全 文 ：第26卷 第3期
2014年3月
Vol. 26, No. 3
Mar., 2014
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2014)03-0207-07
DOI: 10.13376/j.cbls/2014032
收稿日期：2013-10-23
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)
(2010CB835400)
*通信作者：E-mail: yekeqiong@nibs.ac.cn
利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用
周德健1,2，叶克穷1,2*
(1 北京生命科学研究所，北京 102206；2 北京协和医学院研究生院和中国医学科学院，北京 100730)
摘　要： 紫外交联免疫共沉淀 (CLIP)技术能揭示 RNA结合蛋白在体内的 RNA结合位点。将讨论该技术的
基本原理和一些新的发展，这些新发展显著地提高了技术的特异性、灵敏度和应用范围。
关键词：紫外交联；蛋白质 RNA相互作用；深度测序
中图分类号：Q-33　　文献标志码：A
CLIP techniques in studying protein-RNA interactions
ZHOU De-Jian1,2, YE Ke-Qiong1,2*
(1 National Institute of Biological Sciences, Beijing 102206, China; 2 Graduate School of Peking Union Medical College
and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China)
Abstract: Ultraviolet-crosslinking and immunoprecipitation (CLIP) techniques can provide key information about
the in vivo RNA-binding site of protein. This review will discuss the basic principles and recent developments of
CLIP techniques. These new developments have significantly improved the specificity, sensitivity and application
range of the technique.
Key words: UV crosslinking; protein-RNA interaction; deep sequencing
蛋白质和 RNA的相互作用在生命活动中发挥
着广泛而重要的作用。在 mRNA的转录、剪切、
出核、定位、翻译和降解等过程中，mRNA要和一
系列蛋白质结合并受它们的调控。很多结构性
RNA，如核糖体 RNA、剪切体 RNA、snoRNA，只
有和蛋白质形成复合物后才能发挥功能。利用实验
手段确定蛋白质结合哪些 RNA以及结合的位点无
疑是理解该蛋白质功能的重要内容。
CLIP (UV-crosslinking and immunoprecipitation)
是研究蛋白质和 RNA相互作用的重要技术，它利
用了蛋白质和 RNA在 256 nm紫外光照射下会发生
共价交联的特性。早在 20世纪 60~70年代，人们
叶克穷领导的研究组主要从事和 RNA相关的结构生物学研究。在各
种生物体中已经发现了大量非编码 RNA，它们不翻译成蛋白质，却在结构、
催化和基因调控中发挥重要作用，这些非编码 RNA通常和蛋白质形成复
合物行使功能。实验室目前研究的重点在真核生物核糖体的组装、RNA修
饰和 RNA沉默等领域、主要利用晶体学、核磁共振，电镜、生化、酵母
遗传操作等技术手段。
叶克穷 研究员
