全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2011 年
第 50 卷第 19 期
2011年 10 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.19
Oct．，2011
收稿日期：2011－03－23
基金项目：遵义市科技局资助项目【2010】16 号
作者简介：王淑芳（1980－），女，山西临汾人，讲师，硕士，主要从事植物基因工程和分子生物学研究，（电话）13984261767
（电子信箱）wangsf525＠163．com。
粘毛黄芩（Scutellaria viscidula Bunge．）是唇形
科（Labiatae）黄芩属（Scutellaria）多年生草本植物［1，2］，
其药用成分主要分布于根部。 药理上已证实其中的
主要成分黄芩苷和黄芩苷元有抑菌、清热、降压、镇
静、利尿、利胆、抗炎、解毒及抑制 HIV 病毒逆转录
酶活性等作用［3］。随着对植物代谢网络认识的加深，
应用基因工程技术对植物次生代谢途径进行遗传
改良已取得了可喜的进展。 本研究用携带植物高效
表达载体 pCAMBIA1304＋（携带一个潮霉素抗性基
因 hygr）“解除武装（Disarmed）”的重组 C58C1 工程
菌感染粘毛黄芩无菌苗的不同外植体诱导出毛状
根， 建立粘毛黄芩毛状根的高效外源基因表达系
统，以期为其次生代谢产物黄酮类化合物的生物合
成关键酶基因导入，并实现产业化大量生产奠定基
础。
1 材料与方法
1．1 菌株及植物材料
重组 C58C1 工程菌由西南大学廖志华教授惠
赠，C58C1 本来是根癌农杆菌，经“解除武装”改造
后，保留 Helper 质粒，导入发根质粒 pRiA4，改造后
的 C58C1 失去使植物长冠瘿组织的能力，成为发根
农杆菌。 粘毛黄芩种子购买于山西省绛县远博农副
产品公司。
粘毛黄芩毛状根外源基因表达系统的建立
王淑芳 1，李凤华 1，孙 敏 2
（1．遵义师范学院生物系，贵州 遵义 563002；2．西南大学生命科学学院，重庆 400715）
摘要：用携带植物高效表达载体 pCAMBIA1304＋和发根型质粒 pRiA4，“解除武装”的重组 C58C1 工程菌
感染粘毛黄芩（Scutellaria viscidula Bunge.）无菌苗的幼茎、子叶、叶片，诱导毛状根的表达，以建立基于粘
毛黄芩毛状根的高效外源基因表达系统。幼茎毛状根诱导率最高，达 88．9％。PCR 扩增检测粘毛黄芩毛状
根单克隆基因组中的 rolC 和 hygr 基因片段， 结果表明，pRiA4 和 pCAMBIA1304＋均能整合到粘毛黄芩毛
状根的基因组内，共转化率达 28．1％。
关键词：粘毛黄芩（Scutellaria viscidula Bunge.）；毛状根；共转化
中图分类号：S567．23＋9 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2011）19－4070-03
Establishment of Exogenous Gene Expression System based on Scutellaria viscidula
Hairy Roots
WANG Shu－fang1，LI Feng－hua1，SUN Min2
（1． Biology Department， Zunyi Normal College， Zunyi 563002， Guizhou， China；
2．School of Life Sciences， Southwest China University， Chongqing 400715， China）
Abstract： The disarmed Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 harboring plasmid pRiA4 and plant expressing vector
pCAMBIA1304＋ was used to infect the young stem， cotyledons and leaves of Scutellaria viscidula Bunge． to establish a high
efficiency exogenous gene expression system． The inducing frequency of hairy roots from stems explants was the highest，
