全 文 ：第27卷 第1期
2015年1月
Vol. 27, No. 1
Jan., 2015
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2015)01-0093-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2015014
收稿日期：2014-12-16
基金项目：国家杰出青年科学基金项目(31225017)；国家自然科学基金重大研究计划集成项目(91319310)
*通信作者：E-mail: jsli@sibcb.ac.cn
CRISPR-Cas9技术在干细胞中的应用
梁　丹，吴宇轩，李劲松*
(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，细胞生物学国家重点实验室，上海 200031)
摘　要：成簇规律间隔短回文重复序列系统 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, associated
RNA guided endonuclease Cas9 (CRISPR-Cas9)是细菌或古细菌在长期演化过程中形成的抵御外来遗传物质
的一种获得性免疫防御机制，其中 II型 CRISPR-Cas系统依赖 Cas9核酸内切酶靶向剪切外源 DNA。Cas9
内切酶在向导 RNA的指导下靶向性地剪切特定基因位点，已被广泛应用在不同种属的基因编辑研究中。利
用 CRISPR-Cas9基因编辑系统的优势，结合现有干细胞研究技术，在小鼠、大鼠，甚至灵长类动物的功能
基因组研究中，可以大幅提高各种基因修饰动物的获得效率，缩短获得的时间，从而快捷有效地研究基因
功能；同时，可以建立包括灵长类疾病模型在内的多种动物疾病模型，促进生物医学的发展，造福人类。
关键词：CRISPR-Cas9技术；sgRNA；基因编辑；成体干细胞；精原干细胞；单倍体胚胎干细胞
中图分类号：Q789；Q813 文献标志码：A
Progress of CRISPR-Cas9 in stem cell research
LIANG Dan, WU Yu-Xuan, LI Jin-Song*
(State Key Laboratory of Cell Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200031, China)
Abstract: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated RNA guided endonuclease Cas9
(CRISPR-Cas9) is a kind of adaptive immune defense system, which protects the bacteria or archaea against foreign
李劲松，博士，中科院上海生命科学研究院生化与细胞所研究员。实验
室主要利用核移植和 iPSC技术开展体细胞重编程相关的研究，围绕体细胞
重编程领域存在的效率低、重编程细胞发育率低以及重编程机制不清楚等问
题开展了三方面的研究，取得国际同行高度关注的原创性研究成果。1)在优
化核移植体系方面，建立了小鼠单倍体细胞，可以将这些细胞直接注入卵母
细胞中探讨细胞重编程，大大简化了核移植程序。2)在通过比较核移植与
iPS细胞技术异同以改善 iPS细胞体内发育能力方面，发现核移植过程中的
重要因子 Zscan4在 iPS细胞形成过程中能够稳定重编程细胞的基因组，从
而产生高质量 iPS细胞。3)在探讨核移植诱导体细胞重编程机制方面，揭示
了克隆囊胚滋养外胚层细胞的异常是克隆胚胎发育失败的关键原因。近年来，
利用实验室胚胎显微操作和干细胞技术平台，结合最新的基因编辑技术，开
展了基因治疗的相关研究，证明 CRISPR-Cas9可以用于遗传疾病的治疗。
这些研究成果为进一步揭示体细胞重编程的机制提供了新的研究手段和思
路，为体细胞重编程技术在再生医学和干细胞领域的应用奠定了重要的基础。
生命科学 第27卷94
genetic material. Type II CRISPR-Cas system relies on Cas9 endonuclease that cuts exogenous DNA. Cas9
endonuclease targets and attacks the specific gene loci under the guidance of single guide RNA (sgRNA). CRISPR-
Cas9 genome-editing technology has been widely used in different species. The application of CRISPR-Cas9
technology in stem cell research can greatly promote the generation of various genetically modified animal models
from mammalians, such as mice, rats and primates, which can be used to identify the function of different genes at
organismal level. Meanwhile, animal disease models can also be established efficiently, which can be applied to
development of new treatment strategies.
