全 文 :第26卷 第11期
2014年11月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 26, No. 11
Nov., 2014
文章编号:1004-0374(2014)10-1166-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2014165
收稿日期:2014-09-17
基金项目:国家自然科学基金项目(31271331,31071095);高等学校博士学科点专项科研基金项目(20120008110017)
*通信作者:E-mail: lou@cau.edu.cn
DNA聚合酶在维持基因组稳定性中的
多重功能及其相关疾病
邹友龙,李丽莉,楼慧强*
(中国农业大学生物学院,农业生物技术国家重点实验室,北京 100193)
摘 要:遗传物质的稳定传递是生命繁衍的根本。基因组 DNA的精确复制和分配是遗传物质传递的基础,
也是细胞周期两大最核心的生物学事件。DNA聚合酶作为催化合成 DNA双链的酶,是复制过程中最重要
的因子之一。尽管对这类酶的研究已有将近 60年的历史,但依然是生命科学基础研究的前沿之一。真核生
物中已知的 DNA聚合酶有十几种,它们不仅参与正常基因组 DNA合成过程,也参与 DNA损伤情况下多
种修复过程。如此众多的具有不同特性的 DNA聚合酶在细胞内是如何分工与合作的,在正常细胞传代与
环境胁迫等情况下维护基因组稳定性中的关键作用及其分子机制又是什么。更有意思的是,最近的肿瘤细
胞比较基因组数据表明,多种 DNA聚合酶基因突变与某些肿瘤和遗传疾病相关,从而为这些疾病致病机
理研究与诊治提供了新的思路和方法。对上述 DNA聚合酶相关核心问题的最新研究进展进行了综述。
关键词:DNA复制;DNA聚合酶;复制检验点;基因组稳定性相关疾病
中图分类号: Q523;Q754 文献标志码:A
The critical roles of DNA polymerases in genome stability
and related human diseases
ZOU You-Long, LI Li-Li, LOU Hui-Qiang*
(State Key Laboratory of Agro-Biotechnology, College of Biological Sciences,
China Agricultural University, Beijing 100193, China)
楼慧强,博士,中国农业大学特聘教授,中国农业大学染色体复制
实验室负责人,微生物与免疫学系主任,农业部土壤微生物重点实验室主
任,教育部“新世纪优秀人才”支持计划入选者。长期专注于酵母染色体
复制调控研究,在国际上率先报道了酵母先导链复制叉上的 DNA复制检
验点蛋白 (Mrc1)与 DNA聚合酶 Polε的相互作用,为真核生物 DNA复制
叉上的聚合酶 /解旋酶“偶联假说”提供了有力的证据,并将 DNA复制
与 S期检验点调控衔接在一起,得到国际同行高水平论文和综述的高度
认可和评述。在Mol Cell、J Biol Chem、Oncogene、EMBO Rep、DNA Repair
等 SCI期刊发表论文。研究室主要方向包括:(1) DNA复制机器的启动
和控制;(2) S期复制检验点及代谢通路对复制的调控;(3)与 DNA复制
偶联重要事件如姐妹染色单体黏连机制等。楼慧强 教授
邹友龙,等:DNA聚合酶在维持基因组稳定性中的多重功能及其相关疾病第11期 1167
在生命繁衍过程中,遗传物质的复制和传递是
最基本也是最重要的一步。自从发现 DNA是生物
遗传信息的主要物质基础后,对于 DNA复制过程
的研究就从未停止过。如何确保人类基因组长达 30
亿碱基对的遗传信息在复制过程中尽可能减少错误
是细胞稳定传递遗传信息的前提。哺乳动物细胞
DNA复制过程中的错误率一般是 10−9~10−10,这是
通过 DNA聚合酶以及一系列错配修复过程共同决
定的。其中贡献最大的是 DNA聚合酶本身的保真
性,即酶对底物 dNTPs的甄别可以使错误率达到
10−5,而聚合酶本身的校对功能 (proofreading)使错
误率进一步降低 2个数量级左右,加上复制后的错
配修复等机制能够使整个 DNA复制过程错误率控
制在 10−9~10−10[1]。
DNA复制过程是一个受到严格时空调控的生
物学过程,可分为起始 (initiation)、行进 (progression)
和终止 (termination)三个阶段。目前研究相对较为
清楚的是复制起始阶段,因为复制起始的控制是细
胞保证在正确时间完成全部基因组 DNA精确复制
且只复制一次的最重要环节。在真核生物中,DNA
的复制发生在细胞周期的特定时期,即 S 期
(synthesis phase)。在染色体上特定的位置起始复制,
这些位置被称为复制起点 (origin)。真核生物染色体
有多个复制起点。复制起始涉及一系列复制蛋白按
