全 文 ：农杆菌介导的水稻双载体共转化法中部分影响因素的研究
陆美芳1, 2 刘巧泉1 于恒秀1 顾铭洪1*
( 1扬州大学江苏省植物功能基因组学重点实验室,扬州 225009; 2中国农业科学院农业信息研究所,北京 100081)
摘 要: 以 T-DNA 区分别只含有潮霉素选择标记基因(H PT)和 G US 报告基因的双元载体 pCAM BIA1300
和 pCAMBIA0301用于农杆菌介导的水稻共转化试验。根据经农杆菌浸染并共培养 3d 后水稻愈伤组织中的 GUS
瞬间表达情况及其稳定共转化率,测定了不同农杆菌菌株搭配及其不同浓度配比对共转化效率的影响。结果表
明,在两种农杆菌菌液浓度比为 1: 1 的情况下,农杆菌 EHA105/ pCAMBIA1300与 EHA105/ pCAMBIA0301 组合
共转化水稻的效率要高于其他菌株的组合;在以农杆菌 EHA105/ pCAMBIA1300 与 EHA105/ pCAMBIA0301 进
行共转化时,两种菌液浓度比为 1: 2 时共转化效率最高。
关键词: 水稻 共转化 T-DNA 区 GUS 瞬间表达
A study on Several Factors Influencing Co-transformation of
Rice with Two Agrobacterium Binary Vectors
Lu M eifang1, 2 Liu Qiaoquan1 Yu H engx iu1 Gu Minghong1
( 1 K ey Lab of J iang su Plant Functional Genomics, Yang zh ou Univ er sit y , Yangz hou 225009;
2 I nsti ture of A g ri cul tu ral I nf or mation , CA A S, B ei j ing 100081)
Abstract: Tw o binar y vecto rs, pCAMBIA1300 and pCAMBIA0301 containing hybromycin resistance gene
( H P T ) and GUS reprot er gene in their T-DNA reg ion, r espectively, w ere used to investigate t he efficiency of co-
transformat ion of r ice. T he effects o f either the combinat ions or t he densities o f Agrobacter ium strains on co- tr ans-
fo rmation eff iciency w ere car efully t ested according to both the GUS transient expression in infected calli and the sta-
ble co- t ransformat ion eff iciency . The r esult s show ed that the combination w ith Ag robacter ium str ains EH A105/
pCAMBIA1300 and EH A105/ pCAMBIA0301 achieved a higher co- transformat ion efficiency than that o f the ot her
bacter ium combinations w hen the same density of these tw o bacter iums w as used to infect the rice callus. Addition-
ally , w hen the density of tw o A grobacter ium str ains EHA105/ pCAM BIA1300 and EH A105/ pCAMBIA0301 w as
adjusted to 1: 2, the co- transformation efficiency w as higher than that of the other density r atio .