第26卷208 RNA研究的新技术和新方法专题
就发现紫外照射会导致蛋白质和核酸交联，但对光
交联的机理目前还不是很清楚。有理论认为核酸的
碱基在紫外光照射下会接受单个光子被激发，激发
态的碱基可以和数埃范围内的氨基酸通过自由基机
制或者电子转移机制发生光交联反应。所有 20种
氨基酸都有可能同核酸发生交联反应，但蛋白质中
的芳香族氨基酸以及 RNA中的尿嘧啶更容易发生
交联反应。
Darnell实验室于 2003年在研究 RNA结合蛋
白 Nova时开发了 CLIP技术，2005年又改进了部
分实验流程 [1-2]。在应用 CLIP的过程中还出现了多
种变体，但所有 CLIP技术的基本流程都是相似的，
图 1显示的是 CLIP的一种衍生技术—CRAC的基
本流程，它包括：(1)在体内用紫外光交联蛋白质
和 RNA；(2)用核酸酶部分降解 RNA，获得合适长
度的片段；(3)通过抗体纯化交联的蛋白质 -RNA
复合物 (RNP)；(4)对 RNA进行同位素标记和两端
接头序列的连接；(5)利用 SDS-PAGE分离纯化交
联的 RNP，降解 RNP中的蛋白质；(6)通过反转录
PCR 获得并扩增相应的 cDNA用于测序分析。近
10年来，CLIP技术被广泛应用，并取得了丰富的
成果 [3]。CLIP技术本身在特异性和灵敏度上也在
不断地改进 [4-6]。CLIP技术同高通量测序相结合，可
以在全基因组范围内捕获生物体内真实的蛋白质
-RNA的相互作用，深度获得有价值的序列信息 [3]。
最新的 CLASH技术还能探测 RNA和 RNA相互作
用 [4,7]。
但是 CLIP是较难掌握的一种技术。由于紫外
交联的效率很低 (1%~5%)，交联的 RNA含量很少，
只有用放射性同位素标记后才能观测到，很容易被
来源于细胞和试剂的非特异 RNA污染。另外 RNA
容易降解，RNA连接效率低，实验流程复杂 (~100
步 )等因素都增加了应用 CLIP的难度。本文主要
讨论 CLIP的基本流程和一些技术细节，并介绍最
近一些重要的技术发展，希望对想使用该技术的读
者有所裨益。读者如果要深入了解详细的实验流程
需要参考其他文献 [1,5-6,8-9]， CLIP的一些应用实例可
以在相关综述论文中找到 [3,10]。
1　CLIP基本流程
1.1　紫外交联
在 CLIP实验中，首先使用近紫外光照射细胞
或者组织，在蛋白质和 RNA之间产生共价交联。
利用紫外交联蛋白质和 RNA有诸多优点：(1)它使
用波长 250~270 nm的紫外光，设备易于获得；(2)
由于紫外光能穿透数层细胞，交联可以在活体细胞
图1 CRAC技术的基本流程
周德健，等：利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用第3期 209
内发生，这保持了体内复合物相互作用的真实状态，
甚至能捕捉体内的瞬时相互作用，在体内的交联还
避免了细胞裂解和纯化过程中 RNA的丢失以及形
成非特异的蛋白质 -RNA复合物；(3)可以直接使用
天然的核苷酸，不需外加修饰的核苷酸；(4)交联发
生在“零距离”的氨基酸分子和核苷酸之间，反映
直接相互作用的信息；(5)由于蛋白质和 RNA之间
形成稳定的共价交联产物，在后续纯化交联 RNP产
物时可以使用严苛甚至变性的条件，以减少杂质污
染对于结果的不良影响；(6)交联对 RNA逆转录的
影响不大，可能出现的突变还能帮助确定交联位点。
紫外交联的效率很低，据估计只有 1%~5%的
RNA能交联蛋白质。紫外交联的效率同照射剂量
相关，在具体操作中，需要通过预实验确定所需的
最少照射剂量，以减少辐射损伤对结果可能的不利
影响。另外紫外交联能否发生和蛋白质的具体结合
方式有关，有些 RNA结合蛋白无法成功交联 [11]。
1.2　RNA的部分消化
同蛋白质交联的 RNA一般很长，要用核酸酶
消化到适合的长度以便于后续的测序分析。消化时
由于蛋白质的位阻作用，交联位点附近的 RNA会
得到更多的保护。核酸酶消化可以在细胞裂解液或
在纯化的中间阶段进行。在预实验时，通常要设置
