全 文 ：第27卷 第1期
2015年1月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 27, No. 1
Jan., 2015
文章编号：1004-0374(2015)01-0020-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2015004
收稿日期：2014-10-22
*通信作者：E-mail: yphuang@sibs.ac.cn
基因组编辑技术在昆虫功能基因组研究中的应用
张忠杰1,2，刘晓静1,2，李木旺1,3，谭安江2，黄勇平2*
(1 江苏科技大学蚕业研究所，镇江 212018；2 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所中国科
学院昆虫发育与进化生物学重点实验室，上海 200032 ；3 中国农业科学院蚕业研究所，镇江 212018)
摘　要：基因组编辑技术是在生物基因组水平上对靶标序列进行定点编辑的一种重要手段。近年来，锌指
核酸酶技术 (ZFNs)、类转录激活因子核酸酶技术 (TALENs)、成簇且规律间隔的短回文重复序列和相关 Cas
蛋白的 DNA核酸内切酶系统 (CRISPR/Cas)等基因组编辑技术的相继问世，为功能基因组的研究提供了有
效的实验手段。这 3种基因组编辑技术的基本工作原理都是通过定点切割基因组 DNA双链，从而诱导内
源性的修复机制产生定点突变。通过介绍这 3种技术的国内外研究现状及发展趋势探讨了基因组编辑技术
在昆虫科学中的应用发展前景。
关键词：昆虫；基因组编辑；ZFNs；TALENs；CRISPR/Cas
中图分类号：Q789；Q819；Q96 文献标志码：A
Genome editing technologies and advances in insects
ZHANG Zhong-Jie1,2, LIU Xiao-Jing1,2, LI Mu-Wang1,3, TAN An-Jiang2, HUANG Yong-Ping2*
(1 Sericultural Research Institute, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China; 2 Key
Laboratory of Insect Developmental and Evolutionary Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai
Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China; 3 Sericultural Research
Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212018, China)
Abstract: Genome editing technology is an important tool to operate site-specific modification at the biological
genomic level. Recently, the advances of zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activitor-like effector nucleases
(TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein (CRISPR/Cas)
system provide the effective methods to gene functional analysis. The basic working principle of these three genome
editing techniques is to generate mutagenesis at targeted sites through making double-strand break and followed by
inducing genome endogenous repair mechanisms. In this review, we describe the development trend of three
genome editing techniques and introduce the applications of these techniques and explore the future development
黄勇平，博士，研究员，中国科学院上海生命科学研究院植物生理生
态研究所课题组长。主要从事昆虫分子遗传学研究。黄勇平研究员及其团
队主要以鳞翅目昆虫为对象，研究该类昆虫的性别决定机理，并以此为理
论基础研究昆虫性别的遗传调控。近年来发表研究论文 120余篇，其中在
SCI期刊发表论文 70余篇。
