全 文 ：第26卷 第3期
2014年3月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 26, No. 3
Mar., 2014
文章编号：1004-0374(2014)03-0248-13
DOI: 10.13376/j.cbls/2014038
高通量测序技术在可选择性多聚腺苷酸化研究中的应用
万　谅1，孙　雨1，付永贵1，徐安龙1,2*
(1 中山大学生命科学学院生物化学系，有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东省药用功能
基因研究重点实验室，广州 510006；2 南海海洋生物技术国家工程技术中心，广州 510000)
摘　要：可选择性多聚腺苷酸化 (alternative polyadenylation, APA)在基因表达调控中起着重要的作用。位于
最后一个外显子的APA可以产生具有不同 3UTR长度的mRNA异构体，在细胞中可影响信使RNA (messager
RNA, mRNA)的稳定性、翻译效率、转运及亚细胞定位等。随着第二代高通量测序技术的发展，研究人员
近年来发展了许多高通量测序文库制备方法，对全基因组 APA进行测序和分析。综述了当前研究全基因组
水平 APA的技术，并且总结了 APA与一系列关键生物现象的关系，包括免疫应答、神经反应、胚胎发育
和肿瘤发生等。随着 APA研究的深入，APA越发成为新的基因转录与翻译调控的研究热点。
关键词：可选择性多聚腺苷酸化；3UTR长度；基因表达调控
中图分类号：Q755 文献标志码：A
Genome-wide alternative polyadenylation in animals:
insights from high-throughput technologies
WAN Liang1, SUN Yu1, FU Yong-Gui1, XU An-Long1, 2*
(1 State Key Laboratory of Biocontrol, Guangdong Province Key Laboratory of Pharmaceutical Functional Genes,
Department of Biochemistry, College of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China;
2 National Engineering Center of South China Sea for Marine Biotechnology, Guangzhou 510000, China)
Abstract: Alternative polyadenylation (APA) plays an important role in gene expression regulation network. APA
located in the last exon can produce mRNA isoforms with 3UTRs of different length, which can impact the mRNA
收稿日期：2014-03-26
基金项目：国家自然科学基金重点项目(30730089)；国家重点基础研究发展计划(“973”项目)(2007CB815800)；中央
高校基本科研业务费专项资金；中国博士后科学基金项目(2012M511618)
*通信作者：E-mail: lssxal@mail.sysu.edu.cn；Tel: 020-39332990
徐安龙，北京中医药大学校长 , 广州中山大学教授、博士导师。
徐安龙的团队主要是通过各种技术和方法，特别是比较与功能基因组
方法，研究人免疫系统的起源与进化，取得了与此研究相关的原创性和系
统性的成果，共获中国发明专利 48项和美国发明专利 1项；以通讯作者
发表的 SCI论文 105篇。关于“外源性细胞凋亡信号通路在脊索动物中的
发现”的文章以封面介绍的论文发表在 Science Signaling (科学信号 )上并
入选 2010 年度中国高等学校十大科技进展。研究工作曾获国家自然科学
奖二等奖 (2012年度 )、教育部提名国家科学技术发明奖一等奖 (2005 年度 )
和广东省科学技术奖一等奖 2 项 (2005 和 2008 年 )。
徐安龙 教授
万　谅，等：高通量测序技术在可选择性多聚腺苷酸化研究中的应用第3期 249
stability, translation efficiency, and subcellular translocation. However, the genome-wide APA events have been
more systematically studied only recently with newly developed high-throughput methods. Here we reviewed the
recent technological development of APA studies in a genome-wide scale. We also summarized the APA studies on
several biological processes in animals including cancerous transformation, immune responses, embryonic
development and neuron activity. With the highly enlarged scope of genome-wide APA analyses, function and
mechanism of APA regulations have been increasingly become a new paradigm for the gene transcription network.