Key words: Ory za sativa L . Co- transformation T-DNA reg ion GUS transient expression
随着分子生物学研究的深入和转基因技术的日趋成熟,遗传转化已成为作物遗传改良的一种有效手段。
但随着转基因作物的商业化进程不断加快,其可能存在的潜在安全性问题逐渐摆在研究者的面前,其中关键
之一便是有关对抗性选择标记使用的担忧[ 1]。这些选择标记基因通常编码除草剂抗性或抗生素抗性基因,
它们会不会通过与杂草的杂交而传递给杂草或被人体内的病原菌所接收从而对人体健康造成潜在影响都是
一个未知数。为了消除这种选择标记基因,科学家们尝试了各种方法,比较常见的是共转化法。
所谓共转化法, 是指把目的基因和选择标记基因分别构建进不同的载体或同一载体的不同区段,将两种
载体同时转进同一受体细胞后,通过筛选标记基因编码的性状, 可同时选出一定比例含目的基因的共转化细
胞。在这些同时含有两种基因的转化子中,必定有一些目的基因和选择标记基因在基因组上的整合位置相
收稿日期: 2005-07-11
基金项目:国家/ 8630高技术研究计划( 2004AA212092)和国家自然科学基金( 30470992和 30300226资助项目)
作者简介:陆美芳( 1977- ) ,女,扬州大学遗传育种专业硕士,现就职于中国农业科学院农业信息研究所
* 通讯作者:顾铭洪, E-mail: gumh@yzu. edu. cn,电话: 0514-7979304
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
距较远。这样, 选择标记基因和目的基因可因遗传重组在下一代中被分离,而得到只含有目的基因的转基因
植株。
农杆菌介导转化法是目前获得转基因植物的主要方法。用于农杆菌共转化的载体类型较多, 就目前已
有报道的可分为 4种:第一种称为双 T-DNA 双元载体(又叫超双元载体) , 这种质粒载体上含有两个分离的
完整 T-DNA区,目的基因与选择基因分别位于两个 T-DNA 区内, 如 Komar i等 [ 2]构建了分别含抗生素抗
性基因和 GUS 基因的超双元载体用于水稻转化, 共转化率为 47%, 经筛选后代中有一半为只含有 GU S活
性的植株。第二种称为双右边界双元载体,这种载体与超双元载体的区别在于它只有一个左边界,整个结构
为第一个右边界 ) 选择基因 ) 第二个右边界 ) 目的基因 ) 左边界。Lu 等[ 3]运用这种载体结构转化水稻,获
得了共整合植株,并从后代分离到只含目的基因的植株。第三种为双菌株双载体法,即将目的基因和选择标
记基因分别构建在两个双元载体的 T-DNA区上, 再分别导入农杆菌的不同菌株,然后同时用于转化。Buck
等[ 4]用此方法转化拟南芥及烟草,获 18%的共转化率。第四种是单菌株双载体法, 即将分别含有目的基因
和选择标记基因的两个质粒载体导入同一农杆菌菌株中, 再用于转化,由于此技术对载体的要求较高,一般
很少使用。
本研究利用两个双元载体 pCAMBIA1300 和 pCAMBIA0301进行共转化试验,其 T-DNA 区分别含有
潮霉素选择标记基因 ( HPT )和 GU S 基因。通过将含有 GUS 基因的双元载体导入农杆菌 3 种菌株
EH A105、LBA4404和 AGL-1后,与农杆菌 EHA105/ pCAMBIA1300以不同浓度比进行共转化,以此研究
农杆菌不同菌株搭配以及不同浓度比对双载体共转化法的影响。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 供试水稻品种 本试验选用了两个粳稻( Ory z a sativa L. subsp . j ap onica)品种武香粳 9号和广陵
香粳,以上水稻品种种植于本校水稻育种实验农场。
1. 1. 2 菌株及双元载体 菌株: 根癌农杆菌 ( A grobacter ium tumef aciens )菌株 EHA105、LBA4404 和