张忠杰，等：基因组编辑技术在昆虫功能基因组研究中的应用第1期 21
昆虫是自然界中物种最为丰富的生物类群。多
达数百万种的昆虫蕴藏着无数具有重要生理功能和
经济价值的功能基因。随着昆虫基因组信息的不断
丰富和完善，功能基因组研究在昆虫科学中的地位
越发重要，而遗传操作则是功能基因组研究中必不
可少的手段。传统的昆虫遗传操作手段主要采用病
毒转染和基于转座子元件的转基因等方法。病毒转
染的方法有可能将病毒自身的病毒元件携带进入宿
主生物，依靠转座子元件的转基因体系则存在转座
后稳定性以及随机位点插入造成的位置效应等问
题 [1-3]。即便如此，这些方法也仅在少数几种昆虫
中才能得以应用。近年来出现的 ZFNs、TALENs、
CRIPSR/Cas等基因组编辑技术则提供了新的昆虫
遗传操作手段，必将极大地促进昆虫功能基因组研
究的发展。
1　锌指核酸酶技术的应用
锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFNs)是第
一代可编辑的核酸内切酶，它是由非特异性的 Fok
I核酸酶和锌指蛋白串 (zinc finger array, ZF array)融
合而成的人工核酸内切酶 [4]。研究人员可以根据靶
点序列设计特定的锌指蛋白结合结构域，从而结合
靶点序列，由 Fok I核酸酶切割靶点序列使双链断
裂引发基因突变。
2002年，Bibikova等 [5]通过转基因表达 ZFNs
的方法首次在模式昆虫黑腹果蝇 (Drosophila melano-
gaster)中对 ZFNs技术进行了测试，选取果蝇黄体
基因 (Dmyellow)作为靶标基因。Dmyellow是果蝇
体表色素模型中的一个关键基因，该基因突变会导
致果蝇体表黑色素合成减少而呈现为黄色表皮。转
基因果蝇靶点序列以非同源性末端连接 (non-
homologous end joining, NHEJ)的修复方式产生了小
片段的缺失或者插入，50%的转基因个体表现为嵌
合体表型。在随后的果蝇基因组编辑研究中，
Bibikova等 [6]利用针对 Dmyellow基因的转基因表
达 ZFNs品系和产生线性同源配体的品系进行杂交，
靶点序列不仅发生了 NHEJ，同时在靶点序列中也
插入了外源序列。上述方法虽然取得了较好的效果，
但是实验方法复杂耗时。Carroll等 [7]优化实验方案，
通过胚胎注射表达 ZFNs mRNA，同样对靶基因进
行了敲除，并且发现同时注射表达 ZFN mRNA和
环形的同源配体质粒可以在靶点进行同源重组，插
入外源片段。2013年，Beumer等 [8]对 ZFNs技术
的应用做了进一步的挖掘，DNA连接酶 IV突变体
果蝇中 ZFNs所诱导的同源重组的概率得以提高，
配体部分同源片段的缺失或者单碱基突变同样可以
发生同源重组，单链的寡聚核苷酸链亦可用作配体。
家蚕 (Bombyx mori)不仅具有重要的经济价值，
同时也是鳞翅目的代表性模式昆虫。经过不懈的努
力，ZFNs技术也被运用于家蚕的基因功能分析。
家蚕幼虫表皮中尿酸颗粒的缺失会导致表皮出现透
明现象，称为油蚕。Takasu等 [9]选取家蚕尿酸代谢
通路中合成表皮尿酸颗粒所必需的 BmBLOS2和
Bmwh3这两个基因为靶基因，分别胚胎注射针对这
两个基因的 ZFNs mRNA，当代 (Generation 0, G0)
均产生嵌合体油蚕表型。由于 BmBLOS2基因位于
Z染色体上，研究人员认为 G0代雌性油蚕的比例
应高于雄性油蚕，但是实验数据显示两者之间的比
例并无显著的差异，这表明 ZFNs对于诱导单等位
基因和双等位基因之间并无明显差异。2013年，
Wefers等 [10]以黑脉金斑蝶 (Danaus plexippus)为实
验材料，选取 Dpcry2基因作为靶标基因，胚胎注
射表达 ZFNs mRNA，突变遗传率达到 50%。在不
完全变态昆虫的基因组编辑方面中，Watanabe等 [11]
首次应用ZFNs技术在双斑蟋蟀 (Gryllus bimaculatus)
中敲除 Gblac2基因，证明该系统在不完全变态昆
虫中同样起作用。
2　类转录激活因子核酸酶技术的应用
类转录激活因子核酸酶 (transcription activator-
like effector nucleases, TALENs)是第二代可编辑的
核酸内切酶，由非特异性的 Fok I核酸酶和 TALE
蛋白组成 [12]。与 ZFNs技术不同，ZFNs技术中的
每个 ZF单体以三联碱基的方式结合 DNA双链，这
种方式对结合位点的选择有着一定的局限性；而
TALENs技术中 TALE单体以单碱基的方式结合
DNA，这种结合方式在理论上可以对基因组上的任
意位点进行编辑。TALENs技术采用 DNA结合结
构域模块化的构建方法，简单易行，其迅速取代
ZFNs技术，成为了主流的基因组编辑方法。
自 2010年 TALENs技术问世以来，全世界多
个研究团队分别在斑马鱼 (Danio rerio)、小鼠 (Mus
prospect of insects’ genes functional analysis.