Key words: alternative polyadenylation; 3UTR length; gene expression regulation
基因在转录过程中，可以通过可选择性的转录
起始、剪接以及多聚腺苷酸化 (polyadenylation)，
产生不同的 mRNA异构体，这些异构体对基因表
达网络精确的时空调控具有重要的作用。研究表明，
人类基因组中超过半数的基因拥有多个 APA 位
点 [1]。转录机器可以通过识别不同的多聚腺苷酸化
信号，使基因转录终止于不同的 APA位点。根据
对 mRNA的影响，可以把 APA位点分为以下几类：
APA位点位于基因最后一个外显子上、终止密码子
的下游，可以产生具有不同长度 3非编码区 (3UTR)
的 mRNA转录本 (称为串联 3UTR)；APA位点位
于终止密码子上游，可能导致产生的蛋白质编码和
3UTR序列都不相同 (图 1-A)的 mRNA转录本。
不同长度的串联 3UTR可以导致顺式调控元件的包
含或缺失，这些顺式元件包括 miRNA的结合位点
和 RNA结合蛋白 (RNA binding protein, RBP)的结
合位点 [2-3] (图 1-B)等，从而影响 mRNA的稳定性、
运输和翻译效率。
近十多年来，约有数十个基因被发现在基因
A：两种类型的多聚腺苷酸化。类型I基因的多个PolyA位点均处于最后一个外显子上，可以形成编码相同蛋白质但具有不
同3UTR序列的mRNA；类型II基因的多个PolyA位点处于不同的外显子或内含子上，可以形成编码不同蛋白质和不同3UTR
序列的mRNA。交叉代表终止密码子，箭头代表多聚腺苷酸化位点(polyadenylation sites)，即切割位点(cleavage sites)。B：
mRNA的基本构造和3UTR上的已知顺式元件。
图1 可选择性多聚腺苷酸化及其作用
转录本 3端形成和调控时使用了不同的 poly(A)位
点 [4]，比如 Cyclin D1[5-6]、Amy-1A[7]和 NF-ATc[8]等。
这些研究都是利用 Northern印迹法来检测单个基因
转录本的末端。从全基因组范围研究 APA最初是
利用生物信息学方法分析表达序列标签 (expressed
sequence tag, EST)数据；随着 cDNA/EST数据的累
积，人们发现人类基因中超过半数、鼠类基因中超
过 30%的基因含有多个 APA位点。然而，采用
Sanger测序法对 cDNA或 EST文库进行测序成本
较高，数据产出量较低，所能提供的信息非常有限，
难以窥探基因在 APA 调控下真实复杂的表达情
况 [9]。随着更具成本效益的基因芯片技术 (如外显
子阵列等 )的使用，APA位点的研究进入了新的阶
段。但是，由于基因芯片需要根据已知的序列定制
芯片，所以只能用来研究已知基因的已知APA位点。
近年来，第二代高通量测序技术迅速发展。基于第
二代测序技术的 RNA-seq可用于研究基因表达、新
型融合基因的检测、可选择性剪接的定量、转录本
起始和终止的鉴别等 [10-15]。然而，RNA-seq的研究
第26卷250 RNA研究的新技术和新方法专题
对象是完整的mRNA转录本，而mRNA 3端在所有
RNA-seq产生的读段中仅占有相当小的比例 [12,16]，
因此，RNA-seq法对于深入研究全基因组水平上的
APA位点有明显不足。近几年来，研究人员开发了
多种基于高通量测序技术的新方法来研究全基因组
水平上的 APA位点，并且用这些方法来研究生物
学过程中的APA位点变化，包括肿瘤发生和转移 [3,17]、
胚胎发育 [18-21]、免疫应答 [2]和神经活性 [22-23]等。
许多优秀的综述 [24-31]描述了 APA的机制，但
是关于全基因组 APA位点的研究方法则鲜少提及，
特别是对比不同的 APA研究策略。在此，我们将
讨论全基因组水平 APA的研究方法及其在生物学
现象中的作用，并探讨 APA调控的未来研究方向。
1　研究APA位点的高通量技术
随着 20世纪末 Sanger测序技术、基因芯片和
第二代测序技术的发展，APA研究进入飞速发展的
组学时代。
1.1　表达序列标签(EST)的Sanger测序法
Gautheret等 [32]最早使用 3EST文库数据来研
究 APA位点。他们将 164 000个 3EST进行聚类，
构建重叠群 (contigs)，将比对进行可视化来查找候
选 polyA位点；随后过滤掉基因内部引物锚定
(internal priming)来鉴别 3EST附近重叠群中的腺
苷酸 (polyA尾 )片段；接着，他们进一步研究了
polyA信号和组织特异的 APA位点 [33-34]；随后，他
们将距彼此 30 nt内的比对的位置合并，再筛掉两
条以下的 EST，以此来定义 polyA位点。虽然因为
数据大小的限制以及参对基因组的缺乏导致结果不
尽完美，但是这些发现仍然提供了一种鉴别不同
APA位点的研究方法。