照一定的时空顺序组装成复杂庞大的复制机器。在
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等模式生物中
的研究揭示了真核生物 DNA复制机器组装的基本
过程。为保证所有 DNA都复制且只能复制一次,
起始过程又可分为 3个步骤,每一步都受到严格的
控制。第一步,颁发执照 (licensing),即在起点位
置招募组装由起点识别复合体 (origin recognition
complex, ORC)、Cdc6、Cdt1、DNA解旋酶 MCMs
(minichromosome maintenance)组成的前复制复合体
(pre-replication complex, pre-RC)。这一步在M期末
期开始,在 G1期完成,在起点位置装配了的 pre-
RC复合体赋予该位置进一步组装复制机器起始复
制的潜力 [2]。第二步,在 G1/S细胞时相转换过程中,
S 期细胞周期蛋白依赖的激酶 (S phase cyclin
dependent kinase, s-CDK) 及 DDK(Dbf4-dependent
kinase)蛋白激酶活性增强,通过磷酸化等手段在
pre-RC基础上进一步招募 Cdc45/GINS/Mcm10以及
Dpb11/Sld2/Sld3/DNA聚合酶等因子组装形成起始
前复制复合体 (pre-initiation complex, pre-IC)。此时
复制机器已经基本完成装配,整装待发。第三步,
当细胞正式进入 S期,随着 s-CDK等激酶活性进
一步增强,DNA解旋酶复合体正式被激活,双链
DNA被解开成单链,标志着 DNA复制起始阶段的
完成。在 S期,随着复制叉的行进,解旋酶不断解
开模板链,并由 DNA聚合酶催化合成新生链,是
DNA复制的行进阶段。当两个相向而行的复制叉
相遇,DNA复制进入终止阶段,所有 DNA复制叉
的行进都在 S期的晚期终止。
1 DNA复制机器中的重要因子
1.1 ORC
ORC复合体是由 Orc1-6六个亚基组成的复合
体,能够识别并结合复制起点,最早在酿酒酵母中
发现。后来的研究证明,ORC复合体在真核生物
中的功能非常保守而且必需。ORC结合 DNA的序
列特异性则在不同物种有较大差异。酿酒酵母中
ORC结合的序列称为自主复制序列 (autonomously
replicating sequence, ARS),而在粟酒裂殖酵母和果
蝇中,ORC倾向于结合富含 AT的 DNA序列,通
常位于染色质上无核小体区域 (nucleosome free
region, NFR)。人细胞中的 ORC结合 DNA似乎没
有明显的序列特异性,这可能是由于在人细胞中尚
Abstract: Genome replication and segregation are two key processes during the cell cycle, which ensure the fidelity
of transmission of genetic materials during cell proliferation. As the only enzyme responsible for synthesis of double
helical DNA strand, DNA-dependent DNA polymerase is among the most important factors in DNA replication. In
each eukaryotic cell, there are dozens of DNA polymerases with different characteristics, required for DNA
replication and/or DNA repair. How do so many DNA pols divide their labor of DNA synthesis and coordinate each
other? What’s the underlying mechanism of different DNA pols in maintenance of genome stability under normal or
stressed environment? Furthermore, many somatic mutations in DNA pols have been identified to be associated
with some particular tumors and genetic disorders. What’s the exact molecular etiology of these DNA polymerase-
related diseases? These key issues of DNA polymerase are summarized in this review.