Key words: CRISPR-Cas9; sgRNA; gene editing; adult stem cells; spermatogonial stem cells; haploid embryonic
stem cells
随着 70年代 DNA重组技术的发展，分子生
物学研究进入一个新的时代。传统基因打靶技术主
要依赖于同源重组，通过对胚胎干细胞进行基因打
靶，然后将其嵌合入囊胚中，通过生殖系遗传获得
基因突变动物。这一传统方法在很长一段时间内是
获得基因敲除动物模型的主要手段，然而，对于一
些缺乏胚胎干细胞的物种，如灵长类动物，依靠传
统基因打靶技术构建特定基因敲除模型无疑十分困
难。最新建立的 CRISPR-Cas9基因编辑技术由于其
具有简单快捷的特点，像一场龙卷风，席卷了整个
基因编辑领域，使许多以前非常难进行遗传改造的
物种或细胞的基因操作变为可能。
CRISPR-Cas9系统是细菌或古细菌在长期演
化过程中形成的抵御外来遗传物质的一种获得性
免疫防御机制，Cas9内切酶在向导 RNA (single guide,
sgRNA)的指导下靶向性地剪切特定基因位点，随
后利用细胞自身的修复功能实现对基因的编辑。该
技术能够广泛应用不同种属、不同细胞中。本文
就 CRISPR-Cas9系统在干细胞研究中的应用进行了
综述。
1　CRISPR-Cas9技术发展简史
CRISPR第一次出现在公众视野是 1987年，
日本大阪大学研究人员 Nakata及他的同事在对大
肠杆菌的碱性磷酸酶 (alkaline pho-sphatase)基因进
行研究的时候，发现在这个基因编码区附近存在着
一小段简单重复，并且中间以独特的间隔序列隔开
的 DNA序列，但当时并没有引起足够的关注 [1]。
随后几年，越来越多的科学家从事微生物基因组解
析工作，在越来越多的细菌中发现这种奇特模式的
DNA序列。直到 2002年，这一序列才被 Jansen等 [2]
重命名为CRISPR (clustered regularly interspaced short
palindromic repeats)，并一直沿用到至今。接下来的
10年里，随着全基因组测序技术的不断成熟，在各
种细菌和古细菌 (archaea)中也陆续发现了这种由不
同的重复片段和空格片段组成的短间隔重复序列。
迄今为止，已发现超过 40%的细菌和 90%的古生
菌基因组中存在着类似序列 [3]。
起初，很多科研人员认为这些奇怪的序列是毫
无价值的垃圾 DNA。2005年对 CRISPR后续研究
是个至关重要的转折点，Mojica、Pourcel及 Bolotin
3个生物信息学团队发现 CRISPR的间隔序列与噬
菌体的基因序列高度同源，提示 CRISPR可能与细
菌、古生菌抵抗外源遗传物质入侵免疫保护机制相
关 [4-6]。随后 2006年，马里兰州贝塞斯达市美国国
家生物技术信息中心的 Makarova等 [7]首次提出，
细菌和古生菌中 CRISPR是通过类似于真核生物中
的 RNA干扰 (RNAi)来发挥作用的。2007年，总
部位于丹麦哥本哈根的丹尼斯克食品公司的科学家
Barrangou等 [8]揭开了细菌免疫系统的秘密：CRISPR
系统是细菌或古细菌在长期演化过程中形成的抵
御外遗传物质的一种获得性免疫防御机制。但在当
时，Barrangou等并未有充分意识到 CRISPR机制
巨大的潜在应用价值。随后，CRISPR以某个特定
的基因序列为靶标进行基因编辑，这是非常有价值
的特性，不仅仅被食品科学家和微生物学家关注，
很多领域科学家都意识到这一特性的重要性。到
2010年，距第一次实验正式 CRISPR在细菌免疫防
御机制中的作用仅仅 3年之后，CRISPR系统的功
能和机制变得越来越清晰。不同领域的科学家开始
把 CRISPR系统应用到各种各样的生物技术中，例
如培养筛选噬菌体抗性的乳制品。然而，CRISPR
以某个特定的基因序列为靶标进行基因组编辑的巨
大潜在应用价值并未发现。
2012年，德国亥姆霍兹传染病研究中心 (Helmholtz
Centre for Infection Research)的 Emmanuelle Charpentier
与加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna拉开了
CRISPR基因组编辑的序幕。他们发现 CRISPR-Cas
梁　丹，等：CRISPR-Cas9技术在干细胞中的应用第1期 95
系统有 3种类型，其中 II型 CRISPR-Cas系统依赖
Cas9核酸内切酶靶向剪切外源 DNA。Cas9内切酶
像剪刀一样在 sgRNA指导下对特定基因特定位点
进行靶向性剪切，形成双链 DNA缺口 (DNA double-
strand breaks, DSBs)，细胞可以通过同源重组修复
(homology-directed repair, HDR)或者非同源性末端
连接 (Non-homologous end joining, NHEJ)对断裂 DNA
进行修复 [9]。CRISPR-Cas9系统可以通过设计不同
的、长约 20 bp的 sgRNA对不同目标基因位点进行
靶向切割。这一研究，无疑是里程碑式的工作，从
来没有任何一向技术像 CRISPR-Cas9这样席卷整个
领域，成为众多科学家的宠儿。如果说 Jennifer
Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 的工作是拉开