1.2　基因芯片法
在最后一个外显子上，设计含多条探针的基因
表达芯片，这也是研究串联 APA位点的一种方法。
Affymetrix的 3-IVT表达芯片在距转录本 3末端
600 bp之内的位置设计了 11条探针，而外显子芯
片在每个外显子中仅设计 4条探针。基于 3-IVT芯
片的分析，Flavell等 [23]发现了在大鼠中，神经元
活性依赖基因转向使用近端 APA位点。另外，一
个外显子芯片的分析研究显示，激活的 T淋巴细胞
倾向使用更短的 3UTR[2]。在这些研究中，研究者
首先根据已有的信息来选取具有两个 polyA位点的
基因，接着在基因 3UTR的近端和远端分别设计至
少 2条探针，来分析 APA位点的转换。由于 3-IVT
芯片比外显子芯片使用了更多的探针，其对 APA
的分析可能更为准确，但是它不能用于分析 APA
位点相距超过 600 bp的基因。
1.3　RNA-seq测序法
大规模测序技术的发展几乎改变了生物学研究
的所有领域。RNA-seq技术不仅可以在数据水平上
检测基因表达，还可以检测可选择性剪切和基因
融合。Wang等 [12]和 Pickrell等 [16]使用了 RNA-seq
的方法来研究 APA。他们将 mRNA片段化，使用
随机引物进行逆转录，然后制备成二代测序文库。
其中，带有 polyA尾的读段可以推定是 APA位点。
从得到的 12亿条读段中，Pickrell等 [16]发现了 7
千万条读段含有 polyA，从中他们鉴别出 7 296个
假定的切割位点。但是，这个方法对于少部分假定
切割位点来说是明显无效的。另一个团队发展了一
个贝叶斯模型来检测 APA转换 [12]。这些研究者将
他们的研究限制在只含有两个串联 APA位点的基
因，在这些基因中选取所有能比对到 3UTR上的读
段用于数据分析。
RNA-seq为整个转录组中的 RNA转录本 (包
括 3UTR区域 )的分析提供了一个强有力的工具，
但是它的效率远远没能达到深度分析全基因组范围
内 APA位点的要求。因此，为了达到使用 RNA-
seq直接对 polyA位点测序的目的，人们发展了许
多基于二代测序平台的改进 RNA-seq方法来对
mRNA的 3末端进行精确测序 (图 2)。这些方法的
比较，包括数据产出和可操作性的总结参见表 1。
1.4　PolyA捕获法
PolyA捕获法 (图 2-A)应用 Roche 454测序技
术，最初用于秀丽隐杆线虫 (C. elegans)的 3UTR
研究 [19]。为了构建 454测序文库，需要用逆转录酶
和 DNA聚合酶来合成双链 cDNA。为了解决 454
测序对于 poly(A)所带来的 homopolyer问题，测序
反应需要从 mRNA的 5端开始，因此需要获得合
适大小的片段，从而可以对整个片段测序以获得
APA位点的信息。研究者应用可以识别“GATC”4
碱基的限制性内切酶 DpnII对 cDNA进行消化，随
后在 cDNA两端连接接头并进行聚合酶链式反应
(PCR)扩增，所得到的文库用 454FLX进行测序，
最终得到超过 250万条读段。作为首次发表的研究
APA领域的高通量测序方法，polyA捕获法为研究
秀丽隐杆线虫的“UTR组”提供了丰富的信息。然
而，由于 DpnII酶消化不完全以及识别位点在基因
组上分布不均等问题，该方法存在一定程度的误
万　谅，等：高通量测序技术在可选择性多聚腺苷酸化研究中的应用第3期 251
A：PolyA捕获；B：3P-seq；C：SAPAS；D：3READS。
图2 四种基于第二代测序技术的mRNA 3末端测序法技术路线图
第26卷252 RNA研究的新技术和新方法专题
差 [35-36]。由于 454 FLX系统产生测序读段平均长度
为 400 nt(现在的 454技术已经可以达到 1 000 nt)，
这个方法同样也适用于研究非模式生物的 3UTR。
1.5　3P-Seq测序法
Jan等 [37]发展了一套更为复杂的方法，称为
3P-Seq (图 2-B)，旨在消除内部引物锚定对测序文
库制备的影响。为了消除转录本内部富含 A片段对
polyA引物锚定的影响，他们在合成 cDNA双链前
采用了一系列 RNA操作的方法。首先，将含有
polyA的 RNA与生物素标记的黏末端 3oligo d (T)
引物退火锚合；接着用 RNase T1进行部分消化，
用链霉亲合素 -生物素选择系统捕获合适片段的
polyA末端。polyA尾随后仅用 dTTP进行逆转录，
然后用 RNase H消化从而除去 mRNA的 polyA尾。
在进行胶回收纯化后，连上接头进行 PCR扩增，
制备的文库利用 Illumina的链特异 mRNA-seq进行
测序。最后，测序得到 320万条线虫的 3P标签。
综上，3P-Seq可以在早期处理中有效地消除内部引
物锚定，使有效数据得以增加，这个方法的缺陷在
于早期处理步骤较为繁复。
1.6　SAPAS测序法
Fu等 [17]发展了另一种方法，称为可选择性
