全 文 ：第26卷 第3期
2014年3月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 26, No. 3
Mar., 2014
文章编号：1004-0374(2014)03-0228-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2014035
单细胞转录组分析研究进展
文　路*，汤富酬
(北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心，教育部细胞增殖与分化重点实验室，北京 100871)
摘　要：目前常规的转录组分析方法无法揭示单个细胞之间基因表达的异质性，也难以对极少量细胞进行
分析，单细胞转录组分析技术为此提供了有效的研究工具。对单细胞转录组分析技术的历史、发展、策略、
方法和应用进行综述。
关键词：单细胞分析；转录组；异质性；高通量测序
中图分类号： Q786 文献标志码：A
Recent progresses in single-cell transcriptome analysis
WEN Lu*, TANG Fu-Chou
(Ministry of Education Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation, Biodynamic Optical Imaging Center,
College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China)
Abstract: Standard transcriptome analysis approaches are not able to uncover gene expression heterogeneity among
individual cells, nor can they analyze a small number of cells. Single-cell transcriptome analysis approaches provide
powerful tools for these purposes. In this review, we discussed the history, recent progresses, strategies, methods
and applications of single-cell transcriptome analysis.
Key words: single-cell analysis; transcriptome; heterogeneity; high-throughput sequencing
收稿日期：2013-12-10
基金项目：国家自然科学基金项目(31271543)
*通信作者：E-mail: wenlu.wl@gmail.com
细胞的异质性 (heterogeneity)是一个普遍存在
的生物学现象。在多细胞生物个体发育过程中，单
个受精卵细胞通过不断地分裂和分化发育成为具有
不同形态、表型和功能的多种细胞。组织和器官是
多种类型细胞高度有序地组织在一起的复合体，其
中细胞种类和异质性最复杂的器官莫过于哺乳动物
的脑，人脑的神经元数目可达数百亿，或许每个神
经元都有独特的基因表达模式。在疾病发生的情况
下，异常的细胞常常混杂于正常细胞之中。肿瘤已
知是一种具有很强的细胞异质性的疾病，恶性肿瘤
组织往往由多种基因型和表型的肿瘤细胞组成，高
度恶性的细胞可能只占整个肿瘤组织的一小部分。
有趣的是，近年来的研究表明，看起来同质的细胞，
细胞与细胞之间的基因表达也存在异质性。这种
文路 博士
本实验室主要围绕哺乳动物早期胚胎发育、研究胚胎干细胞和上胚层
干细胞的自我更新能力和多能性调控的分子机理，特别是表观遗传学调控