AGL-1由澳大利亚 Jeffer son教授提供。
双元载体: 转化用的双元载体有 2 种, pCAMBIA1300 (其 T-DNA 区只含潮霉素基因) 和 pCAM-
BIA0301(该载体 T-DNA 区只含 GUS 报告基因) ,其 T-DNA区结构见图 1。
图 1 同于共转化的两个质粒载体 T-DNA区结构
A 为质粒 pCAMBIA1300, B为质粒 pCAMBIA0301
1. 2 培养基
1. 2. 1 本实验所用的细菌培养基有 YEB[ 5]和
AB[ 6]。
1. 2. 2本实验所用的水稻组织培养培养基见表
1。
1. 3 水稻愈伤组织的诱导及培养[ 7, 8]
取开花后 12~ 15d的水稻未成熟种子经
70%乙醇表面消毒 2min 后, 于 2% (活性氯含
量)的 NaClO 溶液中消毒 90min以上, 并不时
摇动,用无菌水冲洗 4~ 5次, 然后用解剖刀和镊子剥出幼胚并于培养基上诱导愈伤组织,经一段时间预培养
后诱导出的愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。
1. 4 根癌农杆菌的培养及其介导的水稻转化
1. 4. 1 根癌农杆菌的培养 将在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含 50mg/ L 卡那霉素( Kanamycin, Km)
的YEB半固体培养基上活化后,挑取单菌落接种到3ml含50mg / L Km 的YEB液体培养基中,于 28 e 振摇
培养过夜; 第 2d按 1%接种量转接入 40ml含 50mg/ L Km 的 AB液体培养基中, 于 28 e 、250r pm 继续培养
56 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
6~ 8hr(培养至生长对数期)。分别于 Amer sham 核酸分析仪上测定菌液浓度, 在波长 600nm 处测得 OD值
均为 0. 8时,将两种菌液分别按 1B2、1B 1和 2B 1的体积比相混合并离心, 收集菌体并重悬于适量的 AAM
液体培养基中, 立即用于与水稻受体材料的共培养转化。
表 1 本实验所用的水稻组织培养培养基
培养基名称 组分及含量
愈伤组织诱导及继代培养用培养基
N 6D2 N 6( Chu , 1978)盐分和维生素, 0. 5g/ L 酪蛋白水解物, 30g/ L 蔗糖, 2mg/ L2, 4-D, 2. 5g/ L Phytagel, pH5. 8
CCD 2 CC盐分和维生素, 0. 5g/ L 酪蛋白水解物, 20g/ L 蔗糖, 36. 43g/ L 甘露醇, 2mg/ L2, 4-D, 2. 5g/ L Phytagel, pH5. 8
抗性愈伤组织筛选培养用培养基
CCD 2S 1 CCD2 , 25mg/ L 潮霉素 B, 400mg/ L 头孢霉素
CCD 2S 2 CCD2 , 50mg/ L 潮霉素 B, 200mg/ L 头孢霉素
水稻受体材料与农杆菌共培养用培养基
AAM
AA ( T oriyama 和 H inata, 1985) 盐分和氨基酸,
MS ( M urashige 和 Skoog, 1962) 维生素, 0. 5g/ L 酪蛋白水解物,
36g/ L 葡萄糖, 68. 5g/ L 蔗糖, 100~ 400Lmol/ L 乙酰丁香酮, pH5. 2
N 6D 2C N 6D 2, 10g/ L 葡萄糖, 100~ 400Lmol/ L 乙酰丁香酮, pH 5. 2
抗性愈伤组织分化用培养基
MSR
MS ( M urashige 和 Skoog, 1962) 盐分和维生素, 0. 3g/ L 酪蛋白水解物,
30g/ L 蔗糖, 2m g/ L 6-BA, 0. 2mg/ L NAA, 0. 2m g/ L 玉米素( Zeat in) , 0. 5mg/ L KT,
2. 5g/ L Phytagel, pH 5. 8, 50mg/ L 潮霉素 B, 200m g/ L 头孢霉素