polyA位点测序 (sequence of APA site, SAPAS)(图
2-C)。这种方法利用 oligo d (T)锚定引物和 5模板
转换技术进行逆转录反应合成 cDNA一链，引物的
5端连上 454或 Illumina测序接头。为了提高反应
的效率，他们对反应体系进行了改良，加入了海藻
糖和山梨醇等物质以增加逆转录反应的特异性。接
着用 PCR反应扩增 cDNA，并在引物的 polyA序列
中引入突变来避免重复的 A序列对 Illumina测序的
影响，PCR循环数确保双链 cDNA的合成保持在扩
增的指数期。在用 PAGE胶回收进行文库大小选择
后，所得到的片段用 454FLX或 Illumina GA IIx进
行 3端测序 [17]。
随着全基因组 polyA研究的进展，使得数以千
计基因芯片无法检出的含有三个或以上 polyA位点
的基因被发现。但是，由于检出了两个以上 APA
位点，这为不同样品间相同基因 APA转换的检验
和数据显著性分析带来了新的挑战，因为传统检验
方法 (如 Fisher精确检验或卡方检验 )只对两个
polyA位点的分析方法有效。为了克服数据分析上
的困难，Fu等 [17]采取了一种对 APA转换的线性趋
势检验，这种方法不仅计算了读段的数量 (polyA
位点的表达量 )，还同时分析了多种 polyA位点的
选择导致的 3UTR的长度的变化。因此，这种方法
提供了一种无偏差的 3UTR转换数据分析框架。
1.7　3READS测序法
为了消除 APA测序文库制备中内部引物锚定
带来的误差并提高有效读段的比例，Hoque等 [21]
发展了一套全新的不使用 oligo d (T)引物进行逆转
录的方法制备 APA高通量测序文库 (图 2-D)。他
们考虑到基因内部富含 A片段和 3末端 polyA尾
的区别在于 A片段的长度，前者通常不超过 15个，
后者根据物种不同可达几十到上百个。通过使用一
种 CU5T45 oligo (引物 5末端引入 5个尿苷酸 U来
代替胸腺嘧啶 T)和 RNase H的组合，来除去结合
区域小于 15个 A的 mRNA。然后，在捕获的片段
两端连上测序接头，逆转录并扩增得到 Illumina测
序文库。这种方法显著提高了测序所得读段中3UTR
的比例，有效去除了 rRNA、snRNA、snoRNA等 (使
表1 全基因组polyA位点分析的高通量测序方法比较
SAPAS PolyA捕获 3P-Seq 3READS DRS
PolyA捕获 Oligo(dT) Oligo(dT) 夹板接头的生物素引物 U5T45 Oligo包被的磁珠 Poly(dT)-包被的流室
片段化 加热/94℃或片段化
缓冲液/70℃
DpnII RNase T1部分消化 片段化缓冲液/70℃ -
片段化误差 无 有 少量 无 -
测序平台 454/Illumina 454 Illumina Illumina Helicos
测序读长(bp) 400/100 400 100 72 35
错误率 0.05%/1.5% 0.05% 1.5% 0.05% ~4%
IP* 有 有 无 无 极少
操作性 简单 简单 复杂 复杂 简单
分析的物种 人 秀丽隐杆线虫 秀丽隐杆线虫 小鼠 酵母或人
参考文献 [17] [19] [37] [21] [15]
*IP：引物内部锚定(Internal Priming)
万　谅，等：高通量测序技术在可选择性多聚腺苷酸化研究中的应用第3期 253
用 oligo d (T)制备的测序文库中的小 RNA是 CU5T45
oligo的 5.8倍 )。这种方法提供了一个新的 APA测
序文库制备思路，数据分析结果也证明了它可以有
效提高测序读段中 polyA位点的比例，通过减少测
序的总量从而降低成本，但是，这种方法的缺陷仍
然在于早期处理步骤复杂。
1.8　RNA直接测序法
Helicos Bioscience公司开发的第三代高通量测
序技术的 RNA直接测序法 (direct RNA sequencing,
DRS)同样也可以用于直接研究全基因组 polyA位
点。此测序平台使用 poly d (T)包被表面的流动小
室 (flow cell)，polyA+ RNA样品可以直接杂交上去。
这种边合成边测序的测序反应使用了一种改良的
DNA依赖的 DNA聚合酶，这种酶还同时具有逆转
录酶的活性。DRS的测序文库制备不需要逆转录、
连接头及 PCR扩增的步骤，这样就可以避免实验
过程中的人造假性 cDNA的干扰。Ozsolak等 [38]运
用 DRS的方法报导了人类肝脏细胞和酵母细胞全
基因组 polyA位点的综合图谱。DRS方法的优点是
不言而喻的，即不需要 PCR扩增，可以更精确地
定量表达水平。但是，该方法有个明显的缺点，那
就是测序读长过短，仅为 35 nt，测序误差率高达 4%；
另外该仪器商业化率较低，限制了该方法的应用。
2　APA的生物学功能