机理，以及相关的原始生殖细胞发育过程中的表观遗传学重编程机理。综
合利用单细胞微 RNA表达谱分析技术、单细胞 RNA-Seq转录组高通量测
序技术、单细胞 DNA甲基化组高通量测序技术、单细胞基因组高通量测
序技术，以及染色体免疫共沉淀 -高通量测序技术、小鼠胚胎显微操作技
术等分析方法，系统、全面、深入地分析多能性干细胞的基因动态表达网
络及其表观遗传学调控机理。
文　路，等：单细胞转录组分析研究进展第3期 229
异质性可能来源于细胞周期的异质性、细胞微环境
的异质性以及基因表达的随机性 (stochastic)特征。
已有证据表明这些异质性都可能对细胞表型产生
功能性的作用，因而已经成为目前研究的一个热
点 [1-10]。
转录组 (transcriptome)广义上是指特定细胞在
某一功能状态下所有转录产物的集合，包括信使
RNA(mRNA)、 核 糖 体 RNA(rRNA)、 转 运 RNA
(tRNA)以及其他各种非编码 RNA(ncRNA)；狭义
上指所有 mRNA的集合。传统的转录组分析需要
数万至数十万个细胞，这种基于群体水平的方法将
大量细胞的基因表达取平均值进行分析，无法揭示
细胞之间基因表达的异质性。另外，当目标细胞数
目非常稀少、很难获得时，例如胚胎早期发育阶段
的细胞和成体干细胞，需要用到单细胞转录组分析
技术。
1　单细胞转录组分析技术的发展
分析单个细胞的转录组首先遇到的问题是极微
量的起始样本量。单个哺乳动物细胞的直径为 10 μm
左右，含有大约 10 pg总 RNA，这使得单细胞转录
组分析非常困难，具有极大的挑战性。Brady等 [11]
于1990年首次描述了一种基于聚合酶链式反应 (PCR)
的单细胞 cDNA扩增方法。几乎同时，Eberwine
等 [12]提出了另一种基于体外转录的线性扩增方法。
随着基因芯片技术的发展，2002年起多篇文章报道
了单细胞转录组的基因芯片分析 [13-16]。虽然基因芯
片使全面分析单细胞转录组成为可能，但是它只能
检测已知基因，而且检测的灵敏度和动态范围均有
限。2009年，Tang等 [17]首次报道单细胞转录组的
深度测序分析 (single cell RNA-Seq, scRNA-Seq)，并
于 2010年再次发表相关研究工作 [18]。RNA-Seq通
过对测得的每条序列进行计数获得特定转录本的精
确表达量，因此是一种数码化的表达谱检测，它能
发现新的转录本和新的剪切体，具有几乎无限的动
态范围 (即能够同时检测丰度非常低和非常高的转
录本 )，能确定转录本的精确序列，这些信息都是
基因芯片技术无法实现的 [19]。Tang等 [17]对小鼠的
单个卵母细胞进行了 scRNA-Seq分析，比基因芯片
多检测到了 5 270个基因以及 1 753个新的剪切体。
近些年来，又涌现出多种用于单细胞 mRNA深度
测序文库的构建方法，包括 STRT-Seq (single-cell
tagged reverse trans cription sequencing)[20]、Smart-
Seq[21]、Cell-Seq (cell expression by linear amplification
and sequencing)[22]和 PMA-Seq (Phi29-mRNA amplification
and sequencing)[23]等，大大拓展了单细胞转录组分
析技术的应用范围。各种分析技术的比较见表 1。
2　单细胞转录组深度测序cDNA文库构建方法
构建 cDNA文库是单细胞转录组分析的关键技
术步骤。典型的哺乳动物细胞包含大约 10 pg总
RNA，其中 mRNA仅有大约 0.1~0.5 pg，而目前深
度测序技术需要纳克级别的 DNA，因此文库构建过
程需要将起始的核酸扩增数十万倍。在文库构建过
程中如何避免核酸丢失和如何均匀扩增 cDNA是构