1. 4. 2 水稻受体材料的浸染及其与根癌农杆菌的共培养 在直径 6cm 的培养皿中将各种适宜的水稻受体
材料浸没在新鲜的 AAM 农杆菌菌液中 15~ 30 m in,间或摇动几次。然后将水稻材料移出,在无菌滤纸上吸
去过多的菌液, 随即转移到 N 6D2 C共培养培养基上,于 26~ 28 e 黑暗条件下共培养 3d。
1. 4. 3 抗性愈伤组织的筛选及植株再生 水稻受体材料与农杆菌共培养后, 切去胚芽并转入选择培养基
CCD2 S1上进行选择培养。10~ 14d后长出的新鲜愈伤组织再转移到 CCD2 S2选择培养基上继续筛选 2代
( 10~ 14d/代) ,然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上分化小苗( 12h光照/ d)。
1. 5 转基因水稻植株中 GUS 活性的组织化学染色分析
按 Jefferson( 1987) [ 9] 的方法, 将待测水稻组织样品浸没于 X-Gluc 染色反应液( K 4 [ Fe( CN) 6 ] , 0. 5
mmo l/ L ; K 3 [ Fe( CN ) 6 ] , 0. 5mmol/ L ; 50mmol/ L N aH 2 PO 4 , pH7. 0; 0. 1% T riton X-100; 20%甲醇; 0. 5mg/
ml X- Gluc)中,在 37 e 保温过夜后进行观察。叶片等绿色组织用 95%乙醇脱色后观察。
1. 6 水稻转化频率的计算
1. 6. 1 瞬间表达率 不同的水稻转化受体材料与农杆菌共培养 3d后,用无菌滤纸吸干吸附于愈伤组织表
面的农杆菌直接用于检测 GU S基因的瞬间表达(检测方法见 1. 5) ,并计算瞬间表达率,公式如下:
瞬间表达率 = 有 GUS基因瞬间表达的愈伤组织数与农杆菌共培养的愈伤组织总数 @ 100%
1. 6. 2 稳定共转化率 I 稳定共转化率 I用于计算不同菌株、浓度配比下抗性愈伤组织中含目的基因的频
率。不同的水稻转化受体材料与农杆菌共培养 3d后,在含潮霉素的选择培养基上经 3 代筛选培养, 统计产
生潮霉素抗性的愈伤组织数, 取部分抗性愈伤组织进行 GU S组织化学染色,计算稳定共转化率 I:
稳定共转化率 I = 有 GU S基因瞬间表达的愈伤组织数经三轮选择培养后抗潮霉素的愈伤组织总数 @ 100%
1. 6. 3 稳定共转化率Ⅱ 上述抗性愈伤组织经分化培养后,对已分化出的小苗进行目的基因的 PCR鉴定,
572005年第 5期 陆美芳等:农杆菌介导的水稻双载体共转化法中部分影响因素的研究
计算稳定共转化率Ⅱ:
稳定共转化率 II = 含目的基因的独立转化株系数所有分化出的独立转化株系总数 @ 100%
1. 7 转基因水稻植株总 DNA的 PCR分析
1. 7. 1 水稻植株叶片总 DNA 的提取 取 3cm 长左右的幼嫩水稻叶片, 按 Mur ray 和 T hompson的 CTAB
法[ 10]小量提取总 DNA,用于 PCR分析。
1. 7. 2 PCR扩增 GUS基因编码区片段的 PCR扩增。用于 PCR扩增的 5c和 3c端引物分别为 gusP1( 5c-
GGG AT C CAT CGC AGC GT A A TG-3c)与 gusP2 ( 5c-GCC GAC AGC AGC AGT T T C AT C-3c) ,可从
GU S基因编码区扩增出563bp的 DNA 片段。PCR反应条件为: 94 e , 5min; 94 e , 30sec, 60 e , 45sec, 72 e ,
1min, 30个循环; 72 e , 10m in。
2 结果和分析
为研究不同水稻品种或亲本间在组织培养性能方面的差异, 本试验室曾在以前的试验中研究并比较了
不同愈伤组织诱导培养基及愈伤组织诱导培养时间等因素对农杆菌介导转化不同基因型水稻的影响,以此
建立了根癌农杆菌介导的高效遗传转化体系 [ 11] ,该体系同样适用于本实验的共转化研究。由于在共转化实