早在 20世纪 80年代已经有研究报道 APA可
能具有生物学功能 [39-41]。在此，我们总结了这些具
有生物学功能的 APA基因，见表 2。近期，随着上
述全基因组水平 APA研究方法的应用，在不同的
生理和细胞状态中发现了全基因组 3UTR转换的现
象，包括肿瘤发生和转移、动物发育、免疫应答和
神经反应等，揭开了 APA转换在生理学和病理学
中广泛的潜在调控现象的新篇章。
2.1　免疫应答
20多年前，研究者发现了免疫球蛋白 IgM的
重链基因在小鼠 B细胞激活过程中发生了 APA位
点的转换 [39-41]。这种 APA转换使 IgM蛋白从膜结
合形式转变成分泌形式，而该 APA的转换是由细
胞中多聚腺苷酸化切割因子 CstF-64的浓度升高所
引起的 [42]。另外，研究还发现了数百个基因的 3
终止外显子上的 polyA位点在 T细胞激活的过程中
发生了转换 [2]。近端向远端、远端向近端的 APA
转换发生的数量在剪切依赖的 APA现象中并没有
显著区别；但在激活的 T淋巴细胞中，86%的基因
表达相对更多的短的 3UTR形式，引起 T细胞激活
过程中 3UTR的普遍变短的现象。这种现象同样也
发生在其他免疫应答中，包括受到抗 CD40和白介
素 4刺激的人类 B细胞，以及受到脂多糖 (LPS)和
干扰素 -γ刺激的人类单核细胞，表明串联 3UTR
变短的现象与细胞增殖有着较强的相关性。不同
3UTR长度的转录本的使用会影响蛋白质的产
量——3UTR更短的转录本能产生更多的蛋白质，
可能是由于逃避了 miRNA介导的翻译抑制 [2]，以
及由其他调控元件，例如富含 AU元件 (AU rich
elemen, ARE)[43]和富含GU元件 (GU-rich element)[44]
介导的 mRNA的降解。随着 T细胞激活，RNA多
聚腺苷酸化和蛋白质的合成速率加快 [45-46]，APA又
起到了另一层调控作用，即加速了遗传信息按着中
心法则从 DNA流向蛋白质的过程。
2.2　神经活性
APA广泛存在于神经细胞中的调控过程中。
BDNF (brain-derived neurotrophic factor)基因的两种
mRNA的转录本具有完全相同的蛋白质编码序列
(CDS)和长度不相同的 3UTR[47-49]。这两种转录本
的亚细胞定位完全不相同：3UTR较短的转录本只
存在于神经元的胞体中，而 3UTR较长的转录本只
存在于树突中。在缺乏长 3UTR的细胞中，树突棘
头的平均直径较小，尖端树突上也具有更多的树突
棘 [49]。参与神经细胞分化和神经信号转导的
CALM1基因在人和大鼠中都有 APA的现象。在神
经母细胞瘤细胞系 IMR-32 细胞分化过程中，
CALM1基因的长 3UTR转录本表达出现 2倍上调，
短 3UTR转录本表达略微下调 [50]，并且长 3UTR
转录本稳定性更强。在大鼠大脑发育和神经突生长
的过程中，长 3UTR的表达也有所上调。ELAV1
(HuR)基因在人和鼠的脑组织中倾向表达长 3UTR，
而在其他组织中倾向表达短的 3UTR[51]，这个现象
在人和鼠中的保守性说明其在脑组织中的重要作
用。
另外，研究表明 APA在神经活性中具有广泛
的调控作用 [23]。在中央神经系统中，环境刺激可以
激活一系列转录因子 (如MEF2)来调控数百个基因
的表达，这些基因被称为活性依赖性基因 [52]。研究
发现，在这些神经活性依赖性基因中，细胞间的刺
激同样能诱导 APA的转换，从而产生变短的转录
本 [23]。近期研究还发现，转录活性对 APA有着广
泛的影响 [53]，因为神经应答涉及到一系列转录因子
的激活，因此，可以推测 APA对靶基因下游级联
第26卷254 RNA研究的新技术和新方法专题
表2 受到APA功能调控的基因
基因名 全称 3UTR表达特征 参考文献
IgM Immunoglobulin M B细胞激活过程中，通过将远端polyA位点转换到内含子上的近端位
点，IgM蛋白由膜结合型转变为分泌型
[39-41]
FGF-2 Fibroblast growth factor 2 更稳定的转化细胞系偏向使用短的3UTR [77]
PhLP,
PDCL
Phosducin-like protein 长3UTR含有多个ARE元件，并且长3UTR的mRNA转录本半衰期更
长
[78]
AUF1 Adenosine/uridine-rich
element (ARE)-binding protein
3UTR剪切变异体在NMD通路中有着不同稳定性 [79-80]
MeCP2 Methyl-CpG-binding protein 2 长3UTR具有结构域保守性 [81]
HER-2
(Neu)
Human epidermal growth
factor receptor 2
在SKOV-3卵巢癌细胞中，长3UTR的转录本稳定性更强 [82]
CKIAlpha Casein kinases 在HeLa细胞中，长3UTR的转录本降解速率是短3UTR转录本降解