Key words: insect; genome editing; ZFNs; TALENs; CRISPR/Cas
生命科学 第27卷22
musculus)、黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)等
模式生物中验证了TALENs的特异性切割活性 [13-15]。
在昆虫基因组编辑研究中，Liu等 [16]首次在果蝇中
通过胚胎注射编码 TALENs mRNA的方法敲除了
Dmyellow基因，获得了嵌合体果蝇，并在 G1代获
得了稳定遗传的突变品系，但是其采取传统的酶切
连接的方法组装 TALENs单元模块，这种方法过于
繁琐。2013年，Sakuma等 [15]和 Katsuyama等 [17]均
采用 Golden gate方法组装 TALENs单元模块，这
种方法可以在一天内完成所有 TALENs单元模块的
组装，相比传统的酶切连接构建方法效率更高。
Katsuyama等 [17]在 TALENs元件组装完成后胚胎注
射 TALENs表达载体，成功敲除了果蝇 Dmyellow
基因。TALENs表达载体胚胎注射的成功进一步减
少了 TALENs mRNA体外转录这一步骤。在进一步
的实验中，研究人员通过注射 TALENs表达载体和
同源重组配体质粒，以同源重组的方式在靶点敲入
标记基因，标记基因整合效率高达 10.5%。因为多
数基因敲除后并无明显的表型，外源标记基因的整
合可以解决突变个体的筛选难题。2014年，Yu等 [18]
应用 TALENs系统，以 DNA连接酶 IV突变体果蝇
为材料获得以下进展：一方面，构建 miR-281敲除
的 TALENs，选取 miR-281基因座左右两侧各 1.3
kb和 1.9 kb的序列作为左右两翼同源臂，克隆连接
至 pBSK质粒，同时注射同源配体质粒和 TALENs
mRNA，G0代 miR-281缺失率为 4.5%，G1代同源
重组率为 0.8%，实现了靶基因的精确删除；另一
方面，设计 chameau基因的 TALENs，以 TALENs
靶点两侧 1.0 kb和 2.3 kb序列为左右两翼同源臂 (以
一个 Sma I限制性酶切位点序列替换左侧同源臂中
的 13 bp碱基 )，克隆连接至 pBSK质粒，G0代同
源臂替换率为 5.8%，G1代同源重组率为 1.4%。这
说明在果蝇 DNA连接酶 IV突变的遗传背景下可以
提高 TALENs技术所诱导的外源基因插入。
随着 TALENs技术在果蝇中的广泛验证及应
用，多个研究团队在一些非模式昆虫中同样得到了
验证。在家蚕中，Wang等 [19]和 Sajwan等 [20]均以
BmBLOS2基因为靶点基因，但采用了不同的 TALENs
结构进行验证。Wang等 [20]所构建的 TALENs的
TALE蛋白两侧无残余序列，而 Sajwan等 [20]所构
建的 TALENs的 TALE蛋白在 N端和 C端分别含
有 287和 232个氨基酸残基序列。对比这两种不同
结构的 TALENs所诱导的嵌合体突变以及遗传转
化，TALE蛋白两侧无残余序列的 TALENs结构效
率更高。2013年，Takasu等 [21]为了进一步提高TALENs
在家蚕中的敲除效率，对 TALENs表达质粒进行了
优化处理。其采用Wang等 [20]构建的 TALENs模
式结构，根据家蚕的密码子偏好性对 TALENs的 N
端、C端以及 Fok I结构域的密码子进行优化，并
在 5非编码区域添加了科扎克共有序列 (KOZAK)
以及来源于家蚕肌动蛋白基因 5非编码区域的 60
bp序列。除此之外，在 3非编码区域添加了 SV40
及 poly(A) 结构，以 BmBLOS2 作为靶基因，用
TALENs间隔区域为 15 bp的 TALENs mRNA进行
胚胎注射，在 G0代获得 82%~100%的嵌合体油蚕，
而 G1代遗传转化效率为 10.7%~50%。这一实验结
果表明，TALENs技术在家蚕基因组编辑应用中具
有很高的敲除效率。鉴于这种极高的突变效率，研
究人员同样可以对未知表型的基因进行敲除研究，
通过基因组检测确认靶基因敲除。Watanabe等 [22]
在双斑蟋蟀中应用 TALENs技术敲除 Gblac2基因，