验中涉及两个双元载体的同时导入,因而如将两个双元载体分别导入根癌农杆菌的不同菌株,再将不同菌株
以各种浓度配比分别导入待转化材料, 可以得到根癌农杆菌不同菌株、浓度配比对共转化效率的影响。
2. 1 不同菌株搭配对双载体共转化效率的影响
2. 1. 1 对 GUS 瞬间表达的影响 以武香粳 9号和广陵香粳未成熟胚为起始培养材料,在 N 6D2愈伤组织诱
导培养基上诱导愈伤组织,选取经 6d培养的初生愈伤组织,分别与 3 对不同的农杆菌菌株组合(表 2)在浓
度比均为 1B 1的情况下进行共侵染,在培养基 N 6D2 C上共培养 3d后即进行 GUS 组织化学染色,在部分共
培养后的愈伤组织上可看到明显的蓝色(图 2-A) ,据此统计 GUS瞬间表达率,其结果列于表 2中。
表 2 不同农杆菌菌株搭配对共培养后愈伤组织中 GUS瞬间表达率的影响
不同农杆菌菌株搭配 品种 共培养愈伤组织数( A) GU S+ 愈伤组织数* ( B) GUS瞬间表达率( B/ A)
EHA105/ pCAM BIA1300
:
EHA105/ pCAM BIA0301
武香粳 9号
广陵香粳
合计
30
43
73
16
20
36
56. 7%
46. 5%
49. 3%
EHA105/ pCAM BIA1300
:
LBA4404/ pCAMBIA0301
武香粳 9号
广陵香粳
合计
38
35
73
14
15
29
36. 8%
42. 9%
39. 7%
EHA105/ pCAM BIA1300
:
AGL-1/ pCAM BIA0301
武香粳 9号
广陵香粳
合计
42
34
76
20
15
35
47. 6%
44. 1%
46. 1%
注 X : GUS + 指染色后呈现蓝色的愈伤组织
由表 2中数据可看出,在用 EHA105/ pCAMBIA1300与含 pCAMBIA0301载体的不同菌株组配的情况
下, 不同组合间 GU S 瞬间表达率有一定的差异, 且在两个粳稻品种中有类似的趋势。EHA105/ pCAM-
BIA1300 BEHA105/ pCAMBIA 0301 菌株搭配的 GUS 瞬间表达率最高, 两个品种中分别为 56. 7% 和
46. 5%, EHA105/ pCAMBIA1300 B AGL-1/ pCAMBIA0301 搭配的 GU S 瞬间表达率其次, EHA105/
pCAMBIA1300B LBA4404/ pCAMBIA0301 搭配的最低。但 2 个品种也有一定的差别, 当以 EHA105/
58 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
pCAMBIA1300 B EHA105/ pCAMBIA0301 菌株搭配或以 EHA105/ pCAMBIA1300 B AGL-1/ pCAM-
BIA0301菌株搭配时武香粳 9 号中的 GUS 瞬间表达率高于广陵香粳, 而以 EHA105/ pCAMBIA1300 B
LBA4404/ pCAMBIA0301搭配时广陵香粳中的 GU S 瞬间表达率高于武香粳 9号。本试验还发现, 菌株
EH A105 及 AGL-1的单菌落呈光滑型米白色,但 AGL-1的致密度较小而呈米汤状,菌株 LBA4404的单菌
落呈皱褶型,在根癌农杆菌的培养过程中,在挑取单菌落接种到 3ml含 50mg / L Km 的 YEB液体培养基中
后,菌株 EHA105 及 AGL-1于 28 e 振摇培养 10~ 12h即可达到理想的浓度,而菌株 LBA4404需培养 20~
24h才可达到理想的浓度。
图 2 经双载体共转化的愈伤组织及其再生小苗叶片中的 GUS活性
A. 左边为染色后呈现蓝色的愈伤组织,右边为未呈现蓝色的愈伤组织
B. 为染色后呈现蓝色的叶片(示共转化后含 GUS目的基因的转基因系)
2. 1. 2 对稳定共转化效率的影响 将上述 2. 1. 1中经与不同组合的农杆菌共培养后的幼胚初生愈伤组织
转入含25mg / L 潮霉素的筛选培养基 CCD2 S1进行选择培养,产生的抗性愈伤组织继续转入新鲜的含50mg/
