全 文 ：适合原位 RT-PCR的石蜡切片制作方法
刘宏 牛建新 韩晓燕
(石河子大学农学院园艺系,石河子 832003 )
摘 要: 石蜡切片是原位 RT-PCR 中常用一种生物制片技术,简要阐述原位 RT-PCR 的原理以及适合于原
位 RT-PCR 的石蜡切片的制作流程, 对其易出现的问题和解决办法作了简要的概述。
关键词: 石蜡切片 原位 RT-PCR
Research of the Paraffin Method Suits in Situ RT-PCR
Liu Hong N iu Jianx in Han Xiaoyan
( Depar tment of H ort ic ul tur e , A g ri cul tu ral Col l eg e of S hihez i Univ ersi ty , S hih ez i 832003)
Abstract: The par affin slice w as a biolog ical slice making techno log y commonly used in In situ RT-PCR. This
article br iefly elabo rated t he In situ RT-PCR principle, as w ell as the appropr iate flow o f paraffin slice making for
the In situ RT- PCR. And the questions that wer e easy appeared in t he paraffin making and t he solut ions were br ief
elaborat ion.
Key words: Paraffin slice In situ RT-PCR
20世纪 80年代中期( 1985) , Kary mullis[ 1] 发
明了 PCR技术。从此,分子生物学领域中一项具有
强大生命力的聚合酶链式反应技术诞生。在形态学
研究领域,将 PCR 技术与形态结构相结合, 产生了
原位 PCR 技术。近年来, PCR 与逆转录酶结合的
逆转录 PCR( reverse t ranscription PCR, RT-PCR)
技术得到了大量的改进和越来越广泛的应用, 原位
RT-PCR技术应运而生。石蜡切片是原位 RT-PCR
中常用的制片技术,其特点是能够保存良好的形态
结构,切片易于保存, 便于进行回顾性研究, 但其弱
点是敏感性较低 [ 2]。石蜡切片的制作一般要经过取
材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片及封固
等过程。整个过程虽然并不复杂但要真正制出高质
量的切片,每一个步骤的操作都很重要,需要不断的
摸索和改进。本文就适合于原位 RT-PCR的石蜡
切片的制作流程及其易出现的问题和解决办法作了
简要的阐述。
1 原位 PCR的基本原理
原位 PCR( in situ PCR, IS PCR)技术 Haase于
1990年首次报道[ 3] 。其原理就是在组织细胞原位
进行 PCR高效扩增,以检测单拷贝或低拷贝的特定
DNA 或 RNA序列。原位 RT-PCR是原位 PCR中
常用的一种方法, 它可将 mRNA 原位反转录为 cD-
NA,然后进行原位 PCR。因此, 可用于扩增和检测
标本中罕见的 mRNA, 比如定量细胞表达特殊 mR-
NA 丰度或检测扩增产物的细胞起源。其优点是逆
转录后,即在显微镜载玻片上进行扩增,鉴定信号细
胞的起源,不需要标本中提取 mRNA。这样就不会
有在核酸的分离步骤中潜在的信号丢失。原位逆转
录 PCR的基本步骤包括:标本制备、预处理、反转录
反应、原位 PCR扩增、扩增后处理和原位检测。原
位逆转录 PCR的标本制备有三个重要目的:保存良
好的形态学特征、使 PCR试剂易于到达细胞内欲扩
增的序列、避免扩增产物扩散或漏出细胞[ 4] 。因此,
收稿日期: 2005-12-29