多个核酸酶的浓度，用来确定合适的消化条件。消
化后 RNA的长度为 20~100 nt较为合适，该长度的
序列可以方便地进行高通量测序，而且包含足够的
信息进行基因组定位。
RNase A和 RNase T1是最常用的用来消化 RNA
的核酸内切酶。RNase A特异切割胞嘧啶 C和尿嘧
啶 U的 3端磷酸二酯键，RNase T1则特异地作用
于鸟嘌呤 G 的 3端，它们都产生含 5-羟基和 2,3-
环磷酸的末端。这两个核酸酶通常联合使用，这样
可以避免由于消化序列特异性造成的偏倚。也有人
使用没有序列特异性的 RNase I，它能水解单链的
RNA生成 5-羟基和 3-磷酸末端 [9]。
1.3　蛋白质-RNA交联复合物的纯化
蛋白质 -RNA交联复合物要使用免疫共沉淀或
者其他方法从细胞裂解液中纯化。纯化可以利用识
别目标蛋白质的特异性单抗、多抗或者抗血清，抗
体通过直接或者间接的方法偶联到基质上。纯化也
可以利用目标蛋白质上带的标签，使用商品化的偶
联有标签抗体或者特异结合配体的亲和纯化基质。
在不影响目标蛋白结合的前提下，应尽量使用严谨
的纯化条件，以去除杂蛋白以及非特异性结合的
RNA。可以通过增加洗脱缓冲液中盐离子的浓度，
加入 NP-40、Tween-20、脱氧胆汁酸盐、SDS和尿
素等来改善纯化效果。
1.4　接头序列的连接
为了 RT-PCR扩增需要，交联 RNA的两端需
要分别连接 5和 3接头序列 (adapter)。接头序列是
通过化学合成的特定序列的 RNA，它除了包含高
通量测序所需的序列外，还可以包含条码信息，这
样可以混合多个带不同条码的样品一起进行高通量
测序，降低成本，充分利用高通量测序的信息量。
在设计接头序列和连接策略时要考虑到连接效率和
避免非特异的连接。
交联 RNA通常先和 3接头连接，然后和 5接
头连接。目前有两种常用的方法连接 3接头。一种
方法利用 T4 RNA 连接酶，它在 ATP存在的条件下
连接交联 RNA的 3羟基和 3接头的 5磷酸根。交
联 RNA在经过核酸酶处理后 3末端有个磷酸根，
磷酸根需要用磷酸酶处理去除后才能和接头 RNA
连接。另据报道，RNA连接反应中加入 PEG 6000
可大大提高连接的效率 [9]。另一种方法利用 T4
RNA 连接酶 2的截短片段突变体 Rnl2 (1-247)/K227Q，
它能在不需要ATP的条件下特异连接交联RNA的3
羟基和 5腺苷活化的 3端接头序列 [6]。后一种方法
可以提高 3接头的连接效率和特异性，它最早被用
于小 RNA的克隆 [12]。
在连接 3接头后，要利用 T4多聚核苷酸激酶
在交联 RNA的 5末端加上磷酸基团，然后利用 T4
RNA 连接酶连接带 3羟基的 5接头。为了在下步
SDS-PAGE纯化过程中追踪交联的 RNP，在磷酸化
交联 RNA时还要掺入放射性同位素 32P。
在文献报道的不同实验方案中，接头序列的连
接可以在溶液中进行，也可以在纯化基质上进行，
或者分步在基质和溶液中进行。在纯化基质上进行
的好处是可以方便转换反应体系，减少操作时间和
样品在中间纯化步骤中的损失。有些实验方案还包
括用胶纯化连接的中间体的过程，以减少连接序列
串联体的形成，提高 cDNA文库的质量。
为了阻止接头 RNA参与不需要的副反应，可
以在其不参与连接的末端进行化学修饰，比如 5 接
头的 5端用反向双脱氧腺嘧啶 (inverted dideoxy-T)
进行纯化修饰，3 接头序列的 3 末端用 puromycin
或双脱氧核苷 (dideoxy-nucleotide)进行封闭 [1,6]。
1.5　交联RNP的电泳分离和纯化
交联 RNP从基质洗脱后，在变性条件下用 SDS-
第26卷210 RNA研究的新技术和新方法专题
PAGE进行电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。利
用放射自显影确定 32P标记的 RNP的位置，然后从
硝酸纤维素膜切取大小合适的 RNP。电泳可以通过
分子量大小将目的蛋白同杂蛋白分开，这是一步高