which reached up to 88．9％． Transformation of the two plasmids was confirmed by the amplification of rolC and hygr genes
from the hairy roots of S． viscidula． The result showed that both the two genes could be integrated into hairy roots of S． vis-
cidula， with a co－transformation rate of 28．1％．
Key words： Scutellaria viscidula Bunge.； hairy roots； co－transformation
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2011.19.041
第 19 期
1．2 方法
1．2．1 农杆菌的活化 取保存的工程菌 C58C1 菌
种，划线接种于 YEB 固体培养基上（50 mg ／ L Kan＋
40 mg ／ L Rif），28 ℃培养， 固体培养基上活化 2 次。
挑取单菌落， 接种于 YEB 液体培养基 （50 mg ／ L
Kan＋40 mg ／ L Rif）中，28 ℃、150 r ／ min 培养过夜，当
OD600 nm＝0．6 时进行第 4次活化， 在 OD600 nm＝0．3 时加
100 μmol ／ L 乙酰丁香酮 （AS）， 继续振荡培养至
OD600 nm＝0．5，室温下 4 000 r ／ min离心 10 min，弃上清
液， 菌体用等体积 MS＋100 μmol ／ L AS 液体培养基
悬浮培养，28 ℃、150 r ／ min继续活化 30 min，可用于
侵染。
1．2．2 粘毛黄芩无菌苗的获得 选取饱满种子用
自来水浸泡 8 h，然后流水冲洗 5 h，体积分数 75％
的乙醇浸泡 30 s，无菌水冲洗 3 次，质量分数 0．1％
的 HgCl2浸泡 12 min，无菌水洗涤 5 次，接种于 MS
固体培养基上，25 ℃连续暗培养。 7 d 后，种子陆续
萌发。
1．2．3 毛状根的诱导 分别切取 4～5 d 苗的子叶、
14～15 d 苗的幼茎和叶片置于 MS 无激素固体培养
基上进行 1 d 的预培养。 将上述外植体在活化好的
C58C1菌液中侵染 15 min，取出并吸干多余菌液，放
在 MS＋100 μmol ／ L AS 固体培养基上， 共培养 2～3
d，直到外植体周围出现明显菌斑，用吸水纸吸干外
植体上菌斑，转接于固体除菌培养基（MS＋500 mg ／ L
Cef）上，于 25 ℃暗培养除菌并诱导毛状根，20 d 后
统计毛状根诱导率。 对照组不用发根农杆菌菌液浸
染， 直接放在 MS＋100 μmol ／ L AS 固体培养基上培
养 2～3 d后转接于固体除菌培养基上。
1．2．4 毛状根的继代培养及潮霉素（Hygr）抗性筛选
除菌培养约 10 d 后，毛状根陆续从外植体的伤口边
缘长出。 待毛状根长约 5 cm时剪下，接种到固体除
菌培养基上，每 21 d 继代一次，继代 3 次，完全除菌
后，转到无抗生素的 MS 固体培养基上培养 1 周，直
至毛状根完全除菌后，再将单克隆毛状根转入筛选
培养基 （MS＋25 mg ／ L Hygr） 中进行 16 d的抗性筛
选，筛选完成后取每个毛状根单克隆少量用于 PCR
检测。
1．2．5 毛状根的 PCR 检测 毛状根 DNA 提取参照
文献［4］，质粒提取参照文献［5］。 rolC（626 bp）的引
物序列为 F：5′ －CTCCTGACATCAAACTCGTC－3′ ，
R：5′－TGCTTCGAGTTATGGGTACA－3′ ； 反应条件
为：94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，55℃退火 40 s，
72 ℃延伸 1 min，34 个循环；72 ℃延伸 7 min。 hygr
（812 bp）引物序列为 F：5′－CGATTTGTGTACGCCCG
ACAGTC－3′，R：5′－CGATGTAGGAGGGCGTGGATA
TG－3′［5］；反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性
45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72 ℃
延伸 8 min。 PCR 扩增产物采用 1．0％琼脂糖凝胶
