全 文 ：病原微生物快速检测方法及研究进展
李维彬1 郭辰虹2 王玉炯1*
( 1宁夏大学 生命科学学院,银川 750021; 2山东大学医学院,济南 250012)
摘 要: 近年来, 随着现代生物技术的快速发展, 人类基因组计划的完成, 尤其是生物化学、分子生物学、免
疫学、生物仪器及计算机理论与技术的进步, 新的诊断技术和方法不断涌现并被广泛应用于微生物检测, 使得疾病
诊断的水平有了很大的提高。根据目前国内外研究的动向,本文对一些常规及新型检测技术的原理、特点及应用
做一综述。
关键词: 病原微生物 快速检测方法
Progress in Research on Detection Method of
Pathogenic Microorganism
Li Weibin
1 Guo Chenhong2 Wang Yujiong1*
( 1 S ch ool of L i f e Sci ence , N ing x ia Unive rsi ty , Yinchu an 750021;
2 School of medicine , S hand ong univ ersi t y , Jinan 250012)
Abstract: In these years, w ith the rapid development of modern biotechno lo gy and the complement of The
Human Genome Project, especially of the advancement o f bio chemistr y, mo lecular bio lo gy , immunity, bioinstru-
mentation and the theor etics and techno log y o f computer , new diagno ses w ere used w idely in t he disease detection.
All of these made the disease diagnose get lar ge improvement. According to the present development trends, the pa-
per w as gived a r eview about the pr inciples, characters, and application of each method.
Key words: Pathogenic micro org anism Rapid detection method
进入 21世纪以来,感染性疾病仍然是危害人类
健康的重大隐患, 尤其是第三世界国家。WHO 宣
布近 30年来, 新发现了 29种新病原体。目前的现
状是造成感染性疾病的微生物种类日益复杂, 常见
病原微生物的威胁不仅没有消除,而且出现了一些
耐药性菌株,如葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、大
肠杆菌等,加之一些新病原体的出现,给临床诊断和
治疗带来了很大的困难。2003年 SARS 引起了全
球性灾难和恐慌,今年又接连发生禽流感爆发、猪链
球菌感染人类和牛炭疽感染人类事件, 出现次数越
来越频繁等严峻的现实给病原微生物的检测和诊断
提出了更高的要求, 同时,对病原菌的明确诊断也是
合理用药的基础。因此, 研究和发展各种病原微生
物的检测技术, 准确、快捷地确认与检测病原体, 对
感染性疾病的治疗和预后有重要意义。
1 应用生化方法对病原微生物进行检测
生化方法检测病原微生物实际上是测定微生物
特异性酶。由于各种微生物所具有的酶系统不完全
相同,对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利
用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生
物内酶的有无, 从而达到检测特定微生物的目的。
如沙门氏菌能产生辛酯酶,这一性能是除沙门氏菌
外的各属肠杆菌科细菌所不具备的。根据这一特
性,甄宏太等 [ 1]报道了快速检测沙门氏菌的辛酯酶
法。该方法是以 4-甲基伞形酮辛酯( MU CA P)为底
物,经沙门氏菌的酶降解后,释放出 4MU,在紫外灯
下观察其发出的蓝色荧光。该方法简便易行,从加