Key words: DNA replication; DNA polymerase; DNA replication checkpoint; genome instability-related diseases
生命科学 第26卷1168
未大规模确定复制起点。ORC结合 DNA也与
DNA的空间结构有关系,在裂殖酵母和果蝇中的
研究发现,ORC倾向于结合具有超螺旋结构的
DNA,而人细胞中 DNA复制起点附近也发现有拓
扑异构酶的结合 [3]。
1.2 Cdc6和Cdt1
Cdc6 属于 AAA+ATPase 家族。研究发现,
Cdc6在 DNA复制过程中 pre-RC的组装过程中发
挥重要作用,Cdc6活性的调节对于调控 pre-RC在
细胞周期特定时期的组装有重要作用。Cdc6被招
募到染色质依赖 ORC复合体,而 Cdc6的招募又是
Mcm2-7结合到染色质所必需的。而 Cdc6蛋白中
ATP结合位点突变的研究表明,ATP的结合与水解
对于 Cdc6的功能是非常重要的。
Cdt1在很多真核生物中都是保守的,是 pre-
RC组装过程中另一个必需因子。Cdt1与 Mcm2-7
解旋酶形成复合体,能够与 Cdc6蛋白相互作用,
从而将Mcm2-7招募到染色质上。
1.3 Cdc45-Mcm2-7-GINS(CMG)复合体
真核生物双链 DNA解开是由非常保守的
MCM复合体负责的。Mcm2-7六个亚基组成环状
异六聚体。最新的研究表明,Mcm2-7以没有活性
的双六聚体形式在 G1期被组装到前复制起始复合
体。随后,Cdc45和 GINS在 Dpb11/Sld2/Sld3等蛋
白的帮助下被招募并与Mcm2-7形成 CMG复合物。
只有在细胞进入 S期时,双六聚体形式的 CMG复
合物才会被解开并激活启动双链 DNA解旋,但具
体激活机制仍然有很多未解之谜。
1.4 DNA聚合酶
近 60年前,自 Arthur Kornberg首次发现 DNA
聚合酶 I以来,DNA 聚合酶一直是 DNA研究的焦
点。可以说,DNA聚合酶是所有 DNA复制蛋白中
人们相对了解最多、最为深入的因子,并由于在 PCR
等技术中的卓越应用已远远超越了具体某个领域。
2009年,Burgers[4]研究发现,高等哺乳动物
的基因组编码 15个不同的 DNA聚合酶 (表 1),分
别参与不同的生物学过程,包括复制及各种不同的
修复途径等。按照序列的保守性,它们分别属于 A、
B、X、Y 4个不同的家族,其中 B家族中 DNA聚
合酶 α (Polα)、DNA聚合酶 ε (Polε)以及 DNA聚合
酶 δ (Polδ)主要参与基因组 DNA的复制。
Polα是 DNA复制过程中的引发酶,为前导链
和后随链 DNA聚合酶提供 DNA合成所需的引物,
在酿酒酵母中它由 Pol1、Pol12、Pri1和 Pri2等 4
个亚基组成,Pri1能够合成一段短的 RNA引物,
而 Pol1则进一步在 RNA引物之后合成一段大约 20
个核苷酸的 DNA引物,进而由前导链和后随链
DNA聚合酶合成子代 DNA链 [5]。
尽管早就发现 Polε和 Polδ参与 DNA复制过
程 [6],但直到 2007年,Kunkel课题组才通过巧妙
的遗传实验证明 Polε和 Polδ分别负责前导链和后
随链的复制 [7]。Polε由 Pol2、Dpb2、Dpb3和 Dpb4
等 4个亚基组成,催化亚基 Pol2也具有 5→3DNA
聚合活性以及 3→5核酸外切酶活性。Pol2是一个
必需基因,但是它的 N端包含整个核酸酶以及聚合
酶结构域的 175~1136位氨基酸 , 敲除 Pol2的细胞
能够存活,而聚合酶活性位点突变则是致死的,暗
示着 Pol2的必需功能域存在于它的 C端,它参与
的催化碱基掺入的功能能够被其他聚合酶替代 [8-9]。
Dpb2对细胞生存也是必需的,在细胞周期能够被
周期蛋白依赖激酶 CDK周期性磷酸化 [10]。最近研
究表明,Dpb2能够帮助 Pol2招募到复制起点形成
复制复合体 [11]。Polε的两个小亚基 Dpb3和 Dpb4
则是非必需基因,但是在敲除这两个基因的酵母细
胞中突变率增加,说明它们对于 Polε复制的保真性