L 潮霉素的筛选培养基 CCD 2S2上再进行二轮筛选培养。经 3次筛选以后, 取部分抗性愈伤组织进行 GU S
组织化学染色, 在部分抗性愈伤组织中可看到明显的蓝色,说明在这些抗性愈伤组织中同时有 GUS 基因的
整合与表达。据此, 统计获得共转化率 I,结果列于表 3中。在武香粳 9号中以 EHA105/ pCAMBIA1300B
EH A105/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 I 最高, 为 9. 7% , 而在广陵香粳中以 EHA105/ pCAM-
BIA1300 B AGL-1/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 I最高, 为 12. 1%,就两个品种上的平均表现而言,
以 EHA 105/ pCAMBIA1300B EHA105/ pCAMBIA0301 菌株搭配和以 EHA105/ pCAMBIA1300B AGL-
1/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 I 均为 10. 5% , 没有差异。而以 EHA105/ pCAMBIA1300 B
LBA4404/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 I仅为 2. 8%。
经过三轮筛选的其余愈伤组织继续转至含 50mg/ L 潮霉素的 MSR 分化培养基上, 统计分化出的独立
转化株系总数。从每个独立转化系(由于从同一愈伤组织上往往不止分化出一个单株,所以将由同一块愈伤
组织上分化出的所有植株称为一个独立转化系)随机取一个单株上的叶片用于 GU S组织化学染色, 在部分
植株叶片中确实可检测到有 GUS 基因的表达(图 2-B) ,显示在这些抗性植株中也已共整合了 GUS 基因。
据此,得到共转化率 II,结果列于表 4中。由表中数据可知,在武香粳 9号中以 EHA 105/ pCAMBIA1300B
EH A105/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 II最高, 为 7. 7% ,而在广陵香粳中仍然以 EHA105/ pCAM-
BIA1300BAGL-1/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 II最高, 为 6. 1%。综合在两个品种上的表现来讲,
以 EHA105/ pCAMBIA1300 B EHA 105/ pCAMBIA0301 菌株搭配的共转化率 II 最高, 为 6. 9% , 以
592005年第 5期 陆美芳等:农杆菌介导的水稻双载体共转化法中部分影响因素的研究
EH A105/ pCAMBIA1300BAGL-1/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 II其次,为 6. 3%, 而以 EHA105/
pCAMBIA1300BLBA4404/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率 II最低,为 4. 2%。
表 3 不同农杆菌菌株搭配对共转化效率的影响
不同农杆菌菌株搭配 品种
3轮筛选后
用于染色
的抗性愈
伤总数 C
GUS + 愈
伤组织
数 D
共转化率
Ⅰ( D/ C)
分化后
分化出的
独立转化
株系数 E
GU S阳性
独立转化
株系数 F
共转化率
Ⅱ( F/ E)
EHA105/ pCAM BIA1300
:
EHA105/ pCAM BIA0301
武香粳 9号
广陵香粳
合计
31 3 9. 7%
45 5 11. 1%
76 8 10. 5%
26 2 7. 7%
17 1 5. 9%
43 3 6. 9%
EHA105/ pCAM BIA1300
:
LBA4404/ pCAMBIA0301
武香粳 9号
广陵香粳
合计
77
32
109
2
1