建单细胞 cDNA文库首要解决的两个关键技术问题。
单细胞 cDNA文库构建方法包括采集细胞和
细胞裂解、mRNA 逆转录成 cDNA、cDNA 扩增
和文库构建四个步骤。采集细胞可以采用口叼管、
激光捕获显微切割、细胞分选和微流控芯片
(microfluidics)等方法。用口叼管手动采集单个细胞
是最直接的方式，虽然这种方式比较费时，但是尤
其适合于极稀有的细胞，例如胚胎早期发育阶段的
细胞 [15,17]。激光捕获显微切割技术需要将组织或细
胞固定在特定的载玻片上，然后在倒置显微镜下利
用激光脉冲分离靶细胞 [24]。荧光激活细胞分选
(FACS)和免疫磁珠细胞分选 (MACS)方法则利用
细胞表面标记蛋白或荧光蛋白获得纯的细胞亚群，
并可将单个细胞直接分选到 96孔板或者 384孔板
的每个样品孔中 [25]。微流控芯片技术可以把单细胞
分离、反转录和 cDNA文库构建等步骤集成到一块
毫米尺度的芯片上并同时分析大量单细胞，极大提
表1　单细胞转录组分析技术
分析技术 扩增方法 检测RNA数目 检测内容 分析细胞数目 文献
scRNA-Seq PCR 全转录组 全长mRNA 数十个 [17-18, 27]
Smart-Seq PCR 全转录组 全长mRNA 数个 [21]
STRT-Seq PCR 全转录组 mRNA 5端 数十个 [20]
Cell-Seq 体外转录 全转录组 mRNA 3端 数十个 [22]
PMA-Seq Phi29聚合酶 全转录组 全长mRNA 数个 [23]
微流控芯片定量PCR PCR 96个mRNA mRNA特定序列 数百千 [26, 33]
第26卷230 RNA研究的新技术和新方法专题
高了单细胞分析的通量和自动化程度 [26]。
为了避免在构建单细胞 cDNA文库过程中的核
酸丢失，从采集细胞之后到 cDNA被扩增之前，所
有反应步骤最好被整合到一个试管中完成，这些反
应的缓冲液是互相兼容的，利用加热灭活前一步反
应的酶 [18]。
目前有三种策略来扩增单细胞 cDNA：(1) PCR
指数扩增；(2)体外转录线性扩增；(3) Phi29聚合
酶扩增。通常来说，单细胞被采集之后，细胞膜在
去污剂的作用下溶解，随后 RNA被释放出来并在
反转录酶的作用下合成第一链 cDNA。目前所有的
单细胞 cDNA文库构建方法都采用 oligo(dT)引物
进行反转录获得第一链 cDNA，这样可以避免
rRNA和 tRNA的干扰，但是无法检测不带 poly(A)
尾的各种 RNA。
第一种扩增策略需要首先在 cDNA的两端加上
锚定序列，然后利用锚定序列进行 PCR扩增。转
录本 3端的锚定序列可以通过 oligo(dT)引物在反
转录的过程中引入。Brady等 [11]采用了一种简单有
效的方法引入转录本 5端的锚定序列：首先用末端
脱氧核糖核酸转移酶在第一链 cDNA的 3末端加上
一连串脱氧腺苷酸 (A)，然后用一条 3端为 oligo(dT)
序列、5端为锚定序列的引物合成第二链。这种方
法的灵敏度非常高，例如 Tang等 [27]改进了该方法
用于 RNA-Seq分析，能够从单个小鼠胚胎干细胞
中检测到 10 800个基因。
最近报道的 STRT-Seq[20]和 Smart-Seq[21]采用
另一种方法引入转录本 5端的锚定序列。这种方法
利用了反转录酶的末端转移酶和模板转换 (template
switch)活性。当到达 mRNA的 5末端时，反转录
酶通过末端转移酶活性可以在第一链 cDNA的 3端
加上数个脱氧胞苷酸 (C)，以一段 3端含有鸟苷酸
残基 (G)及 5端含锚定序列的寡核苷酸与胞苷酸退
火形成模板，反转录酶可以随后转换模板，以该寡
核苷酸为模板继续延伸从而引入转录本 5端的锚定
序列。这种方法的优势在于能够相对富集 mRNA
的 5端序列，但是由于反转录酶的末端转移酶和模