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 30060053、30360066 ) ; 国家科技攻关计划引导项目 ( 2003BA546C ) ; 兵团科委项目
( NKB02SDXNK01SW )
作者简介:刘宏( 1980- ) ,女,在读硕士,研究方向:从事果树生物技术的研究
通讯作者:牛建新, njx 105@ 163. com
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
制作出合适的切片对原位 PCR的成败有着至关重
要的作用。
2 石蜡切片制作步骤
2. 1 标本固定
其目的: ( 1)保存组织细胞的形态结构, 便于定
位。( 2)保存用做 PCR 模板的 DNA 或 RNA。固
定剂有两类( 1)交联固定剂: 甲醛、戊二醛。保持组
织细胞形态好, 但渗透慢。( 2)沉淀固定剂:甲醇、乙
醇和丙酮。保存组织形态结构差,且影响部分双链
核酸。常用的固定剂为 10%缓冲福尔马林或 4%多
聚甲醛。亦有实验表明, 用纯丙酮固定亦可获得满
意结果。但其中多聚甲醛使用较广,一般采用 4%
多聚甲醛( PFA)固定剂, 因多聚甲醛所致的生物大
分子交联较轻, 对核酸探针的穿透性影响较小。其
即能较好地保存组织及细胞内的 mRNA,同时又能
较好地保持组织细胞结构 [ 5]。固定过程中需不断震
荡,能使组织块内水分充分脱出。不同的固定时间
及温度对原位逆转录 PCR的结果影响很大。应用
4%的多聚甲醛固定时时间应在 30m in~ 24h( 4%的
多聚甲醛室温作用 1h 的渗透率为 2mm) [ 6]。时间
过短,组织细胞固定不良,形态结构和核酸的保存都
不理想。时间过长, 会降低靶核酸的可及性。要取
得较好的杂交效果, 除了选取合适的固定剂外,还要
注意取材时要尽量避免 RNA 酶的污染,且尽快固
定,尽可能减少 mRNA 的降解 (最好在 4 下固
定)。
2. 2 标本脱水
其目的: ( 1)使材料变硬, 形状更加稳定。( 2)除
去材料中的水分,使包埋剂和封固剂渗透到组织中。
常用的脱水剂为梯度乙醇。脱水过程中易出现的问
题主要是脱水不净或过度硬化, 脱水不净时二甲苯
不能渗入,蜡液不能渗入组织,可导致切片困难。而
组织蜡块与空气接触后也会因水分蒸发而凸陷, 故
脱水时一定要保证脱水液浓度达标,经常更换新液,
遇较大组织时宜加长脱水时间。组织在纯酒精中放
置的时间也不能过久, 否则会造成组织过度硬化和
过度收缩,另外为防止组织过硬,对于比较柔嫩的组
织,其起始的脱水酒精浓度可低于 70% [ 7]。
2. 3 标本透明
材料在除尽水分后, 用一种既能与脱水剂又能
与包埋剂相混合的溶剂来处理材料, 以便于包埋剂
的渗入。二甲苯是最常见的透明剂, 二甲苯及浸蜡
时间过长则组织易脆、变硬 [ 8]。取材时将组织块厚
规定在 0. 1~ 0. 3cm 内,这样易固定脱水, 但其收缩
性强,极易使组织变脆导致切片时组织易破碎, 故在
这一过程中要严加控制。一般 30m in 就可达到透
明的程度,但温度较低时可适当延长时间或置于温
箱中加热。另外在透明过程中还要注意更换二甲
苯,有时甚至更换二、三次以上, 每次 10min 左右。
如二甲苯为旧液体,应选择多的更换次数。
2. 4 标本浸蜡、包埋
浸蜡的目的在于进一步除去材料中的二甲苯,
而代之以石蜡。浸蜡一般是从低温至高温,从低浓
度到高浓度,这样可以使石蜡慢慢渗入组织内, 而将
透明剂替代出来。浸蜡和包埋要一次完成,要尽量
在恒温下操作, 防止中间出现温度差。蜡的温度要
适宜,不能过高使组织烫坏或使较小组织变脆、变
硬。也不能温度过低使组织与石蜡脱离[ 9]。蜡块中
不能出现气泡、裂隙、斑点,对于较小组织要尽可能
使其处于同一平面,否则会造成切片不全与漏切了,
此时要尽可能使较小组织下沉, 并防止其重叠。包
埋时蜡温控制在 65 ~ 70 。蜡温过低影响组织
与石蜡融合, 造成包埋面凹凸不平。切片时甚至出
现组织块脱落。蜡温过高则出现组织漂浮,不易包
埋在同一水平面上 [ 10]。
2. 5 切片
手工切片时, 用力要均匀一致,不宜过重过猛,
这样容易造成切片厚薄不均, 甚至毁坏蜡块。在夏