CRISPR基因组编辑的序幕，那么麻省理工的 Feng
Zhang和 George Church教授以及其他实验室则陆
续揭示了 CRISPR-Cas9系统在真核细胞中巨大的应
用潜力 [10]。近一年来，数以千计关于 CRISPR-Cas9
系统的工作被相继发表。全世界十几个实验室已经
成功利用 CRISPR 技术对酵母 [11]、拟南芥 [12]、小
鼠 [13-14]、大鼠 [15]、斑马鱼 [16]、果蝇 [17]、青蛙 [18]进
行基因定向改造。CRISPR-Cas9系统结合显微操作
技术，通过将 Cas9 mRNA以及 sgRNA注射入动物
受精卵中，可以获得单个基因或者多个基因突变的
动物 [14]。中科院上海生化与细胞所的研究人员首次
利用 CRISPR-Cas9系统治疗小鼠先天性遗传白内障
疾病，这一研究为人类基因治疗提供新思路 [19]。
CRISPR-Cas9系统通过简单的转染细胞就可以对细
胞中的特定基因靶向编辑。麻省理工研究人员利用
CRISPR-Cas9系统，结合小鼠尾静脉注射，快捷有
效地构建出了小鼠肝癌模型，以便更加高效地了解
癌症发病机制 [20]。即使这一系列研究用于临床治疗
还有一段很长的路要走，但是我们坚信在不久的将
来，CRISPR-Cas9系统会在基因治疗中发挥巨大的
作用，推动生物医学的发展。
2　CRISPR-Cas9技术在多能干细胞和成体干
细胞中的应用
Ding等 [21]最早在人类多能干细胞中尝试了
CRISPR介导的基因组修饰，他们发现在人的多能
干细胞中 CRISPR比 TALEN具有更高的突变效率，
并且有部分细胞克隆会发生纯合突变。加州大学旧
金山分校的研究人员利用 CRISPR-Cas9技术纠正 β-
地中海贫血治病基因的诱导多能干细胞 (induced
pluripotent stem cells, iPSC)，再将突变基因修复的
iPSC诱导分化成红细胞，并观察到这些红细胞 β-
球蛋白的 RNA水平得到大幅度提高 [22]。Sloan-
Kettering研究所的研究人员在人类多能干细胞中通
过定点插入 Dox诱导型的 Cas9，使得 CRISPR介
导的基因组编辑在时间上变得可控，甚至可以在干
细胞分化的不同阶段诱导特定基因的修饰 [23]。
荷兰 Hubrecht研究所的 Hans Clevers实验室利
用 CRISPR-Cas9技术，在人类肠干细胞中纠正了与
囊肿性纤维化相关的基因缺陷。他们从囊肿性纤维
化患者的体内分离出来肠干细胞，然后利用 CRISPR-
Cas9技术修复了致病基因 CFTR (囊性纤维化跨膜
传导调节因子 )，使得细胞得到了功能性修复 [24]。
在最近的 Cell Stem Cell 封面文章中，哈佛干细胞研
究所的科研人员首次利用 CRISPR-Cas9系统靶向作
用于人类干细胞，精确编辑患者的造血干细胞 [25]。
CRISPR-Cas9技术介导的疾病治疗面临的最大
问题是脱靶现象，我们不希望在治好了一种疾病的
同时，却带来了另外一个问题。然而，新的全基因
组高通量测序技术，结合干细胞技术，使得在基因
治疗过程中通过全基因组测序的手段来挑选特定位
点被修复，而其他位点又未发生非特异编辑的细胞
系来进行进一步的应用成为可能，从而消除人们对
干细胞中基因组编辑的安全性的担忧。
3　CRISPR-Cas9技术在精原干细胞中应用
精原干细胞 (spermatogonial stem cells, SSCs)是
雄性生殖干细胞，在哺乳动物雄性个体的睾丸内能
够自我更新，并通过精子发生源源不断的分化成
精子，从而将遗传物质传递给子代 [26]。精原干细胞
体外培养体系的建立 [27-31]，以及将培养的精原干细
胞移入受体睾丸中产生有功能的雄性配子体系的建
立 [32-33]，为通过该细胞进行遗传改造获得动物模型，
通过基因修复进行基因治疗产生完全健康后代成为
可能 [34-35]。然而，以往的基因编辑方法在精原干细
胞中很难实现高效的遗传操作 [36-37]，从而限制了精
原干细胞的相关应用，特别是在治疗遗传疾病方面
的应用。
遗传疾病是指由于遗传物质的改变导致的疾
病，能够通过生育遗传给后代，是困扰人类健康的
一类重要疾病。彻底根治遗传疾病的方法是通过基
因治疗的手段在生殖细胞中修复改变的遗传物质，
并将正确的遗传物质传递给下一代，产生健康的个
体，从而在人群中彻底清除遗传缺陷。已有报道显
示，通过直接往携带遗传缺陷的受精卵中胞浆中注
生命科学 第27卷96
射 CRISPR-Cas9系统的方法，可以获得基因修复小
鼠 [19,38]。然而，通过直接胚胎注射的方法存在两个
问题，一是并非所有的新生小鼠能被治愈，二是存
在非常少的脱靶现象，而这两个问题都是临床应用
不被允许的。解决这两个问题有效的策略是在生殖
细胞，如精原干细胞中通过 CRISPR-Cas9技术修复
遗传缺陷从而获得完全修复的小鼠。近期，中科院
上海生化与细胞所的科研工作者从白内障小鼠的睾
丸中建立了精原干细胞系，该细胞携带了纯和的遗
传突变。研究人员将 CRISPR-Cas9转入精原干细胞
中，通过单细胞扩增的方式建立了一系列来自单个
精原干细胞的细胞系。随后，对这些细胞系进行了
深入分析，选择满足以下三个条件的细胞系进行移
植实验：1)通过基因型分析确定两个突变位点均已
修复；2)通过预测脱靶位点测序或者全基因组测序
确定不存在脱靶问题；3)通过特定印记基因甲基化