板转换活性不能达到 100%[28]，这种方法的灵敏度
比 scRNA-Seq低。虽然从转录本丰度极高的卵母细
胞中，Smart-Seq检测到的基因数目接近 scRNA-
Seq[21]，但是从较小的单个人类胚胎干细胞中，
scRNA-Seq可以检测到大约 12 000 个基因，而
Smart-Seq只能检测到大约 8 000个基因，说明大量
低丰度的基因被丢失 [29]。
第二种策略利用体外转录反应进行扩增，其方
法是首先用一条结构为 5-T7 RNA聚合酶启动子序
列 - oligo(dT)-3的引物进行反转录并随后合成第二
链 cDNA，这样所合成的第二链 cDNA可以作为 T7
RNA聚合酶的模板用于体外转录 [13,22]。体外转录扩
增的优势在于线性扩增，能够减少 PCR指数扩增
所造成的偏差，但是缺点在于扩增效率远低于 PCR
扩增，需要进行三轮体外扩增，且扩增的片段较短。
最近报道的 Cell-Seq改进了这一策略，它改用一条
结构为 5-T7 RNA聚合酶启动子序列 -Illumina 5接
头序列 -编码序列 - oligo(dT)-3的引物，并在完成
第二链 cDNA合成后，将数十个样本样品混合，共
同进行体外转录反应，所扩增的 RNA随后被片段
化并加上 Illumnia 3端接头序列，最后利用接头序
列进行 PCR扩增完成建库。Cell-Seq只需要进行一
轮体外扩增，而且能够同步分析多个单细胞 [22]。
第三种扩增策略是利用了 Phi29聚合酶进行扩
增。Phi29聚合酶是一种从 Bacillus subtilis噬菌体
phi29中克隆出的 DNA聚合酶，具有链置换和很强
的连续合成特性，被广泛用于单细胞基因组扩增 [30]。
Kang等 [31]和 Pan等 [23]利用该酶分别成功地扩增
了单个细菌和单个哺乳动物细胞的转录组。二者的
方法均在反转录之后将第一链 cDNA环化，然后利
用 Phi29聚合酶进行连续的滚环扩增。利用这种策
略，Pan等 [23]可以从单个 K562细胞中检测到大约
5 000个转录本。
3　高通量的单细胞分析
在很多情况下，需要同时分析大量单细胞才能
对细胞群体有全面认识。因此，如何提高分析通量
是单细胞转录组分析的另一个技术问题。深度测序
技术为解决这个问题提供了一种独特而有效的策
略：条码法 (barcoding)，即对每个单细胞的转录组
加上一段条码序列，随后将它们混合在一个试管中
进行建库和测序，通过辨别条码序列将属于不同单
细胞的测序数据区分开。条码法将数十到数百个单
细胞建库操作简化至一个操作，明显地提高了效率。
STRT-Seq和 Cell-Seq均采用了这种策略，所不同
是 STRT-Seq利用模板转换将条码序列加在转录本
的 5端，而 Cell-Seq通过 oligo(dT)引物和体外转
录将条码序列加在转录本的 3端 [20,22]。
高通量单细胞基因表达分析的另一个值得一提
的方法是基于微流控芯片的高通量单细胞定量 PCR
分析平台。斯坦福大学的 Quake实验室于 2003年
文　路，等：单细胞转录组分析研究进展第3期 231
首次报道了应用微流控技术在纳升级的反应体系中
进行基因表达分析的方法 [32]。随后，Spurgeon等 [33]
报道了 48.48的基因表达分析芯片，能够同步进行
两千多个定量 PCR反应，可针对 48个单细胞的 48
个基因同时进行分析。2011年，White等 [26]报道
的分析平台更将自动化细胞采集、裂解、反转录和
定量 PCR反应全部整合到一张微流控芯片中。基
于微流控芯片的单细胞定量 PCR分析平台目前虽
然只能够分析数十个基因的表达，但其高通量和高
自动化的特征具有独特的优势。
4　单细胞转录组分析技术的应用
以下将通过三个例子来说明单细胞转录组分析
技术的应用，这些例子展示了如何利用该技术来分
析稀有细胞类型的转录组，以及揭示单个细胞之间