分辨率的纯化步骤。在电泳分离交联 RNP时需要使
用特殊的 NuPAGE预制胶，因为实验室配的普通胶
在电泳时 pH值将上升到 9.0，引起 RNA的碱水解，
而NuPAGE胶在电泳过程中可以保持 pH 在 7.0附近。
另外转膜过程还可以减少非特异 RNA的干扰，因为
自由 RNA不能结合硝酸纤维素膜。
用放射自显影检测交联的 RNP是整个 CLIP实
验中关键的质量控制步骤，它能确定交联的效果和
确定目标 RNP的位置。目标条带的信号应该在无
UV交联处理组、缺失靶蛋白或亲和标签的阴性对
照组中不存在。蛋白质在交联RNA后分子量会增加，
在电泳上迁移位置滞后。RNP在电泳胶上的位置和
形状和核酸酶的处理强度有关：低剂量核酸酶处理
后，交联 RNA较长且大小不均匀，RNP呈现弥散
的条带；而在高剂量核酸酶处理后，结合的 RNA
很短，RNP接近于原始蛋白质的位置，呈现集中的
条带。在切取 RNP条带时，要选取主带上方区域，
那里对应的 RNA长度在 20~100 nt之间，要避免最
浓的主带，因为那里结合的 RNA 长度太短。
1.6　逆转录扩增和测序
从硝酸纤维素膜切取合适大小的交联 RNP后，
用蛋白酶 K完全降解其中的蛋白质，然后纯化
RNA，以 RNA为模板利用带接头序列的引物进行
反转录和 PCR扩增。经过蛋白酶 K的降解后，
RNA碱基上还会连接至少一个氨基酸残基，形成
RNA-氨基酸的加合物 (adduct)。共价连接的氨基酸
不会完全阻止逆转录酶的活性，但是会经常造成逆
转录时交联碱基序列的缺失或突变，这个信息可以
用来确定精确的交联位点和区分污染的 RNA[6]。
扩增得到的 DNA通常用 PAGE或琼脂糖凝胶
纯化，然后选择合适长度的扩增片段插入到克隆载
体进行 Sanger法测序，或者直接用于高通量测序。
在成功的 CLIP实验结果中，扩增的 DNA在胶上
应呈现弥散的分布，其分布范围和交联 RNA加上
两端接头序列后的预期长度一致，而信号很强的条
带往往来源于污染的连接序列多聚体。
2　CLIP技术的新发展
2.1　CLIP和高通量测序技术的结合
高通量测序技术的普及已经极大的提高了对核
酸序列的分析能力，高通量测序和 CLIP技术的组
合通常被称为 HITS-CLIP (high throughput sequencing-
CLIP) 或者叫 CLIP-seq[3]。高通量测序对于分析复杂
RNA结合谱特别适用，它可以在全基因组范围获
取蛋白质的 RNA结合位点以及结合 RNA的丰度信
息。高通量测序甚至能捕获瞬时或低频的相互作用。
我们在研究核糖体加工因子 Rrp7结合核糖体前体
时利用了高通量测序分析 CLIP结果，发现大部分
能定位到酵母基因组的交联序列 (92.75%)来源于核
糖体 RNA，这反映了 Rrp7的主要结合位点 [13]。另
外测序结果还鉴定到少量 (0.42%)来源于 snoRNA
的序列，有意思的是这些序列的 63.6%来自于一条
snR10 RNA，该交联信号可能反映了 Rrp7和 snR10
在结合核糖体时空间上相互接近，从而引发低频的
交联。
2.2　提高交联效率的PAR-CLIP
蛋白质和 RNA发生紫外交联的频率很低 (1%~
5%)，这成了应用 CLIP技术的主要瓶颈之一。为
了提高紫外交联效率，Hafner等 [5]利用一些核苷酸
衍生物，如 4-硫 -脲嘧啶 (4-thiourdine)的光交联效
率远高于普通核苷酸的特性，开发了 PAR-CLIP
(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced CLIP) 技
术。他们用 4-硫 -脲嘧啶标记哺乳动物的细胞培养
物，使用 365 nm的紫外光引发交联反应。同传统
的 254 nm 紫外光照射天然核酸相比，PAR-CLIP可
以将交联效率提高 100~1 000倍。在测序结果中他
们发现大量 T突变成 C，推测 4-硫 -脲嘧啶的第 4
位的硫原子交联氨基酸后，造成其碱基形成氢键的