在 G0代获得 17%的嵌合体，遗传转化率同样是
17%，并采用 SURVEYOR核酸酶快速检测基因组
的突变，这一检测方法可以快速地在分子水平上检
测靶点的突变。埃及伊蚊 (Aedes aegypti)作为一种
登革热媒介昆虫，危害人类的身体安全，而对其基
因的功能研究一直缺乏有效的方法。TALENs技术
在埃及伊蚊中的成功应用将加速埃及伊蚊的基因功
能研究 [23]。
3　CRISPR/Cas技术的应用
CRISPR/Cas技术是目前应用最广泛的基因
组编辑技术，已运用于各种模式生物的基因组编
辑 [24]。CRISPR/Cas系统是细菌以及古细菌中的一
种适应性免疫机制，主要用于抵抗病毒和外源的
DNA的入侵 [25]。天然存在的 CRISPR/Cas系统由
CRISPR序列元件和 Cas基因家族组成。CRISPR
序列元件转录生成 crRNA和 tracrRNA，与 Cas基
因家族编码的核酸内切酶形成一个复合体，crRNA
和 tracrRNA在此过程中融合成为 sgRNA，引导
Cas蛋白对靶点进行切割 [26]。
在昆虫基因组编辑研究中，CRISPR/Cas 技
术首先在黑腹果蝇中得到了应用。2013年，Bassett
等 [27]采取 crRNA和 tracrRNA融合的策略，以 T7
启动子启动 sgRNA的转录，选取 Dmyellow基因为
靶基因，胚胎注射 sgRNA和 Cas9 mRNA，在 G0
代获得高达 88%的突变嵌合体，并采用高分辨退
火分析的方法快速精确地检测靶基因的突变。
张忠杰，等：基因组编辑技术在昆虫功能基因组研究中的应用第1期 23
Gratz等 [28]在 Dmyellow基因上选择了两个 CRISPR/
Cas敲除靶点，同时注射针对两个靶点的 sgRNA和
Cas9 mRNA，G0代嵌合体基因组检测发现靶点间
的序列出现了大片段删除。在进一步的实验中，注
射 sgRNA及 Cas9的 mRNA的同时，提供了同源
配体质粒，成功地对目的基因进行了替换。2014年，
Gratz等 [29]对 CRISPR/Cas技术介导的目的基因敲
除后同源重组修饰进行了改进，在左右同源臂的中
间加入一个标记基因，以便于阳性个体的筛选。
Sebo等 [30]用 Vasa启动子建立了一个生殖细胞特异
表达 Cas9的转基因品系，对该品系的胚胎直接注
射表达靶点特异性 sgRNA的质粒，在 G1代获得突
变个体，这种策略只需研究人员注射 sgRNA的表
达载体即可对目的基因进行敲除。Yu等 [18]在CRISPR/
Cas技术介导的基因组双链断裂的基础上，设计一
系列的同源配体质粒，联合 CRIPSR系统对目的基
因进行一系列的精确编辑：(1)基因组片段的精确
删除；(2)基因组 DNA单碱基替换；(3)目的靶点
精确插入 tag，追踪目的基因蛋白表达谱。
我们实验室已经证实 CRISPR/Cas技术同样可
以应用于家蚕的基因组编辑 [31]。我们选取家蚕尿酸
代谢通路中 BmBLOS2基因作为靶基因，根据开放
阅读框序列选取了两个 23 bp的 sgRNA靶点，通过
分别注射两种 sgRNA与 Cas9的 mRNA的混合物，
均获得了 95%左右的嵌合突变体，对突变体敲除
靶点检测证明存在小片段缺失及插入。在进一步的
实验中，我们同时注射两种 sgRNA及 Cas9 mRNA，
同样在 G0代筛选出 95%左右的嵌合突变体，基因
组检测结果显示除了上述两种基因型突变外，还产
生靶点间大片段 (~3.5 kb)缺失的基因型。2014年，
Liu等 [32]测试了 CRISPR/Cas系统多点编辑在家蚕
BmNs细胞系中的应用。在同时编辑两个位点时，
基因组不仅出现了大片段缺失，也出现了倒置的现
象。他们针对6个目的基因选取了10个 sgRNA靶点，
同时转染 10种不同 sgRNA的表达质粒及 Cas9表
达质粒，所有靶点均产生了突变。综上所述，
CRISPR/Cas技术诱导的单点编辑、多点编辑的成
功应用，为以后基因组结构及基因家族敲除等研究
提供了有力的技术支撑。
4　基因组编辑技术的拓展及应用
近几年来，基因组编辑技术的迅猛发展衍生
出了一些以这 3种技术平台为基础的新兴技术，如