速率的13倍
[83]
Spin Spindlin 在小鼠卵母细胞向胚胎发育过程中调控mRNA的稳定性和翻译 [84]
COX-2 Cyclooxygenase-2 在人类结直肠腺癌细胞系中，短3UTR的转录本逃避了tristetraprolin
蛋白的结合
[85]
CstF-77
(CSTF3)
Cleavage stimulation
factor 77 kDa subunit
发生在内含子上的多聚腺苷酸化产生了蛋白质编码不完全的短的
CstF-77转录本
[86]
CTNNB1 β-catenin 在HeLa细胞中，三种不同3UTR的mRNA转录本具有不同的稳定
性，可能是由不同的ARE调控引起的
[87]
CCND1 Cyclin D1 短3UTR导致蛋白表达上调1.6倍，引起淋巴细胞增殖和存活率下降 [3, 6]
StAR Steroidogenic acute
regulatory protein
在小鼠类固醇生成细胞中，长3UTR转录本的丰度升高，受到cAMP
刺激后降解变快，稳定性比短3UTR转录本差
[88]
HMGA2 High mobility group A2 染色体转位后产生的短3UTR逃避了let-7的翻译抑制，从而促进了
NIH3T3细胞生长
[61-62]
BMP2 Bone morphogenetic protein 2 短3UTR转录本比长3UTR转录本丰度高，在远端polyA位点上游一
个72 nt区域含有两个新型顺式作用元件
[89]
BDNF Brain-derived neurotrophic factor 在神经元本体和轴突中，短3UTR的mRNA和长3UTR的mRNA分布
位置不一样
[49]
ABCG2 ATP-binding cassette
sub-family G member 2
S1MI80细胞偏向使用短的3UTR，导致hsa-miR-519c结合位点的缺
失
[90]
Actb1 β-actin 长3UTR在小鼠神经细胞中表达水平相对较低而翻译效率较高，可
能是受到了mmu-miR-34a/34b-5p的调控
[91]
GluR2 Glutamate receptor 2 该基因在哺乳动物脑组织中含有两种3UTR异构体，长3UTR异构体
会受到翻译抑制，但在病变后会解除翻译抑制
[92]
ELAVL1
(HuR)
Human antigen R 不同的多聚腺苷酸化变异体在受到ARE调控时具有不同的表达丰度 [4]
CCND2 Cyclin D2 短3UTR的mRNA导致更多细胞停留在细胞周期S相 [3]
IMP-1
(IGF2BP1)
Insulin-like growth factor
2 mRNA binding protein 1
短3UTR转录本的表达极大地促进细胞转化，而转化很大部分是由
缺失了let-7的作用靶点而引起的
[3]
DICER1 Dicer 1 转化细胞系更多使用短3UTR的异构体 [3]
IMPA1 Myo-inositol monophosphatase 1 长的3UTR可折叠成发夹环，并可以与RNP相互作用 [93]
PRMT2
(HRMT1L1)
Arginine N-methyltransferase 2
protein
由可选择性多聚腺苷酸化产生的一个保留了内含子的转录本，具有
独特的亚细胞定位
[94]
Pax3 Paired box 3 在肌肉静息干细胞和胚胎发育成肌祖细胞中，短3UTR使mRNA逃
避miR-206的调控
[95]
CALM1 Calmodulin 1 在IMR-32细胞分化中，长3UTR转录本表达出现2倍上调，短3UTR
转录本表达略微下调。长3UTR转录本稳定性更强。在大鼠大脑
发育和神经突生长的过程中，长3UTR的表达也有所上调。
[50]
万　谅，等：高通量测序技术在可选择性多聚腺苷酸化研究中的应用第3期 255
反应的调控是与转录机器紧密相关的。在脑组织中，
FGF2基因具有可选择的翻译起始，产生了不同的
基因转录本，其 IRES (internal ribosome entry site)
元件活性的增强会导致脑中 3UTR变长，这是由于
在最远端 APA位点的上游有两个翻译增强子元件
的作用 [54]。这个现象表明在脑组织中 FGF2的 APA
功能的重要性。
3UTR相对较长的转录本更倾向于在神经组织
中表达，如在大脑和脊髓中 [22,55]，这种倾向的机制
和功能学意义还未研究清楚。以现有的模型来看，
一旦暴露在环境刺激下，神经组织中的正常平衡就
会被打破，转录因子由于受到活性调控发生变化，
从而激活转录起始和 APA转换，导致了 3UTR变
短或蛋白质遭到破坏。3UTR变短能加快蛋白质的
合成的速度以及增加产量 [2-3,53]，而编码区受到破坏
的蛋白质则会改变蛋白质功能，与先前存在的蛋白
质发生冲突从而打破神经元平衡 [2-3,53]。广泛发生在
神经和免疫应答中的 APA现象表明，细胞在受到