方式和胞嘧啶 C一致，因此这些突变位点提供了精
确的交联位点信息。
2.3　高特异性的CRAC技术
传统的 CLIP在非变性条件下纯化蛋白质，当
目标蛋白质属于多元 RNP复合物中的组分时，就
难以避免复合物中其他蛋白质的干扰。虽然纯化洗
脱液中含有去垢剂，但通常不足以打破稳定的复合
物。另外，抗体特异性不高和 RNA污染也是影响
CLIP结果真实性的的重要因素。最近 Tollervey实
验室发展了称为 CRAC (crosslinking and analysis of
cDNAs)的技术，显著提高了 CLIP的特异性 [6]。
该技术的关键是在目标蛋白质 C末端融合一个
称为 HTP(His6-TEV-Protein A)的标签，该标签由多
聚组氨酸、TEV酶切位点和蛋白 A串联构成 (图 1)。
如果标签融合在蛋白质的 N末端，多聚组氨酸和蛋
白 A的位置要交换成为 PTH (Protein A-TEV-His6)标
周德健，等：利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用第3期 211
签。带 HTP或 PTH标签的目标蛋白质首先利用免
疫球蛋白 IgG结合标签中的蛋白 A，然后用 TEV蛋
白酶切下目标蛋白质，再利用 Ni基质结合组氨酸标
签。第二步亲和纯化步骤在含 6 mol/L盐酸胍的变
性条件下进行，可有效地解聚和目标蛋白质结合的
其他蛋白质。这两步亲和纯化，尤其第二步在变性
条件下的纯化，能显著地提高结果的信噪比。
对于结合高丰度 RNA的蛋白质，在测序结果
中如何区分信号和噪音是个重要问题，比如占总
RNA含量 98%的核糖体 RNA通常是测序结果中的
主要污染物。由于 CRAC技术具有很高信噪比，它
已经成功地用于定位多个核糖体加工因子在核糖体
RNA上的结合位点 [11,13-15]。
2.4　能探测RNA和RNA相互作用的CLASH技术
RNA和 RNA分子之间的识别在 RNA修饰、
基因调控等过程中发挥广泛的作用。C/D snoRNP
是由 C/D snoRNA和多个蛋白质构成的复合物，主
要催化底物 RNA特定位点上的核糖甲基化。C/D
snoRNA中含有一段向导序列，它能通过碱基互补
配对的原理结合底物 RNA修饰位点附近的序列，
从而确定反应的特异性。Tollervey实验室在利用
CRAC技术研究 C/D snoRNP蛋白的 RNA结合时，
在深度测序结果中意外发现少量的 (1%)杂合 RNA
(chimera)[4]。 这 些 杂 合 RNA 通 常 由 一 段 C/D
snoRNA的向导序列和一段互补配对的底物 RNA
拼接组成，这两段序列看起来在实验过程中被 RNA
连接酶连接上，又被紫外交联到蛋白质上。因此，
杂合 RNA代表了两段相互作用的 RNA，作者把
这种捕获 RNA之间相互作用的技术称为 CLASH
(crosslinking, ligation, and sequencing of hybrids)。
最近 CLASH技术被应用到研究 miRNA与
mRNA的相互作用 [7]。miRNA是调控 mRNA翻译
活性的重要分子，主要结合在 mRNA的 3 UTR非
翻译区域。长期以来缺乏直接探测 miRNA和
mRNA结合的实验手段，而是通过生物信息学预测
miRNA的结合位点。但 miRNA和 mRNA序列匹
配程度低，预测结果的可靠程度低，一直阻碍了对
miRNA功能的理解。miRNA和 mRNA的作用发生
在它们和 AGO蛋白结合的环境下。Helwak等 [7]利
用N端融合PTH标签的AGO进行紫外交联和纯化，
并优化了实验流程以促进 mRNA和 miRNA分子间
的连接。他们在深度测序结果中发现了约 2%的杂
合 RNA, 其中包括 399条 miRNA和 6 959条 mRNA
之间发生的 18 514对相互作用。这是首次获得如此
大规模的 miRNA -mRNA直接相互作用的数据，对
这些数据的分析还揭示了 miRNA结合的新模式。
3　结束语
CLIP技术的优势在于能捕获体内原位蛋白质