季切片时,为保持蜡块硬度, 可把蜡块放于冰柜中。
组织蜡块四周在切片前应修齐, 大小适当。切片机
要放稳,不能震动,切片刀要放置好, 倾斜角要大小
适宜,一般以 20 ~ 30 为宜。
2. 6 展片
( 1)水浴展片法:用镊子小心捡起组织切片带,
将其漂浮在水浴表面。牵拉切片待以消除皱褶。将
干净的载玻片伸入到水浴的液面下, 让组织切片的
一侧载玻片的标记端以约 45度角将载玻片缓慢拖
出水面。组织切片在室温干燥 [ 11]。( 2) 酒精-水浴
展片法:切片前将 35% 的酒精用小染色缸装满一
缸,然后把切下的组织蜡带放入 35% 的漂片酒精
592006年第 1期 刘宏等:适合原位 RT-PCR的石蜡切片制作方法
中,再用载玻片捞出放入 45 的温水中,这时蜡带
上的细小皱褶通过酒精的张力伸开、展平[ 12] , 从而
避免了传统方法用镊子撑折造成的人为裂隙。通过
用 35%酒精漂过的蜡带既完整又无皱褶,而未用酒
精漂过的蜡带, 皱折多,如用镊子撑折就会造成组织
裂隙、破碎。( 3)温台展片法: 用解剖针轻轻将蜡带
放在载玻片上, 将带有蜡片的载玻片放在温台上(一
般温度为 35 ) , 拉片受热后慢慢展平。
2. 7 防脱片剂的应用
在制片过程中, 为了防止细胞、组织标本在原位
PCR操作过程中脱落,载玻片要涂以防脱片剂。尤
其是石蜡切片, 防脱片剂显得尤为重要。常用的防
脱剂为多聚赖氨酸( po ly-L-lysine, PLL) ,其次是 3-
氨丙基三乙氧硅烷( 3-aminopropy l t riethoxy-silane
APES)和铬明胶( chr ome gelat in)等上述三者中, 效
果最好的是 PLL。其作用原理是溶液中的多聚赖
氨酸分子可与组织切片间氨基酸位点结合, 因此用
其涂布载玻片可使组织切片能牢固地粘附于载玻片
上,不易脱落[ 5]。
2. 8 封固
切片封固不良,易出现气泡、云雾状物等现象。
其原因可归纳为:封固时二甲苯已挥发完毕, 封固剂
过稀,切片厚薄不匀,切片未展开, 封固方法不当, 组
织脱水不净等。故在封固前, 当二甲苯挥发后,应重
新放入到二甲苯中透明, 封固剂要浓度适当, 封固时
先将盖玻片一侧放置于滴有中性树胶的组织切片
上,后缓慢放下将空气完全排除。封固时避免水蒸
气进入。
因石蜡切片易于保存、便于进行回顾性研究,所
以其在原位 PCR 及原位杂交试验中应用较为广泛。
但因为其制作过程较为复杂,要想获得理想的石蜡
切片,则需要在实践中不断地摸索总结和汲取新的
知识,才能制作出高质量的切片。
参 考 文 献
1 黄留玉. PCR最新技术原理、方法及应用. 北京: 化学工业出版
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10 王伯云,李玉松,等主编.病理学技术 [ M ] . 北京:人民卫生出版
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11 周民生.应用原位 PCR 技术检测库尔勒香梨病毒的研究 [ D] .
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12 王珏,赵伦华,等.郧阳医学院学报, 2003, ( 5) : 365.
国外动态
英改进动物转基因技术
Ag Biotech Reporter 2004年 21卷 6期 8页报道: 英国广播电台( BBC)宣称,用常规方法培育转基因猪
不仅代价高昂, 而且效果很差,例如将基因注射入 70个胚胎后, 只有约 1个胚胎能发育成长为改良动物。
有鉴于此, 英国的罗斯林研究所最近已对用于动物的转基因工程技术作了很大的改进。在罗斯林研究
所最近对 40个猪胚的试验中,已使其中的 36个猪胚成功地发育成长为转基因猪。这证明,新技术的转基因
效果相当于原来的技术的 10至 100倍。
指出新的动物转基因技术首先利用慢性病毒作为选定基因载体,并将其导入受精卵,然后再将受精卵植
入代孕母体。 汪开治
60 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期