3
2. 6%
3. 1%
2. 8%
6
18
24
0
1
1
0%
5. 6%
4. 2%
EHA105/ pCAM BIA1300
:
AGL-1/ pCAM BIA0301
武香粳 9号
广陵香粳
合计
24
33
57
2
4
6
8. 3%
12. 1%
10. 5%
15
33
48
1
2
3
6. 6%
6. 1%
6. 3%
2. 2 农杆菌不同配比浓度对双载体共转化效率的影响
根据 2. 1. 2的结果, 在所用共转化菌种浓度比均为 1 B1的情况下,以同一菌株 EHA105分别携带不同
载体即 pCAMBIA1300和 pCAMBIA0301时的共转化效率最高,因此在研究用于共转化的两种菌株不同浓
度配比对共转化效率的影响时,采用了这一组合进行。
2. 2. 1 对 GUS瞬间表达的影响 以粳稻品种武香粳9号及广陵香粳未成熟胚来源的初生愈伤组织为转化
受体,以农杆菌 EHA105/ pCAMBIA1300和 EHA105/ pCAMBIA 0301在浓度比分别为 1 B 2、1B 1和 2 B1
的 3种配比下对幼胚初生愈伤组织进行共侵染,在 N 6D2C 培养基上共培养 3天后即进行 GUS 组织化学染
色以检测 GUS 瞬间表达率,其结果列于表 4中。从 GU S瞬间表达结果可看出,武香粳 9号在浓度比为 1B
2和 1B1时的 GU S瞬间表达率比较接近,分别为 57. 1%和 56. 7%, 在浓度比为 2 B 1时较低为 18. 8% ;广
陵香粳中以浓度比为 1B2时的 GU S瞬间表达率最高, 为 64. 4% ,浓度比为 1B 1时的 GU S瞬间表达率为
46. 5%,浓度比为 2B 1时为 28. 3%。因此综合两个品种而言,浓度比为 1 B 2时 GU S瞬间表达率最高,达
到 62. 4%,而在浓度比为 2B1时最低,仅为 23. 1%。究其原因, 可能与菌液中 EHA105/ pCAMBIA0301的
浓度有关,在浓度比为 1B2时其浓度高于 1B 1和 2B1。
2. 2. 2 对稳定共转化效率的影响 将上述 2. 2. 1中经与不同浓度配比的农杆菌共培养后的初生愈伤组织
在分别含有 25mg/ L、50mg/ L、50mg/ L 潮霉素的筛选培养基 CCD 2上进行 3轮选择培养。在 3次筛选以后
以及分化成苗后,分别取部分抗性愈伤组织或分化出的小苗叶片进行 GUS 组织化学染色, 统计共转化率,
结果见表 5。由表 5可以看出, 在粳稻品种武香粳 9号和广陵香粳中,当以菌株EHA105/ pCAMBIA1300和
EH A105/ pCAMBIA0301搭配时在浓度比为 1B 2时,两种水稻品种的共转化率 I和共转化率 II 均为最高,
浓度比为 1B 1时其次,而浓度比为 2 B1时共转化率较低。
2. 3 共转化植株的 PCR分析
为检测由抗性愈伤组织上分化的植株是否确是转基因水稻,从以上部分 T 0代独立转化系中各选择 1~
2个单株,从叶片提取小量总 DNA,以 gusP1和 gusP2为引物进行 PCR分析。在用于分析的各独立转基因
株系中,部分单株的总DNA中可以特异地扩增出 563bp大小的目的片段,与阳性对照(质粒pCAMBIA0301
60 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
的 PCR扩增产物)完全相同,而绝大多数的单株中未扩增出目的片段,在未转化植株总 DNA 中也没有扩增
出目的 DNA 片段(如图 3) ,这一结果与小苗的叶片 GU S 组织化学染色结果基本一致。说明在部分潮霉素
抗性转化植株中,确实也整合了 GU S基因,为共转化系。
表 4 农杆菌 EHA105/ pCAMBIA1300 和 EHA105/ pCAMBIA0301 不同浓度比
对共培养后愈伤组织 GUS瞬间表达率的影响
不同浓度比 品种 共培养愈伤组织数( A) GU S+ 愈伤组织数 X ( B) GUS瞬间表达率( B/ A)
武香粳 9号 28 16 57. 1%