有一定的作用 [12]。
Polδ 负责后随链的复制,由 Pol3、Pol31、
Pol32等 3个亚基组成。Pol3是催化亚基,具有
5→3DNA聚合活性以及 3→5核酸外切酶活性,
能够切除错误配对的碱基,保证 DNA复制的保真
性。和其他 B家族的 DNA聚合酶一样,Polδ的大
亚基 Pol31是一个必需基因,但其具体功能并不清
楚。Pol32能够与 Pol31和 PCNA相互作用,对于
Polδ的复制延续性起着很重要的作用。
这些 DNA聚合酶不仅负责 DNA复制,还参
与很多其他的生理过程。Polε和 Polδ参与了包括核
苷酸切除修复 (nucleotide excision repair, NER)[13]、
碱基切除修复 (base excisionrepair, BER)[14-15]等 DNA
修复过程。包括 DNA聚合酶在内的一些 DNA复
制因子也是 BIR (break-induced replication)修复途
表1 高等哺乳动物中的DNA聚合酶
家族 聚合酶
A Polγ、Polθ、Polν
B Polα、Polδ、Polε、Polζ
X Polβ、Polλ, Polμ, TDT
Y REV1、Polη、Polι、Polκ
注:黑体:必需基因
邹友龙,等:DNA聚合酶在维持基因组稳定性中的多重功能及其相关疾病第11期 1169
径必需的 [16-17]。
真核生物中还存在其他十几种 DNA聚合酶,
包括 Polη、Polι、Polκ、Polλ、Polμ、Polζ等 [18],目前
认为它们并不参与正常 DNA复制过程,但是参与
了 DNA复制后的很多损伤修复过程,包括碱基切
除修复 (BER)、核苷酸切除修复 (NER)和跨损伤修
复 (translesion synthesis, TLS)等。目前研究较多的
是 Y家族的 REV1、Polη、Polι、Polκ等聚合酶参与
的 TLS。当基因组上存在 DNA损伤并阻止了正常
复制的进行时,会由具有易错复制功能的 Y家族聚
合酶进行跨损伤修复,从而保证基因组复制的完成。
2 DNA复制缺陷与疾病
2.1 复制过程的调控
真核生物基因组 DNA的复制在一个细胞周期
过程中只能发生一次,而为了防止复制起点重复起
始,细胞内存在两个主要的途径来调控。第一个途
径是前复制复合体 (pre-RC)在复制起点的装配,即
ORC复合体识别复制起点,然后通过 Cdc6、Cdt1
等因子,招募复制解旋酶Mcm2-7复合体。而这个
过程只能在细胞周期的 G1期,当 CDK活性很低
而 APC (anaphase promoting complex)活性较高时发
生 [19-20]。第二个途径是前起始复合体 (pre-IC)的组
装和复制起始,即在 Sld2、Sld3、Dpb11等因子的
作用下将 DNA聚合酶招募到复制起点形成 pre-IC,
然后在一系列因子,包括Mcm10、Cdc7/Dbf4等相
关蛋白的作用下,激活复制解旋酶 CMG复合体。
由于起始过程中一些蛋白质包括 Sld2/Sld3等发挥
功能依赖于 CDK的磷酸化,因此,这个过程只能
在细胞周期的 S期,当 CDK活性高而 APC复合体
没有活性时发生 [19-20]。APC作为调控细胞周期行进
的重要因子,Wang等 [21]研究表明,APC复合体亚
基 APC6/APC8的一些突变可能导致人类结肠癌的
发生。
2.2 复制胁迫及其相应通路
在整个细胞周期过程中,基因组要经受来自内
源和外源的各种压力,可能造成各种 DNA损伤,
主要有电离辐射造成的双链断裂 (double strand
break, DSB)、UV照射造成的嘧啶二聚体以及烷基
化试剂造成的 DNA碱基修饰等。这些损伤如果不
能及时被修复,就可能会造成基因组的不稳定,甚
至细胞的死亡。为了保证遗传信息精确地复制和传
递,细胞内存在一系列能够感应并识别 DNA损伤
的信号通路,称为检验点 (checkpoint),包括复制检
验点 (DNA replication checkpoint, DRC)、DNA损伤
检验点 (DNA damage checkpoint, DDC)等。DNA复