转基因 TALENs、转基因 CRISPR、CRISPRi以及
CRISPRa等。这些技术的产生进一步拓展了这 3种
基因组编辑技术的应用范围。
目前，功能基因组研究中仍然存在一些难题。
尽管这 3种基因组编辑技术为研究人员提供了有效
的基因敲除工具，但是某些基因敲除后并无明显的
表型，或会产生敲除致死的现象，转基因 TALENs
以及转基因 CRISPR技术的问世在一定程度上解决
了这一问题。2013年，Andrea等 [33]在埃及伊蚊中
利用转基因的方法建立了两个转基因品系，分别表
达 TALENs的左臂和右臂，通过两个品系的杂交，
在子代获得了 TALENs同时表达的双阳性个体，并
成功敲除了眼着色基因 kmo。2014年，我们实验室
首次在家蚕中应用了转基因 TALENs技术，成功地
敲除了性别决定基因 dsx的雌性特异剪接体 [34]。但
由于目前 TALENs系统在针对不同基因时需要重新
组装 TALENs，费时费力，还需要进一步完善组装
效率。对于转基因 CRISPR/Cas系统，尽管同样需
要两个转基因品系，一个用于表达 Cas9蛋白，另
一个用于表达 sgRNA，但由于 Cas9蛋白是 CRISPR/
Cas系统的通用元件，仅仅需要建立一个针对靶基
因的 sgRNA表达品系，或者直接在 Cas9蛋白表达
品系中转入 sgRNA表达元件，从而使实验过程得
到了简化。Kondo等 [35]建立了两个转基因果蝇品系，
一个是生殖细胞特异启动子 Nos驱动的 Cas9表达
品系，另一个是 U6启动子驱动的 sgRNA表达品系，
杂交子一代突变率高达 91.3%。Sebo等 [36]延续了
转基因 CRISPR/Cas系统的思路，仍以果蝇为材料，
采用另一种生殖细胞特异性启动子 Vasa建立了一
个 Vasa-Cas9品系，向 Vasa-Cas9转基因品系胚胎
中注射表达 sgRNA的质粒，G1代可遗传突变率达
71%，这一方法进一步简化了实验过程。
CRISPR/Cas技术发展至今已经不仅可以对基
因组序列进行定点切割，同样可以抑制或激活基因
的表达。Qi等 [37]对 Cas9进行改造，点突变 Cas9
的关键核酸内切酶结构域位点，使得 Cas9丧失核
酸内切酶活性。失活的 Cas9(dead Cas9, dCas9)仍然
可以结合 sgRNA形成靶点识别复合体，从而抑制
靶基因的转录起始及延长。Gilbert等 [38]对 dCas9
做了进一步的改进，将一些不同种类的核染色质修
饰结构域分别与 dCas9融合，在 HEK293细胞中测
试，发现 dCas9-KRAB融合蛋白在 sgRNA的引导
下成功地下调了目的基因的表达。dCas9不仅可以
抑制基因的表达，同样可以与转录激活因子 VP64
或 p65AD融合，利用 sgRNA引导 dCas9激活因子
生命科学 第27卷24
结合在目的基因上游，调控序列招募 RNA聚合酶
上调基因的转录表达。
高通量测序技术问世不仅缩短了全基因测序的
时间，同样也降低了测序的成本。至今已有约 2万
个物种的全基因组测序完成。怎样对如此海量的信
息进行处理成为后基因组时代的一大难题。全基因
组功能缺失筛选可以让研究人员鉴定出对某种表型
起重要作用的一个基因家族。CRISPR/Cas系统基
因组编辑的高效性使得研究人员可以对全基因组实
施无偏倚的敲除筛选。2013年末，两个研究团队利
用慢病毒载体向人类细胞中转染针对所有基因的
sgRNA，同时在细胞中表达 Cas9核酸内切酶，通
过标记筛选证明 CRISPR/Cas系统具备很强的阴性
及阳性筛选能力 [39-40]。
5　展望
ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas系统都是非常
有效的基因组编辑技术。昆虫作为全世界范围内数
量最多的物种，昆虫科学研究不仅要探索生物学的
关键科学问题，同时与国民经济息息相关的益虫利
用和害虫防治也都是昆虫科学面临的重要课题。而
基因组编辑技术，特别是基于 CRISPR/Cas系统的
基因组编辑技术必将对昆虫功能基因组的研究，进
而对昆虫科学研究产生强大的推动力。
[参　考　文　献]
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