鉴定或者全基因组甲基化测序确定修复的精原干细
胞维持正常的表观遗传特性。最后，将这些细胞移
植到雄性不育的受体睾丸中，2个月后分离获得球
形精子，通过球形精子注射 (round spermatid injection,
ROSI)，获得了白内障修复的小鼠 [39]。这一研究开
辟了 CRISPR-Cas9在基因治疗上的新思路，我们相
信在不久的将来，CRISPR-Cas9技术将应用到基于
人类精原干细胞的基因治疗中，着力解决遗传缺陷
引起的男性不育以及伴性遗传疾病 [40-42]。
4　CRISPR-Cas9技术在单倍体胚胎干细胞中
应用
单倍体细胞，例如酵母，是遗传学研究中非常
重要的工具。酵母因其可以单倍体和二倍体同时存
在的优势，被作为一种模式生物广泛应用。当酵母
处在单倍体状态下，只需进行一次基因修饰，就能
获得某个特定基因缺失的酵母株，酵母这一优势大
大简化了基因操作，从而被广泛应用到基因筛选
中。自然状态下，哺乳动物中存在的单倍体仅有
在结构和功能上都已经发生特化的精子和卵子。在
有性生殖中，卵子和精子结合，形成受精卵，把遗
传信息传递给下一代。然而，精子和卵子都已经高
度特化，不能在体外进行遗传基因改造。猜想是否
存在这样一种单倍体干细胞 (haploid embryonic stem
cells, haESCs)，既可以像干细胞一样养在培养皿中
无限自我更新，易于基因操作，同时又可以具备精
子和卵子将遗传信息传递给后代呢？ 2011年，剑
桥大学Wutz实验室从孤雌激活的胚胎中建立了稳
定的孤雌单倍体干细胞系，并将其运用到基因筛选
中 [43-44]。2012年，中科院两个课题组通过显微操作
技术，先后建立了孤雄单倍体干细胞，通过流式分
选技术进行富集，孤雄单倍体干细胞体外能够稳定
培养传代。这一类孤雄单倍体干细胞被称为养在培
养皿里的“人造精子”，不仅可以在体外稳定传代，
并且能够代替精子，使得卵子“受精”，获得半克
隆小鼠 [45-46]。灵长类动物食蟹猴的孤雌单倍体胚胎
干细胞系也在 2013年建立 [47]。如果将单倍体干细
胞的优势与 CRISPR-Cas9系统的强大的基因编辑功
能相结合，推广到灵长类动物甚至人类，必将为灵
长类等大动物的基因功能及疾病模型建立等研究工
作开辟一条新的道路。最近，研究显示 CRISPR-
Cas9技术可以快速高效地在大鼠单倍体干细胞上进
行精确的基因修饰或敲除，并且基因修饰后的细胞
仍能维持单倍体和多能性状态；将基因修饰后的大
鼠单倍体胚胎干细胞注射入卵母细胞后产生半克隆
的大鼠 [48]。综上所述，单倍体胚胎干细胞系结合
CRISPR-Cas9基因编辑技术必将成为遗传筛选和基
因组工程改造的重要工具。
5　展望
从最初发现 CRISPR系统是细菌和古生菌抵御
外来遗传物质的免疫系统，到 CRISPR-Cas9系统应
用到不同种属、不同细胞中对特定基因进行改造，
从来没有任何一项技术像 CRISPR-Cas9系统风靡科
学界，迅速成为基因编辑技术的主力军，成为科学
家的新宠儿，让全世界的科学家为之兴奋不已。
CRISPR-Cas9系统较传统基因编辑技术更加简单快
捷、安全高效，应用也更为广泛。CRISPR-Cas9系
统结合现有干细胞技术必将快速推动疾病模型、临
床治疗以及基础生物学理论的研究。
[参 考 文 献]
[1] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide
sequence of the iap gene, responsible for alkaline
phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and
identification of the gene product. J Bacteriol, 1987,
169(12): 5429-33
[2] Jansen R, Embden JD, Gaastra W, et al. Identification of
genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.
Mol Microbiol, 2002, 43(6): 1565-75
[3] Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Soria E, et al. Biological
significance of a family of regularly spaced repeats in the
genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol
Microbiol, 2000, 36(1): 244-6
[4] Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clustered
梁　丹，等：CRISPR-Cas9技术在干细胞中的应用第1期 97
regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs)
have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology,
2005, 151(Pt 8): 2551-61
[5] Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, et al.
Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic
repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol,
2005, 60(2): 174-82
[6] Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements in
Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake
of bacteriophage DNA, and provide additional tools for
evolutionary studies. Microbiology, 2005, 151(Pt 3): 653-
63
[7] Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, et al. A putative
RNA-interference-based immune system in prokaryotes:
computational analysis of the predicted enzymatic
machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi,
and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct, 2006,
1: 7
[8] Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR
provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.
Science, 2007, 315(5819): 1709-12
[9] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable
dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial
immunity. Science, 2012, 337(6096): 816-21
[10] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome
engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013,
339(6121): 819-23
[11] DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, et al. Genome engineering
in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.
Nucleic Acids Res, 2013, 41(7): 4336-43
[12] Li JF, Norville JE, Aach J, et al . Multiplex and
homologous recombination-mediated genome editing in
Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA
and Cas9. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 688-91
[13] Shen B, Zhang J, Wu H, et al. Generation of gene-
modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting.
Cell Res, 2013, 23(5): 720-3
[14] Wang H, Yang H, Shivalila CS, et al. One-step generation
of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/
Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013, 153(4):
910-8
[15] Li D, Qiu Z, Shao Y, et al. Heritable gene targeting in the
mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat Biotech-
nol, 2013, 31(8): 681-3
[16] Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al. Efficient genome
editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Bio-
technol, 2013, 31(3): 227-9
[17] Yu Z, Ren M, Wang Z, et al. Highly efficient genome
modifications mediated by CRISPR/Cas9 in Drosophila.