收稿日期: 2005-12-06
作者简介:李维彬( 1981-) ,男,硕士生,研究方向:微生物基因工程, E-mail: l_w b2003@ 163. com
* 通讯作者:王玉炯( 1963- ) , 男,教授,博导 T el: 0951- 2062033, E-m ail: w yj@ nxu. edu. cn
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
入底物到紫外灯下观察到出结果仅需几分钟即可完
成。其灵敏度和特异性分别可达 95% 和 90% [ 2]。
对与 H 2S( + )反应的沙门氏菌该法更为敏感, 灵敏
度和特异性均接近 100% [ 3] 。大肠埃希氏菌具 -葡
萄糖醛酸酶, 但以 O157: H7为代表的肠出血性大
肠埃希氏菌( EHEC)却不具此酶, 故 -葡萄糖醛酸
酶阴性已成为初步筛查 EHEC 的重要特征。白色
念珠菌具脯氨酸肽酶及 N-已酰-D半乳糖苷酶, 分
别以合适的试剂检测,两酶均阳性即为白色念珠菌。
2 血清免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应, 观察
和研究组织细胞、特定抗原(抗体)的定性和定量技
术。为了显示和观察这种抗原抗体反应, 需要预先
将某种标记物结合到抗体上, 借标记物的荧光或酶
的有色反应、放射性或高电子密度,在光镜或电镜下
进行定性、定位或定量研究。各种形式的免疫分析
方法如放射免疫分析( RIA)、酶免疫分析( EIA)、间
接酶联免疫吸附( ELISA )、荧光免疫分析( F IA)、生
物发光免疫分析( BIA )、化学发光免疫分析( CIA )
等,直接检测微生物或通过间接检测微生物的成份
及微生物代谢产物(如毒素)检出微生物。各大文献
数据库提供的数据显示, 几乎建立了所有病原体的
血清学检测方法,表明该方法也成为了一种实验室
常用的成熟的检测技术。
2. 1 荧光抗体技术
荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的
特异性,把荧光素作为抗原标记物,在荧光显微镜下
检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部
位。荧光抗体技术的主要特点是特异性强、速度快、
灵敏度高,但也存在许多的缺点,如非特异染色问题
难以完全解决、操作程序较烦琐、需要特殊的昂贵仪
器(荧光显微镜)和染色标本不能长期保存等。
用于快速检测病原菌的荧光抗体技术主要有直
接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已
知特异性荧光标记的抗血清, 经洗涤后在荧光显微
镜下观察结果。间接法是在检测样品上滴加已知的
细菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标记
的第二抗体。如市场上广泛应用的抗沙门氏菌荧光
抗体和猪瘟荧光抗体。吕治林等[ 4]报道的由美国同
行所作的用炭疽杆菌细胞壁( CW-DFA)和荚膜抗原
( CAP-DFA)特异的荧光标记的单克隆抗体, 可快速
鉴别炭疽杆菌。
2. 2 酶免疫技术
酶联免疫技术是根据抗原- 抗体的免疫反应与
酶的高效催化作用原理有机结合, 通过酶催化底物
进而发生一系列的化学反应,使溶液呈现出颜色变
化,从而显示抗原抗体特异性反应的存在。酶联免
疫技术的应用,大大提高了检测的敏感性和特异性,
现已被广泛地应用于多种病原微生物的检测。应用
单克隆抗体结合硝酸纤维膜上的斑点 ELISA技术,
已成功地自患者的咽拭标本中同时检出可能存在的
肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病
毒和 3、7型腺病毒。涂少华等[ 5] 用 MP 膜结合蛋白
抗原制备 MP 单抗来建立双抗体夹心 ELISA 检测
肺炎支原体抗原方法, 与 PCR 方法的符合率达
95%; Gehring 等 [ 6] 用 酶联 免 疫化 学 发 光法
( ELIMCL)测定大肠杆菌 O157 H7, 在 PBS 缓冲
液中,检测极限约为 7. 6 103个活细胞。许多疾病
的检测都已有商品化的试剂盒出现。如直接自尿中
检出沙眼衣原体的商品试剂盒 IDEIA- 。
3 分子生物学方法