1B 2 广陵香粳 73 47 64. 4%
合计 101 63 62. 4%
武香粳 9号 30 16 56. 7%
1B 1 广陵香粳 43 20 46. 5%合计 73 36 49. 3%
武香粳 9号 64 12 18. 8%
2B 1 广陵香粳 53 15 28. 3%合计 117 27 23. 1%
注* : GUS + 指染色后呈现蓝色的愈伤组织
表 5 农杆菌 EHA105/ pCAMBIA1300 和 EHA105/ pCAMBIA0301不同浓度比对稳定共转化率的影响
不同浓度比 品种
第 3轮筛选后
用于染色
的抗性愈
伤数 C
GUS + 愈伤
组织数 D
共转化率 I
( D/ C )
分化率
分化出的
独立转化
株系数 E
GU S阳性
独立转化
株系数 F
共转化率 II
( F/ E)
武香粳 9号 52 12 23. 1% 42 5 11. 9%
1B 2 广陵香粳 13 2 15. 4% 14 2 14. 3%
合计 65 14 21. 5% 56 7 12. 5%
武香粳 9号 31 3 9. 7% 26 2 7. 7%
1B 1 广陵香粳 45 5 11. 1% 17 1 5. 9%合计 76 8 10. 5% 43 3 6. 9%
武香粳 9号 43 2 4. 7% 0 0 0. 0%
2B 1 广陵香粳 30 0 0. 0% 22 1 4. 5%合计 73 2 2. 7% 22 1 4. 5%
图 3 部分 T0 代抗性转基因植株总 DNA的 PCR分析
注:以 gusP1 和 gusP2 为引物进行 PCR分析
1. 1Kb DNA ladder plus 2. 质粒 pCAMBIA0301
3. 未转化对照植株总 DNA
4~ 10.部分共转化植株总 DNA,其中 4和 10为 GU S阳性植株
3 讨论
分别将含有不同基因的两个或多个载体通
过共转化法导入受体植物的研究已有很多报
道[ 12~ 16]。通过这种共转化法,一方面可用于培育
可剔除抗性选择标记的转基因植株,另一方面也
可一次性将多个基因导入同一受体细胞中。但
目前已有的报道大都只侧重于介绍共转化的实
际结果,而对共转化过程中可能对转化效率产生
影响的各种因素分析较少。本文将用于共转化
的两个载体分别导入 3 种不同的农杆菌菌株中,
再以不同菌株组合及其不同浓度配比分别感染
两个水稻品种,以共培养 3d后的 GU S瞬间表达
612005年第 5期 陆美芳等:农杆菌介导的水稻双载体共转化法中部分影响因素的研究
以及共转化率为依据,研究了以不同农杆菌菌株搭配以及不同浓度比对共转化效率的影响。从本试验结果
可以看出, ( 1)这两个粳稻品种均以携带不同载体的同一农杆菌菌株 EHA105感染时共转化效率较高。这
可能是因为菌株 EHA105对水稻的转化能力要强于另两种菌株所致。为此,我们在随后的双载体共转化实
验中主要以EHA105为主。以 EHA105/ pCAMBIA1300BAGL-1/ pCAMBIA0301菌株搭配的共转化率也
较高, 说明这两种菌株搭配也是一个很好的组合。而以菌株 EHA105/ pCAMBIA1300和 LBA4404/ pCAM-
BIA0301搭配的共转化效率比较低, 这种情况可能是因为菌株 EHA105 和 AGL-1各方面特性比较接近,而
LBA4404与前二者相差较大引起的。在以 EHA105/ pCAMBIA 1300B EHA105/ pCAMBIA0301菌株搭配
共转化水稻时, 两个品种均以含 HPT 基因和 GU S基因的载体浓度比为 1 B 2时共转化效率最高, 1 B 1时
(在已有报道中,一般都采用 1B 1这一浓度比 [ 3, 17, 18] )其次, 2 B1时最低。说明浓度比对共转化效率起很重
要的作用,含目的基因载体的菌株浓度越高, 共转化效率也越高, 但含目的基因载体的菌株浓度高到什么程
度时共转化效率不再升高,还有待于做进一步的研究。
参 考 文 献
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