息
犬瘟热和犬冠状病毒联合 RTPCR检测方法的应用
塔里木农垦大学乔军、解放军大学夏咸柱、东北农业大学何宠彬等对此课题进行了研究。他们利用犬瘟
热( CDV)和犬冠状病毒( CCV)牧异性引物对同一样品中 CDV 和 CCV 的 RNA 模板进行联合 RTPCR扩
增,并优化其扩增条件,得到两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带,且不扩增犬细小病毒、犬腺病
毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。其敏感性试验表明: 该联合 PCR能检测出 104倍稀释的 CDV 模板
( 106. 6 TCID50 / 0. 1mL)。对 7份临床发病犬病科检测,其阳性检出率可高于电镜负染检查。这表明此法有高
度敏感、特异、准确、快速等特点,适用于当前民用和军用兽医临床对 CDV、CCV 的检测和对犬的其他疾病
的鉴别诊断。 秦春圃
46 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期