Genetics, 2013, 195(1): 289-91
[18] Nakayama T, Fish MB, Fisher M, et al. Simple and
efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in
Xenopus tropicalis. Genesis, 2013, 51(12): 835-43
[19] Wu Y, Liang D, Wang Y, et al. Correction of a genetic
disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem
Cell, 2013, 13(6): 659-62
[20] Xue W, Chen S, Yin H, et al. CRISPR-mediated direct
mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature, 2014,
514(7522): 380-4
[21] Ding Q, Regan SN, Xia Y, et al. Enhanced efficiency of
human pluripotent stem cell genome editing through
replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell, 2013,
12(4): 393-4
[22] Xie F, Ye L, Chang JC, et al. Seamless gene correction of
β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using
CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Res, 2014, 24(9):
1526-33
[23] Gonzalez F, Zhu Z, Shi ZD, et al. An iCRISPR platform
for rapid, multiplexable, and inducible genome editing in
human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2014, 15(2):
215-26
[24] Schwank G, Koo BK, Sasselli V, et al. Functional repair
of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell
organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell, 2013,
13(6): 653-8
[25] Mandal PK, Ferreira LM, Collins R, et al. Efficient
ablation of genes in human hematopoietic stem and
effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell, 2014,
15(5): 643-52
[26] Oatley JM, Brinster RL. The germline stem cell niche unit
in mammalian testes. Physiol Rev, 2012, 92(2): 577-95
[27] Kubota H, Avarbock MR, Brinster RL. Growth factors
essential for self-renewal and expansion of mouse
spermatogonial stem cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,
101(47): 16489-94
[28] Ryu BY, Kubota H, Avarbock MR, et al. Conservation of
spermatogonial stem cell self-renewal signaling between
mouse and rat. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(40):
14302-7
[29] He Z, Kokkinaki M, Jiang J, et al. Isolation, characterization,
and culture of human spermatogonia. Biol Reprod, 2010,
82(2): 363-72
[30] Sadri-Ardekani H, Mizrak SC, van Daalen SK, et al.
Propagation of human spermatogonial stem cells in vitro.
JAMA, 2009, 302(19): 2127-34
[31] Kanatsu-Shinohara M, Muneto T, Lee J, et al. Long-term
culture of male germline stem cells from hamster testes.
Biol Reprod, 2008, 78(4): 611-7
[32] Brinster RL, Avarbock MR. Germline transmission of
donor haplotype following spermatogonial transplantation.
Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(24): 11303-7
[33] Brinster RL, Zimmermann JW. Spermatogenesis following
male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci USA,
1994, 91(24): 11298-302
[34] Kubota H, Brinster RL. Technology insight: in vitro
culture of spermatogonial stem cells and their potential
therapeutic uses. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2006,
2(2): 99-108
[35] Oatley JM, Brinster RL. The germline stem cell niche unit
in mammalian testes. Physiol Rev, 2012, 92(2): 577-95
[36] Kanatsu-Shinohara M, Ikawa M, Takehashi M, et al.
Production of knockout mice by random or targeted
mutagenesis in spermatogonial stem cells. Proc Natl Acad
Sci U S A, 2006, 103(21): 8018-23
生命科学 第27卷98
[37] Izsvak Z, Frohlich J, Grabundzija I, et al. Generating
knockout rats by transposon mutagenesis in spermatogonial
stem cells. Nat Methods, 2010, 7(6): 443-5
[38] Long C, McAnally JR, Shelton JM, et al. Prevention of
muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated
editing of germline DNA. Science, 2014, 345(6201):
1184-8
[39] Wu Y, Zhou H, Fan X, et al. Correction of a genetic
disease by CRISPR-Cas9-mediated gene editing in mouse
spermatogonial stem cells. Cell Res, 2014, doi: 10.1038/
cr.20140160. [Epub ahead of print]
[40] Miyamoto T, Hasuike S, Yogev L, et al. Azoospermia in
patients heterozygous for a mutation in SYCP3. Lancet,
2003, 362(9397): 1714-9
[41] Santos F, Fuente R, Mejia N, et al. Hypophosphatemia and
growth. Pediatr Nephrol, 2013, 28(4): 595-603
[42] Singh SR, Burnicka-Turek O, Chauhan C, et al .
Spermatogonial stem cells, infertility and testicular cancer.
J Cell Mol Med, 2011, 15(3): 468-83
[43] Elling U, Taubenschmid J, Wirnsberger G, et al. Forward
and reverse genetics through derivation of haploid mouse
embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2011, 9(6): 563-74
[44] Leeb M, Wutz A. Derivation of haploid embryonic stem
cells from mouse embryos. Nature, 2011, 479(7371): 131-4
[45] Li W, Shuai L, Wan H, et al. Androgenetic haploid
embryonic stem cells produce live transgenic mice.
Nature, 2012, 490(7420): 407-11
[46] Yang H, Shi L, Wang BA, et al. Generation of genetically
modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid
embryonic stem cells. Cell, 2012, 149(3): 605-17
[47] Yang H, Liu Z, Ma Y, et al. Generation of haploid
embryonic stem cells from Macaca fascicularis monkey
parthenotes. Cell Res, 2013, 23(10): 1187-200
[48] Li W, Li X, Li T, et al. Genetic modification and screening
in rat using haploid embryonic stem cells. Cell Stem Cell,
2014, 14(3): 404-14