胞外刺激后会引起 APA的变化，这是二者共同的
基因调控机制之一。
2.3　胚胎发育
与受到胞外刺激应答后 3UTR变短的情况相
反，通过分析研究大量 EST数据、基因芯片及
SAGE数据后，研究人员在小鼠早期胚胎发育过程
发现了 3UTR普遍变长的现象 [18]。为了验证这个
结果，研究人员进行了小鼠成肌细胞 C2C12分化
成肌小管细胞的体外实验，并从这个细胞分化模型
中观测到了 3UTR变长的现象。另外，报告基因实
验表明，在分化的条件下近端 polyA位点效率变弱，
导致了成肌细胞在分化过程中偏向使用远端 polyA
位点从而使 3UTR变长。这个现象与 T细胞增殖中
3UTR的变短完全相反。近端 polyA位点进行多聚
腺苷酸化的效率变弱，这可能是由于分化过程中前
体 mRNA 3加工效率的广泛下调所引起的。有趣的
是，在果蝇的发育中也发现了相似的 3UTR变长的
趋势 [55]，表明 APA调控在动物胚胎发育中具有保
守性。确实，在果蝇发育过程中一些重要的基因拥
有不同 3UTR长度的 mRNA[56]，因此，3UTR变长
的现象可能在功能上确实具有重要作用，而且在
miRNA介导的调控中的影响也有所差别。
然而，在秀丽隐杆线虫发育过程中并没有发现
3UTR变长的现象。在上述的 polyA捕获法中，
Mangone等 [19]测定了线虫胚胎发育中 APA的变化，
从胚胎发育到成虫一共经历了胚胎期、L1、L2、
dauer、L3、L4、成虫和交配期。他们发现 3UTR
平均长度在整个发育过程中有日益变短的现象，虽
然变短的程度较小。然而，这个结果与小鼠中的结
果并不一致，因为在小鼠出生后的发育过程中并未
发现 3UTR长度的显著变化 [18]。3UTR在线虫胚
胎发育中的动态变化仍需要更好地阐明。
近期，Li等 [20]在斑马鱼胚胎发育过程中发现
了独特的 APA变化模式。首先，在受精卵到合子
期的基因激活过程中 3UTR显著变短；接着，在原
肠胚期 3UTR快速变长，形成了一个独特的“V”
字型动态变化。另外，无脊椎和脊椎动物发育过程
中 APA的变化机制仍然不清楚。
2.4　肿瘤发生
研究人员曾利用 miRNA来对不同肿瘤亚型进
行分类 [57]，并且证明 miRNA的异常表达与肿瘤有
关 [58]。作为 miRNA的直接作用区域，3UTR在初
级肿瘤样本中也表现出不同的特点，体内实验 [59]
和体外实验 [17]均表明 3UTR在肿瘤中会发生普遍
的变短现象。可以通过分析可选择性 3UTR的特点
来判别各种存活率不同的肿瘤亚型，准确率达
74%[59]。变短的 3UTR在功能上可以导致 mRNA
稳定性的显著增强和蛋白质产量的增加 [3]，而在表
型上则表现为促使更多短 3UTR的转录本表达。通
过在 MCF7细胞中表达较短 3UTR或较长 3UTR
的 Cyclin D2转录本，发现表达较短 3UTR的转录
本的细胞停留在了细胞周期的增殖期 (S相 )的比例
显著增加 [3]。此外，在许多肿瘤中过表达的 RNA
结合蛋白 IMP-1，其短 3UTR转录本的表达会引起
更大程度的癌变，而长 3UTR转录本则不会 [3]。这
些结果强有力地证明了 APA在肿瘤发生过程中的
重要作用。
基于对单个基因的研究，人们对肿瘤细胞偏好
使用较短 3UTR的现象提出了两种可能的机制：基
因异常和 APA调控。在套细胞淋巴癌中，Cyclin
D1基因的 mRNA表达水平相当高，同时 mRNA也
相对较短 [60]。Wiestner等 [6]发现了这些 Cyclin D1
基因较短的 mRNA转录本只在 3UTR的长度上有
差异，导致 3UTR上遗传信息的丢失，或因点突变
形成新的 polyA位点，造成了转录本提前切割终止
和多聚腺苷酸化。另一个基因异常的例子是HMGA2
基因，它通过染色体易位来与其他基因“交换”3UTR，
从而丢失 miRNA let-7的结合位点，逃避 let-7介导
的翻译抑制 [61-62]。与之相比，APA调控还可以产生
异常的短 3UTR，这是一种具有相同效应但保持基
第26卷256 RNA研究的新技术和新方法专题
因组完整的表观机制 [3]。
虽然这些假设有一定的研究支持，但是 APA
改变导致肿瘤细胞全基因组 3UTR长度变化的机制
还不是很清楚。惟一清楚的是 3UTR变短的现象与
细胞增殖，特别是 T细胞激活或早期胚胎发育有
关 [2,8]。一项研究发现，高转移性的肿瘤细胞系中
含有更多变长的 3UTR，使这个问题更加错综复
杂 [17]。这些发现提出了一个问题：在肿瘤细胞的生
命周期中，是否存在 APA的动态调控的过程。想
要阐明这个问题还需要更多的 APA与肿瘤发生过
程的研究支持。
3　展望
基于第二代或第三代测序技术的全基因组APA
位点综合分析方法，使我们得以更全面地考察细胞
中的 APA事件。但是，现有的方法仍然存在技术
上的问题。例如，制备测序文库需要有一定总量的
总 RNA或 PolyA+ RNA，而像石蜡保存标本或单