和 RNA相互作用，共价交联的复合物可以经受严
格的纯化过程，从而使得结果更为真实可靠。但
CLIP实验受到紫外交联的低效、非特异 RNA污染、
复杂的实验步骤和 RNA不稳定性等因素影响。最
近的一些技术发展部分克服了这些限制因素的影
响，CRAC技术在变性条件纯化共价交联的复合物
而提高了结果的信噪比，PAR-CLIP利用核苷酸衍
生物提高紫外交联效率，而 CLASH技术显示紫外
交联还能捕获 RNA和 RNA之间的相互作用。这些
新发展拓展了 CLIP的应用范围，相信未来会看到
更多 CLIP相关技术在蛋白质 -RNA相互作用的研
究中发挥作用。
[参　考　文　献]
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第26卷212 RNA研究的新技术和新方法专题
叶克穷报告讨论
伊成器 (北京大学生命科学学院 )
Q：您刚才提到蛋白质和 RNA UV交联的时候，其中有一个例子，您提到是在 Box C/D RNP里做 UV
交联后，可以用其中两个骨架蛋白质 NOP56和 NOP58来做 IP实验，当然另一个选择也可以用另一个甲基
转移酶 NOP1做 IP，以这个具体的例子为例两者有没有什么差别？
A：我们刚才只是分析了它们均能和 Box C/D RNA交联，但它们交联的位置还是不一样的，这与我们
知道的结构信息还是吻合的，现在的模型认为 NOP58结合在 Box C/D一头，而 NOP56结合在另一头 Box C/
D上。
Q：以此例子延伸一下，我想在做如 PAR-CLIP等交联时，如果目标是一个 mRNA 结合蛋白，那这个
实验比较好做，如果是一个酶，这个实验就很难成功，根据你的经历有没有什么评论呢？
A： CLIP技术的成功还是取决于目标蛋白质在体内结合 RNA的强度和时间，如果研究目标是一个酶，
它结合的时间可能很短，捕捉到 RNA的概率就低得多。
付向东 (加州大学圣地亚哥分校 )
Q：现在 CLIP这么多，从您的角度，如果您想做 CLIP，您想选哪种方法？
A：从我们角度我们选择 Tollervey 实验室发展的 CRAC，因为我们做的大部分是 90S核糖体前体结合
蛋白质，它们都形成很大的复合物，但靶标比较简单，都是核糖体 RNA，我们想知道精确的结合位点。
Q：我想 CLIP相对于其他方法学是用的最多的，我们刚从冷泉港会议中了解到其实大家都想用 CLIP
技术，而真正会用的人还是很少，那在座的各位有多少人想用，我们开会也要产生一些效率，我们可以找
两三个 CLIP做得比较成功的实验室，把这个 CLIP技术实验流程以及注意事项完善一下，再给大家分享一
下。
A：这个跟个人的“手”有关系。
刘默芳 (中国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞生物学研究所 )
Q：刚才付老师已经把我想说的都说了，我们就属于这种很想做 CLIP，但是又做得不是特别好的实验
室，很需要你们这种富有经验的实验室的帮助，我想问一下专业点的问题，在做 CLIP时，需要用核酸酶
处理 RNP得到的 RNA大概是多大呢？
A：这从测序结果可以知道，大概是 20~50 个碱基长度。
Q：我想问一下我们实验室中遇到的问题，我们实验室主要是做 piwi蛋白质，我们通过 CLIP实验发
现比 PIWI蛋白质稍大的条带，这可能是因为 PIWI蛋白质与 RNA结合后的条带迁移，但是也发现一些比
PIWI蛋白质更小的条带信号，这是什么原因呢？
A：蛋白质发生降解就会出现你所说的这种情况。
付向东 (加州大学圣地亚哥分校 )
Q：我觉得可能是蛋白质降解，但也有另一种可能很有意思。很多蛋白质在 IP时可能会形成复合物，
而在这个复合物中可能有不止一个的 RNA结合蛋白质，这样就会产生比较多的信号。我们实验室就正好
Granneman S, Petfalski E, Swiatkowska A, et al. Cracking [11]
pre-40S ribosomal subunit structure by systematic