（GoldView 染色）进行电泳检测（120 V，100 mA，25
min），电泳结束后在凝胶成像系统下观察分析（UV，
260 nm）并拍照。
2 结果与分析
2．1 粘毛黄芩毛状根的诱导结果
未感染农杆菌的粘毛黄芩外植体在固体除菌
培养基上连续培养 1 月后无生根现象，大部分叶片
及子叶逐渐褐化坏死，部分幼茎在切口处产生淡黄
色疏松愈伤组织。而感染工程菌 C58C1的外植体培
养 1 周后， 从其切口处产生少量淡黄色的愈伤组
织，2～3 d 后愈伤组织上诱导出被白色短根毛的毛
状根；也有少数直接从切口处产生毛状根（图 1－A、
B、C）。 外植体的类型影响发根农杆菌的感染效率，
在子叶、幼茎、叶片三种外植体中，幼茎的诱导效率
最高；其次是子叶；叶片易褐化死亡，诱导效率最低
（表 1）。
2．2 粘毛黄芩毛状根的继代培养及 Hygr 抗性筛选
结果
将长约 5 cm 的毛状根切下置于固体除菌培养
基，进行除菌培养，直至农杆菌彻底除去。 毛状根可
在无外源激素的培养基上自主生长，并且较多分枝
和根毛（图 1－D），共获得 32个单克隆发根系。 然后
将单克隆发根系转入筛选培养基中进行 16 d 的抗
性筛选，16 d 后单克隆毛状根生长情况发生分化：9
个单克隆发根系分支较多、 生长旺盛；23 个单克隆
发根系生长缓慢、逐渐褐化坏死。
2．3 粘毛黄芩毛状根的 PCR检测
从 32 个单克隆发根系中各取少量毛状根进行
PCR检测，32个单克隆全部含 rolC片段。 生长旺盛
的 9个单克隆含 hygr片段（图 2），褐化死亡的 23个
单克隆无 hygr 片段。 说明 Hygr 抗性的获得是由
pCAMBIA1304＋质粒携带的 hygr 基因在毛状根中表
达的结果 ， 生长旺盛的 9 个单克隆是 pCAMBI-
A1304＋与 pRiA4 质粒共转化形成的毛状根， 具有
Hygr抗性， 而 pCAMBIA1304＋质粒未转入的毛状根
表 1 工程菌 C58C1 对子叶、幼茎、叶片外植体感染的结果
外植体类型
幼茎
子叶
叶片
外植体数
个
45
45
50
被转化外植体数
个
40
32
7
转化率
%
88.9
71.1
14.0
出根时间
d
10
13
15
王淑芳等：粘毛黄芩毛状根外源基因表达系统的建立 4071
湖 北 农 业 科 学 2011 年
A．从子叶伤口处诱导出的毛状根；B．从幼茎伤口处诱导出的毛状根；C．从叶片伤口处诱导出的毛状根；
D．粘毛黄芩毛状根单克隆。
图 1 诱导出的粘毛黄芩毛状根
单克隆不具 Hygr抗性，因此生长缓慢、逐渐褐化。在
32 个单克隆中，pCAMBIA1304＋质粒与 pRiA4 质粒
的共转化率达 28．1％。
3 讨论
粘毛黄芩的幼茎及子叶大部分毛状根是在切
口形成淡黄色的愈伤组织后产生，而叶片外植体不
经愈伤组织阶段， 直接从其切口部分产生根原基，
发育成毛状根。这与 Ri质粒转化商陆叶柄后不经过
愈伤组织阶段，直接从其切口产生毛状根的方式不
同［6］。 马铃薯叶片外植体和块茎切块被发根农杆菌
感染后则直接产生毛状根，但其茎段外植体则从形
成的愈伤组织上长出毛状根［7］。可见，发根农杆菌浸
染植物细胞后，毛状根的形态发生方式可因植物种
类和感染部位等不同而有所差异。
rol 家族的基因是发根农杆菌 Ri 质粒上与毛状
根形成密切相关的基因［8］，只要检测到上述 rol 家族
的基因，就可以确定被检测的单克隆根系是真正的
毛状根。同时 C58C1工程菌携带的植物高效表达载
体 pCAMBIA1304＋上面携带一个粘毛黄芩中没有的
hygr基因，因此，如果在毛状根单克隆中同时检测到
rolC 和 hygr 两个基因 ， 就能证明其是 pRiA4 和
pCAMBIA1304＋共转化的发根单克隆。本研究建立的
基于粘毛黄芩毛状根的遗传转化体系，共转化率达
到 28．1％， 且 pCAMBIA1304＋可用于在毛状根中同
时表达多个目的基因，包括粘毛黄芩黄酮类化合物
生物合成途径中的关键酶基因，为实现其代谢工程
提供了一个技术平台。
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pCAMBIA1304＋；T1－T5．毛状根单克隆
图 2 粘毛黄芩毛状根 rolC 和 hygr 的 PCR 检测
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
rolC（626 bp）
hygr（812 bp）
M - + T1 T2 T3 T4 T5
（责任编辑 向 闱）
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