基因表达的异质性。
第一个例子是哺乳动物着床前胚胎的单细胞分
辨率转录组分析。哺乳动物着床前胚胎的细胞数目
相当稀少，人类着床前胚胎的细胞则不仅数目稀少
而且珍贵，因此常规的转录组分析技术难以对其进
行分析。Kurimoto等 [15]通过基因芯片技术首次以
单细胞分辨率在转录组水平分析了 E3.5 d小鼠的内
细胞团，结果显示看起来同质的胚胎细胞已经能够
在转录组水平分为两群细胞，分别具有类似原始内
胚层和类似上胚层细胞的表达谱。Tang等 [27]通过
所建立的 scRNA-Seq技术分析了小鼠的内细胞团，
并跟踪分析了内细胞团转变为体外培养的胚胎干细
胞的过程，发现细胞在转变过程中发生了一系列包
括基础代谢、microRNA和可变剪接在内的转录组
全局改变。他们还发现在细胞转变过程中，抑制性
的表观遗传调控基因表达上调，同时激活性的调控
基因表达下调，这种变化可能参与了小鼠胚胎干细
胞全能性的维持。2013年，Yan等 [29]和 Xue等 [34]
分别报道了人类胚胎从受精卵到着床前的单细胞分
辨率转录组分析，是人类胚胎早期发育阶段转录组
的首次全面描述，为理解人类胚胎早期发育和相关
疾病，以及人类胚胎干细胞全能性的分子机理提供
了有用的信息。
第二个例子是树突状细胞被脂多糖激活的单细
胞转录组分析。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中
的一种成分，能够通过激活树突状细胞的 Toll样受
体引发显著的转录组改变。最近 Shalek等 [35]在单
细胞水平对这一转录激活过程进行了分析。在脂多
糖刺激 4 h后，他们采集了 18个小鼠骨髓来源的树
突状细胞，利用 Smart-Seq构建单细胞 cDNA文库
并随后进行测序分析。尽管脂多糖的转录激活在群
体细胞水平已经被详细研究，但在单细胞水平，他
们发现树突状细胞的反应具有相当高的异质性。许
多已知的炎症反应基因在部分细胞中被强烈激活，
而在部分细胞中仅被低度激活或完全未被激活，呈
现一种双峰模式。他们进一步发现炎症反应的异质
性源于两个方面，一方面是树突状细胞的成熟状态，
另一方面则是基因调控网络的随机性特征。基于后
者，他们鉴定了一个由 137个炎症反应基因组成的
调控模块。另外，他们还意外地发现了大量具有细
胞异质性的可变剪接形式。
第三个例子是对肿瘤组织的高通量单细胞基因
表达分析。传统方法，如免疫组织化学，能够显示
单个或数个基因在肿瘤组织中表达的细胞异质性，
但是难以对单个肿瘤细胞中的更多基因同时进行检
测。最近，Dalerba等 [36]利用微流控芯片高通量单
细胞定量 PCR方法对正常结肠上皮组织和结肠肿
瘤进行了分析。他们通过荧光激活细胞分选 (FACS)
分选出相当于正常结肠隐窝底部的 EpCAMhigh/
CD44+细胞，该群细胞包含了结肠上皮的干细胞。
他们选择了 56个基因进行分析，包括 53个结肠上
皮组织特异表达的基因、3个看家基因和 3个增殖
相关基因。从正常结肠上皮组织中，他们可以从
EpCAMhigh/CD44+细胞群中分辨出 5类细胞亚群。
他们发现，来自肿瘤组织的 EpCAMhigh/CD44+细胞
也能分出类似的细胞亚群。通过将单个 EpCAMhigh/
CD44+细胞接种到裸鼠皮下，他们得到了一个来自
单个细胞的移植瘤，分析显示该移植瘤组织内也包
含着类似的细胞亚群。这些结果表明，至少在部分
肿瘤中，瘤细胞之间基因表达的异质性源自细胞的
多谱系分化过程。他们进一步发现这种与分化过程
相关的基因表达模式与肿瘤的恶性程度有关，并提
出了新的结肠癌分型方法，与现有的分型方法相比
可以更好地预测患者的预后。
5　单细胞转录组研究展望
单细胞转录组分析技术已取得可喜的进展，但
是仍有很大的提升空间，包括检测方法的灵敏度和
精确性，分析内容的广泛性，分析的通量和自动化
程度，以及分析软件的开发等。利用单细胞技术在