分子生物学及分子遗传学的发展, 使人们对微
生物的认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构
特征,微生物的检测也相应的从生化、免疫方法转向
基因水平的检测。
3. 1 核酸杂交法
最初应用于微生物检测的分子生物学技术是基
因探针方法,它是用带有同位素标记或非同位素标
记的 DNA 或 RNA 片段来检测样本中某一特定微
生物核苷酸的方法。
核酸杂交有原位杂交、打点杂交、斑点杂交、
Sorthern杂交、Norther n 杂交等, 它们共同的特点
是: ( 1)都是应用复性动力学原理; ( 2)都必须有探针
的存在。核酸分子探针又可根据它们的来源和性质
分为 DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针及人工合
成的寡聚核苷酸探针等。该法诊断的原理是通过标
记根据病原体核酸片段制备的探针与病原体核酸片
段杂交, 观察是否产生特异的杂交信号。核酸探针
技术具有特异性好、敏感性高、诊断速度快、操作较
为简便等特点。目前, 已建立了多种病原体的核酸
68 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
杂交检测方法, 尤其是近年来发展起来的荧光原位
杂交技术( FISH )更为常用[ 7, 8]。
3. 2 PCR及其衍生技术
PCR技术又称体外扩增技术, 自 1985年发明
以来,因其高度灵敏性和良好的特异性受到了人们
的高度重视,短短 20年的时间,各种各样以 PCR 为
基础的 DNA 序列的扩增和检测方法得到了迅猛发
展,几乎已应用于基础研究的各个领域,并且成为医
学临床和检验部门强有力的分析工具。各种衍生技
术如反转录 PCR ( RT-PCR)、多重 PCR[ 9]、巢式
PCR
[ 10]、PCR 单链构 象多态 性 ( PCR-SSCP )、
RFLP [ 11]、RA PD 技术、荧光定量 PCR[ 12] 等。其中
定量 PCR既可以用于临床感染性疾病的诊断,又可
用于监测其疗效。而 DNA 测序分析可用于病原菌
的鉴定和亚型的区分, 以及同种病原菌不同菌株的
区分。
3. 3 基于 16S rRNA与 Gya B的检测技术
随着测序技术发展, DNA 大规模测序得以进
行,传统的依据形态学、生物化学特征鉴定细菌的方
法,在某些方面将可以被一种可定量、较精确的以可
翻译核苷酸序列为基础的分析方法所取代。以核苷
酸序列为基础的方法, 要求选择合适的靶基因进行
比较分析。
3. 3. 1 以 16S rRNA 为靶基因进行检测 自
Woese 等于 1987 年首次运用 rRNA 分析以来,
rRNA 数据库快速扩大起来, 其成为研究细菌多样
性、进化、系统发育中被广泛采用的序列。16S
rRNA 存在于所有原核生物细胞中, 它们相对稳定
且有较高的拷贝数(每个细胞几千个拷贝) , 其序列
中含可变区及高度保守区, 因此可设计群、属、种特
异性的探针。现阶段各种常见细菌的 16S rRNA 基
因几乎全部测序完成, 16S rRNA 编码基因的这些
特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列, 逐
渐成为细菌鉴定、分类的 金标准。目前, 16S
rRNA 检测技术已在医学界得到广泛应用, 可以用
现有病原菌标准菌株制作 DGGE(变性梯度凝胶电
泳) 标准 marker, 然后对疑似 病原菌扩增 16S
rRNA 进行 DGGE 分析,这样可以做到快速检测。
3. 3. 2 以 Gya B 为靶基因进行检测 以 16S
rRNA 为靶标分析研究也存在着一些问题。如序列
联配时必须考虑到 rRNA 二级结构; 各细菌中
rRNA基因拷贝数不同; rRNA 多拷贝的微生物中
不同拷贝具有异质性等, 使得其不能很好地区分密
切相关的菌种。
促旋酶( gy rase) B亚单位基因 GyaB除了具有
16S rRN A所具有的优点外, 其基因进化率高于核
糖体基因,还有 GyaB在近乎全部细菌中呈单拷贝
形式。有研究表明, 基于 GyaB 序列构建的进化图
谱与基于 DNA-DNA 杂交的相一致。因此, GyaB
的分析特别适合于菌株的区别和鉴定。Fukushima
等[ 1 3]以 Gya B基因为靶基因设计基因芯片来检测
分枝杆菌属,实验结果显示此芯片鉴别分枝杆菌达