制和损伤检验点是真核生物中高度保守的信号通路
网络,监控着基因组 DNA。一旦存在 DNA复制压
力或 DNA损伤时会被激活,启动一系列信号通路,
停滞细胞周期,修复 DNA损伤。在 DNA损伤修
复完成以后,检验点关闭,细胞周期继续行进,进
入下一个时相,以保证基因组 DNA在细胞分裂前
的稳定性 [22]。
真核生物 DNA复制过程中复制叉的行进是被
严格调控的,即解旋酶的解旋以及聚合酶的聚合必
须同步偶联 [23-24]。存在复制压力时,比如复制到一
些难复制区域,如 rDNA 区或者 dNTP胞内含量的
减少等,可能导致解旋酶和聚合酶的解偶联, 从而
产生单链 DNA (ssDNA)。积累的 ssDNA 被单链
DNA结合蛋白 RPA结合后招募并激活感应激酶
ATR/Mec1,然后通过 Claspin/Mrc1的介导磷酸化
下游的效应激酶 Chk2/Rad53。激活的 Chk2/Rad53
随后通过磷酸化一系列底物,完成细胞对复制胁迫
或 DNA损伤的应激反应。这些反应包括稳定停滞
的复制叉、上调 dNTPs 水平、抑制晚期复制起点的
起始、延长 S期、启动相应修复途径等 [25]。
当 DNA发生损伤时会激活 DNA损伤检验点,
其信号通路与复制检验点类似,不同的是激活的
Mec1是通过 Rad9将信号传递给 Rad53,进而调控
下游的修复途径,包括招募和调控一些参与修复的
聚合酶 [26]。在细胞周期的各个不同时期,DDC通
路的激活机制有所不同。当前研究表明,在 DRC
与 DDC中,很多因子是共用的。在细胞中,这两
条通路可能同时被激活,但是它们的主要功能还是
有区别的,DRC主要作用是在 S期维持复制叉的
稳定,保证 DNA复制准确的完成,而 DDC则负责
在所有细胞时相识别并修复 DNA损伤。
DNA聚合酶作为复制过程中最重要的因子也
被认为参与了检验点通路,很多参与修复途径的聚
合酶或者能感应识别 DNA损伤,或者能被检验点
通路调控参与修复。其中研究较多的是 DNA Polε。
最早研究发现,在酵母中 Polε的催化亚基 Pol2参
与了检验点通路,Pol2的 C端的一些突变体存在检
验点通路缺陷 [27-28]。后来进一步的研究发现 Pol2
通过其 C端保守的锌指结构域参与检验点功能 [29],
但是具体机制并不清楚。
2.3 DNA复制相关因子的突变及相应的人类疾病
DNA复制过程中的很多因子对于细胞的正常
生命科学 第26卷1170
生存都是必需或者非常重要的,如果发生突变都会
导致相应的疾病。MCM复合体是DNA复制解旋酶。
研究表明,当其中一个亚基MCM2突变时,会导
致很多组织干细胞能力的缺陷或癌症的发生 [30];当
小鼠细胞内Mcm4亚基发生突变时,会导致基因组
的不稳定及腺癌的发生 [31]。
DNA聚合酶作为复制过程中最重要的因子之
一,当发生突变时,会导致癌症的发生。对子宫癌
和结肠癌患者癌细胞的大量基因组测序分析表明,
其聚合酶 Polε和 Polδ都存在突变,而且大都存在
于保守的核酸酶结构域内,影响了聚合酶的保真
性 [32-33]。而对 Polδ的研究发现,当聚合酶结构域
内发生突变时会使聚合酶的保真性降低,从而导致
癌症的发生 [34];小鼠中 Polδ的核酸酶活性区域内
第 400位天冬氨酸的突变会影响其核酸酶活,使得
小鼠细胞更容易癌变 [35]。Polδ的核酸酶活性对于胚
胎早期发育,防止癌症的发生也非常重要 [36]。当前
研究结果表明,无论是 DNA聚合酶的聚合酶活性
还是核酸酶活性,对于保证复制的保真性以及维持
基因组稳定都非常重要。
尽管越来越多的基因组数据表明,DNA复制
因子,包括多个 DNA聚合酶的突变与众多严重威
胁人类健康的遗传性疾病与肿瘤关系密切。然而,
这些突变是否是导致这些疾病的主要原因及其具体
致病机理,还有待今后更深入的研究。相信包括模
式生物和动物模型在内的研究将有助于人们对 DNA
复制缺陷导致的细胞病变机理的深入了解,为基因
组不稳定性相关的疾病的诊治提供新的思路。
[参 考 文 献]
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