转录组水平全面揭示细胞异质性的研究工作目前才
刚刚开始，随着技术的进一步完善，相信单细胞水
平的转录组研究将有可能导致新的细胞分类，发现
第26卷232 RNA研究的新技术和新方法专题
细胞转化过程中新的中间类型，以及全面地揭示单
个细胞在发育过程和对环境应激过程中的各种行为。
[参　考　文　献]
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文　路，等：单细胞转录组分析研究进展第3期 233
汤富酬报告讨论
陈润生(中国科学院生物物理研究所)
Q: 我提一个关于技术的问题。你的报告中提到你在做反转录的时候考虑了 poly(A)尾巴，因为还有很
大一部分的非编码 RNA (noncoding RNA, ncRNA)是没有 poly(A)的，那么你是否所有的反转录都只考虑到
poly(A)？
A: 是这样的，目前采用反转录方法研究的干细胞相关 ncRNA都含有 poly(A)尾巴。不含有 poly(A)尾
巴的 RNA鉴定比较难，因为它们跟 rRNA很难区分开（二者都没有 poly(A)尾巴，最近我们在发展借助于
cDNA文库的方法来发现不含有 poly(A)尾巴的 ncRNA。
鲁 志(清华大学生命科学学院)
Q: 从单细胞中提取 RNA时，去除 rRNA的技术是否成熟？
A: 要除去 rRNA需要 1 μg到 10 μg的总 RNA才能操作，而从单细胞中只能抽提到大约 10 pg总
RNA，不能达到去除 rRNA所需要的量。
付向东(美国加州大学圣地亚哥分校)
Q: 那么从单细胞中提取 RNA时，不用去除 rRNA吗？
A: 如果研究的是含有 poly(A)的 ncRNA，就可以不去除 rRNA。但是如果研究的是不含有 poly(A)的
ncRNA，技术难度就要更大。目前国际上也没有很成熟的方法和系统在单细胞水平上来区分两者，我们也
正在发展此项技术。
鲁 志(清华大学生命科学学院)
Q: 既然你们正在发展此项技术，那么有什么好的方法可以优化呢？
A: 现在我们做的方法是，将总 RNA反转录后测序，根据测序结果来归类，以区别 ncRNA与 rRNA。
Q: 你做的是单细胞的研究，那么就有一个统计上的问题。你在研究中得出一个结论是 ncRNA在胚胎
发育中的差异性很大，那么你是如何统计得出的这个结论呢？你就只做一个细胞吗？
A: 我研究中所有的关于单细胞的数据都是同一种细胞至少做 3个单细胞的 RNA-Seq，然后计算它们
的平均值以反映变化的趋势。
陈润生(中国科学院生物物理研究所)
Q: 有一个更普遍的问题，研究单细胞和多细胞其实各有各的优势。生物体有多种行为，当然这是以
单细胞为基础的，在单细胞水平上研究发现的 RNA或者蛋白质水平的变化很多时候并不表现出整体水平
功能的变化，RNA或者蛋白质水平可能只是生物体内在稳态的起伏。所以如何能找到与生物学功能相关的
变化是一个值得认真考虑的问题。
A: 首先同一胚胎阶段的细胞至少会做 3个单细胞的独立分析，这样可以比较客观地反映此细胞阶段的
RNA或者蛋白质水平，这是横向的平均。在纵向比较不同胚胎阶段的 RNA或者蛋白质水平时，我们会选
择相差最大的作为研究对象。
刘 晓(清华大学生命科学学院)
Q: 我就接着刚刚陈老师的问题，提一个关于发育的问题，发育过程是一种细胞分化成另一种细胞，
也就是两种细胞状态终端的转换，而做单细胞的时候相当于就是某一个中间状态了，所以这个如何反映发
育的变化？
A: 我们在研究的时候，会研究每个胚胎阶段的细胞，从胚胎卵裂中的两细胞、四细胞到八细胞。我们
发现在两细胞时，ncRNA的相关性很高，达 0.99。而到达八细胞时，其相关性就降低至 0.96。这就说明到
达八细胞胚胎阶段这些差异变化的 ncRNA可能与发育相关。
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