到种水平,并且能区别密切相关的菌种,如牛分枝杆
菌和结核分枝杆菌, 这对临床治疗具有重要的参考
价值。而采用 16S rRNA 序列数据构建的 DNA 探
针阵列却不能区别密切相关的分枝杆菌菌种[ 14]。
Yamamo to 等[ 15] 的报道与 Fukushima 等的相一致,
说明分析 Gya B 基因序列对于在菌种水平鉴别细
菌是快速而有效的方法。
4 分子生物学与免疫学相结合的方法
4. 1 免疫 PCR
免疫 PCR( immuno po lymerase chain react ion,
IM PCR)是 1992年 Sano 等 [ 16] 建立的一种检测微
量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的
高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起
来,它的基本原理是用一段已知 DNA 分子标记抗
体作为探针,用此探针与待测抗原反应, PCR 扩增
粘附在抗原抗体复合物上的这段 DNA 分子, 电泳
定性,根据特异性 PCR 产物的有无,来判断待测抗
原是否存在。目前,国内外报道的免疫 PCR的敏感
性一般比现行的 ELISA 法高 102~ 105倍[ 17] 。由于
PCR产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合
物的量成正比,因此免疫 PCR还可用于抗原的半定
量试验。
4. 2 PCR-ELISA
PCR-ELISA 法是 PCR与 ELISA 技术结合的
检测方法。其综合了 PCR, 分子杂交, 和 ELISA 3
种技术的优点。主要用于检测样品中的特定基因。
它引入地高辛(或生物素)标记的 dNT P 或引物进
行 PCR扩增, 利用酶标抗地高辛抗体(或酶标记亲
692006年第 2期 李维彬等: 病原微生物快速检测方法及研究进展
和素)进行 ELISA检测,代替了用于常规 PCR产物
检测的电泳方法, 方便快捷,易于处理大量样品, 且
其灵敏度比使用琼脂糖凝胶电泳检测方法高 100
倍,当有适当的标准品时,还可进行定量测定 [ 18]。
5 用生物传感器进行病原微生物的鉴定
生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断
技术相结合而成的一种新技术, 是现代临床诊断发
展的一个新方向。生物传感器包含两部分, 即分子
识别器件和换能器。在待测物、识别器件以及转换
器件之间由一些生物、化学、生化作用或物理作用过
程彼此联系。由于生物传感器检测准确、操作简便
等特点,近年来已经在许多领域取得了很大的进展,
在生物分子相互作用、药物筛选、临床诊断、食物检
测等领域获得了广泛的应用。其中临床中用于病原
体检测的以 DNA 生物传感器最为常见。葛晶等 [ 19]
利用大肠杆菌抗体的免疫吸附反应, 使用集成化
SPR传感器快速检测大肠杆菌 O157: H7,采用亲和
素- 生物素系统放大检测的反应信号,并引入复合抗
体作为二次抗体,使该传感器对大肠杆菌的检测限由
106 cfu/ ml下降到 105 cfu/ ml。Masarova等[ 20] 用凝集
素代替抗体用生物传感器进行细菌鉴定,实验证明该
法在病原菌检测中有很大的优势。华裔科学家陈建
柱最新制成的生物传感器,仅需 20s时间即可检测出
微量 SARS病毒、天花病毒及炭疽杆菌等的存在,从
而达到可早期诊断出 SARS病毒感染者。
尽管生物传感器作为一种新的传感元件近年来
得到了很大的发展, 许多光化学、电化学以及压电晶
体都相继在生物传感器中得到应用。与常规的核酸
和蛋白质检测相比, 具有检测准确、操作简单等特
点,但由于它存在灵敏度不够、容易受杂质干扰等缺
点,随着研究的进一步深化和技术方法的改进,这些
问题将会得到解决。
6 生物芯片
生物芯片技术是将生物大分子, 如寡核苷酸、
cDNA、基因组 DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸
如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质
上形成生物分子点阵, 当待测样品中的生物分子与
生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后, 利用