细胞这样 RNA产量比较少的组织或细胞样本则难
以达到要求。所以，非常有必要开发出只需更少量
RNA的制备测序文库的新方法。
3UTR长度的使用差异在不同的细胞中会产生
不同的生物学现象，这些现象同时也与细胞环境紧
密相关。最常见的一种现象是，3UTR更短的mRNA
由于缺失了特定的顺式调控元件，使转录后调控或
翻译后抑制的转录因子无法作用，从而导致 mRNA
稳定性和蛋白质产量的增加。这样的功能结果与上
述多种生理学过程相符合，即 3UTR普遍变短的现
象在免疫系统 [2]、早期胚胎发育 [21]和肿瘤转化 [3]
等过程的细胞增殖中发生。由于细胞增殖是一个需
要大量蛋白质合成的过程 [63]，大范围地使用较短
3UTR能更大程度地加快蛋白质合成的速度。这些
现象说明，大部分基因 3UTR变短是为了上调蛋白
质的表达。近期在小鼠成纤维细胞系 3T3细胞中的
研究 [64]发现，长 3UTR的转录本会导致轻微但显
著的 mRNA稳定性降低，而长 3UTR和短 3UTR
的转录本的 mRNA翻译效率和降解效率相关性非
常高，说明可选择性 3UTR序列的调控作用比起
mRNA其他区域来说相对较小。还有研究表明，在
同样的情况下，不同的基因稳定性千差万别，而在
3UTR序列中仅一个核苷酸的不同就可以影响转录
本的稳定性。与之前的研究发现 3UTR的长度与转
录本稳定性关联很小的结论不同，短的转录本也不
一定更稳定，Gupta等 [65]证明了 RNA-蛋白相互作
用对转录本特异的稳定性的调节起着重要作用，如
PUF3能与特定 3UTR区域结合并削弱转录本稳
定性。
另外，短的 3UTR并不总是能导致蛋白质水
平的升高。Pinto等 [66]发现在Polo基因的mRNA中，
含有较长较完整 3UTR的mRNA比含有较短 3UTR
的 mRNA具有更高的翻译效率。更有趣的是，在
体内实验中，当 Polo蛋白过表达时，转录本倾向
使用短的 3UTR，这样形成了一个负反馈调节，从
而对 Polo基因的表达起到微调的作用 [66]。因此，
APA在基因表达的调控上有了新的作用意义，并且
还可能解释了 3UTR异构体具有组织特异性的原
因 [12,22]。
一些研究人员对调控 APA使用的机制提出一
些可能的假设：APA调控发生在基因转录过程中，
并且受到基因启动子和 RNA 聚合酶复合物的影
响 [67-70]。对这个观点的总结参见另一篇综述 [71]；对
近端或远端的 polyA位点的选择可能是因不同
polyA位点的强度 (弱或强 )而异，如 CstF-64基因
在前体 B细胞中对 polyA位点的选择模式 [72]。在 B
细胞中，高浓度的 CstF-64使细胞倾向选择使用近
端 polyA信号 [72]，因此可能在受到 LPS刺激后，
CstF-64的表达水平上调，导致了细胞中某些基因
使用较短的 3UTR[73]。在大多数信号通路中，转录
因子 (如NF-κB)会受到免疫刺激的影响。有趣的是，
免疫刺激不仅会改变转录的起始，还会影响转录的
终止和多聚腺苷酸化，这样就揭开了免疫信号转导
和 APA调控关系的神秘面纱。但是总的来说，调
控 mRNA 3端加工的复杂信号通路和分子机制，以
及它们在健康和疾病中的作用还不为人所知。
得益于全基因组 APA研究，使 3UTR中许多
新的基序 (motif)得以发现。据推测，有些基序可
以影响 polyA位点的选择。例如，在活跃神经元中
非活性的 PolyA调控位点附近发现的 TTGTTGGG
基序，可以指导活性依赖的特定位点的多聚腺苷酸
化 [23]。同时，一些基因的表观遗传学上的改变，
如小鼠 H13基因的基因印迹和组蛋白修饰导致的染
色质结构改变，也可能与不同 APA位点的使用有
关 [74-76]。但是，这些理论机制的提出有些是基于生
物信息学分析，而有些则只在特定细胞或基因中发
生。因此，全基因组 APA使用模式对基因表达的
作用方式仍然是一个未解之谜。综上，现阶段对真
核细胞 APA调控机制的研究仍处于初级阶段，有
待更多的新发现。
万　谅，等：高通量测序技术在可选择性多聚腺苷酸化研究中的应用第3期 257
[参　考　文　献]
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第26卷260 RNA研究的新技术和新方法专题
徐安龙报告讨论
付向东 ( 加州大学圣地亚哥分校 )
Q：据我所知你的好多朋友都在做类似的研究。
A：我之前请他们来做过报告，并交流过课题进展。
Q：可以考虑 3UTR的缺失或者突变在整个发育上的作用，或者考虑在生殖系统中研究其作用。
A：谢谢您的建议，非常好。我们实验室正在构建载体，准备这方面的研究。现在还没做到对发育的
作用。
江虎军 ( 国家自然科学基金委员会医学学部 )
Q: microRNA的 3UTR既然决定了基因的量，microRNA有什么用，是否多余？
A： 基因的量是由转录决定的。3UTR决定了 microRNA转录后的命运。