激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分
析。根据生物芯片上探针的分子种类而将之分为
DNA 芯片(即基因芯片)和蛋白质芯片。微生物检测
基因芯片是指用来检测样品中是否含有微生物目的
核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的
特点,微生物检测基因芯片在微生物病原体检测、种
类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组
监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用。
目前,许多细菌、病毒等病原体的基因组测序已
经完成, 将许多代表各种微生物的特殊基因制成 1
张芯片,经反转录就可检测样本中有无病原体基因
的表达及表达水平,由此判断病人感染病原、感染进
程以及宿主反应等。这样就大大提高了检测效率。
基因芯片诊断病原菌的原理基于细菌的 16S rRNA
基因的高度保守性, 由于 RNA 易于降解,因此多采
用检测 16S。
rRNA 所对应染色体上的 16S rDNA 序列。对
16S rDNA 而言,如果出现 3 个碱基以上的差异就
可以断定细菌不属于同一种属, 因此可用于细菌的
分类和鉴别。对病毒和耐药性病原菌的检测是通过
将待测的特定基因(病毒特异性基因和耐药基因)经
体外转录、PCR、逆转录、末端标记等处理成标记有
荧光分子的核酸分子, 然后与芯片上的探针进行杂
交,用计算机对杂交信号进行处理,依信号和强度即
可得出核酸含量。
目前,生物芯片技术尚未成熟,还存在着诸如技
术成本高、芯片制备较为复杂、样品准备与标记比较
繁琐、信号检测的灵敏度有待提高等许多问题。尽
管如此,它在预防疾病方面开辟了一条新途径。
7 蛋白质指纹图谱技术
蛋白质指纹图谱技术是随着蛋白质组学兴起的
一种新技术,用于各种疾病特异性蛋白指纹的识别
和判断,可以直接检测不经处理的尿液、血液或细胞
裂解液等。人体血清里有成千上万个蛋白,人一旦
发生了某种疾病,蛋白质成分就必然会起变化。中
科院微生物所唐宏研究员等利用蛋白质质谱指纹
图谱最新技术及其检测办法, 可以分析得出 SARS
与非 SARS 病人血清中的蛋白质成分变化。该技
术不是利用单独的蛋白质峰的出现和消失来判断
SARS,而是用 5个蛋白质峰的出现和消失来判断,
好比刑侦破案中甄别 5个手指的指纹,故此称为指
纹图谱。质谱仪通过复杂的计算能够记住 SARS
70 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
病人血清里蛋白质的图谱, 通过对质谱仪的训练
之后,它就能够根据人体血清中的特异变化, 灵敏地
辨别出测试的对象是否感染了 SARS 病毒。这种
检测方法经北京天坛医院临床检测, 阳性率接近
95% ,特异性将近 96%, 能在病人发烧的第一天即
可以得出满意的检测结果。只需要一滴血, 将采集
到的病人血样现场直接放到 9mol 浓度的尿素里,
病毒可以迅速溶解灭活, 这样在一般医院的化验室
里即可实现安全操作, 从而防止交叉感染。有专家
称蛋白质指纹图谱技术标志着一种划时代的诊断模
式的诞生。
8 结论与展望
综上所述, 病原的检测方法多种多样,各种方法
都有其优缺点, 为了弥补各自的不足,进一步提高灵
敏度和特异性, 可以采用多种方法联合使用的策略。
选择检测方法应考虑到自身所拥有的条件, 检测所
要求达到的灵敏度,而提高灵敏度和去除假阳性是
检测方法发展的趋势。
近年来,随着计算机技术的不断发展,临床病原
菌检测将向着高度自动化和开发简便的快速检测技
术两个方向发展。分子生物学技术通过自动化仪器
的使用,将在病原菌诊断、鉴定和耐药基因检测方面
逐步应用于临床。生物芯片技术的发展和应用, 最
终将彻底改变临床病原菌检验的现状和传统观念,
实现高效、高质和廉价的统一。随着各学科的交叉
发展,会出现越来越多的新的检测技术。
参 考 文 献
1 甄宏,杨贵贤,刘中学,等.微生物学报, 1996, 36( 1) : 586~ 592.
2 Aguirre PM, Cach o JB, Folgu eiraL, et al. Clin Microbiol ,
1990, 28( 1) : 148~ 149.
3 Ru iz J, S emp ere MA, VarelaMC, et al. ClinM-i crobil, 1992, 30
( 2) : 525~ 532.
4 吕治林, 闻怡笑. 国外医学流行病学传染病学分册, 2003, 1
( 30) : 58~ 58.
5 涂少华, 叶元康, 沈昭. 检验医学, 2005, 20( 3) : 214~ 216.
6 Geh ring AG, Irw in PL, Reed SA, et al. Immunol Meth ods ,
2004, 10, 293( 12) : 97~ 106.
7 Amann RI, Krumholz L, Stahl DA. Bacteriol , 1990, 172: 176.
8 Mahmoud KK, Ledu c LG, Ferroni GD. Microbiol Meth ods ,
2005, 61( 1) : 33~ 45.
9 Mata AI, Gibello A, Casamayor A, et al. Appl Environ Micro-
biol, 2004 , 70( 5) : 318~ 327.
10 Glukh ov AI, Gordeev SA, Al t shu ler ML, et al. Klinicheskaia
laboratornaia diagnost ika, 2003, 7( 7) : 48~ 50.
12 Boutaga K, van W inkelhof f AJ, Vandenbrouck e- Grauls CM, et
al. Clin Micr ob iol , 2003, 41( 11) : 4950~ 4954.
13 Fukushima M , Kakinum a K, Hayashi H, et al. J Clin microb-i
al , 2003, 41( 6) : 2605~ 2615.
14 Troesch A, Ngu yen H , Miyada CC, et al. Cl in Microbiol ,
1999, 37( 1) : 49~ 55.
15 Yam aoto S, H arayama S. Int J S yst Bacteriol, 1998, 48 ( 3 ) :
813~ 819.
16 Sano T. Science, 1992, 258( 5079) : 120~ 122.
17 Niem eyer CM, Adler M , Wack er R. T rends Biotechn ol , 2005,
23( 4) : 208~ 16.
18 Munch M , Niel sen LP, H andberg KJ, et al. Arch Vir ol , 2001,
146( 1) : 87~ 97.
19 葛晶, 殷涌光, 王凯, 等. 吉林大学学报 (工学版) , 2005, 35
( 2) : 214~ 218.
20 Masarova J, Dey ES, Daniel sson B. J Cl in Microbiol, 2003, 41
( 11) : 4950~ 49544.
(上接第 59页)
10 P K Jadhav, P J Ala, F J Woerner, et al. J Med Ch em, 1997,
40( 2) , 181~ 191.
11 关怡新,潘海学,姚善泾,化工学报, 2005, 56( 6) : 1076~ 1080.
12 H Rogl, K Kosemund, W Kuhlbrandt , I Collins on . FEBS Let-
ters, 1998, 432: 21~ 26.
13 Smith V R, WALKER JE. Protein Ex pr Pu rif, 2003, 29 ( 2) :
209~ 216.
14 Dong XY, Yang H , S un Y. Chromtogr, 2000 878: 197~ 204.
15 Altamirano MM, Garcia C, Pos sani LD, et al. Nat Biotechnol,
1999, 17( 2) : 187.
16 Yoshimoto M , Kub oi R, Yang Q , Miyake J. Chromatogr B,
1998, 712: 59~ 71.
17 Chase HA, Draeger NM. Chromatogr A, 1992 597: 129~ 145.
18 C ho T H, Ahn S J, Lee EK. Bioseparat ion , 2001, 10 ( 4~ 5 ) :
189.
19 ZY Gu, Z G Su , J Ch Janson. C hromatogra A, 2001, 918: 311
~ 318.
20 Schlegl R, Iberer G, Machold C, et al . Chromatogr A, 2003,
1009: 119~ 132 .
21 Liu H S , Chang C K. E nzyme and Microb ial Techn ology,
2003, 33: 424~ 429.
22 Cho TH , et al. Bios eparat ion, 2001, 10 ( 4~ 5) : 189~ 196.
712006年第 2期 李维彬等: 病原微生物快速检测方法及研究进展