analyses of RNA-protein cross-linking. EMBO J, 2010,
29(12): 2026-36
Hafner M, Landgraf P, Ludwig J, et al. Identification of [12]
microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA
library sequencing. Methods, 2008, 44(1): 3-12
Lin J, Lu J, Feng Y, et al. An RNA-binding complex [13]
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ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and
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Bohnsack MT, Martin R, Granneman S, et al. Prp43 bound [15]
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in ribosome synthesis. Mol Cell, 2009, 36(4): 583-92
周德健，等：利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用第3期 213
遇到了这种情况，歪打正着找到了一个新 RNA结合蛋白质。其实 CLIP技术已经过了起始阶段，大家需要
利用 CLIP技术做很多实验，比如把一个基因敲除，测试另一个蛋白质和 RNA的结合，或是在不同条件下
测试与 RNA的结合，比如在激活或是抑制某种蛋白质情况下测试其与 RNA的结合能力等，现在还发展到
通过细胞分组，测试细胞质、细胞核、细胞膜等中蛋白质与 RNA的结合，结果发现很多不同的条带，进
一步分析发现有的是蛋白质的不同变体，有的却是不同的蛋白质，它们在一个复合物里，再分别测序，发
现几者之间形成的模式都不一样，就是几种不同的作用方式，这种现象非常有意思，但是非常花钱。你们
是在自己所里测序的吗？
A：是的，其实我们实验室成功率也很低，今天给大家展示的也是成功的两个例子，失败的案例也很多。
CLIP成功的关键是操作者，整个实验 RNA含量极低，需要同位素标记才能看到。
Q：有经验表明在蛋白质核酸电泳后可以省略将样品从胶转移到膜上那一步，这样能把灵敏度提高几
十倍。再说 PAR-CLIP虽然能提高灵敏度很多，但是很多人也不喜欢用，因为它有很大的偏好性，包括
UV交联也这样 ,如果蛋白质结合到含有 U的 RNA序列上这个实验就好做，相反如果它只结合到含嘌呤的
mRNA序列上，这个实验就比较难，所以这 CLIP实验技术还是有很多技巧有待研究。
沈晓骅 (清华大学生命科学学院 )
Q：我有一个比较基本的问题，大家有没做过将 UV 254交联和 PAR-CLIP 365交联两者相结合做两步
交联，另外，大家为什么都选择 UV交联而不选择如甲醛交联等其它交联呢？
A(付向东 )：两步交联还没做过，不过可以试一下。UV交联是不可逆转的，而甲醛交联是热敏感的，
可以逆转的。
Q：甲醛交联效率与 UV交联有何差别 ?
A(付向东 )：甲醛交联效率比 UV交联效率高很多，UV交联效率最多 1%,这里面确实存在很多问题，
这就要看化学家怎么解决这个难题了。
A(叶克穷 )：这里我还要补充一下 UV交联有什么好处，UV交联能在完整的活细胞里完成，这真实
地反映了活细胞内的相互作用，因为你把细胞破碎以后交联，你就不知道 RNA结合蛋白质到底会结合什
么杂质。
曹晓风 (中国科学院遗传与发育生物学研究所 )
Q：我有一个问题，我们实验室做 UV交联是从付向东等老师实验室学过来的，在做 UV交联时要将
细胞放在冰上，我们是做植物的，我们发现很多 RNA结合蛋白质是和外界压力相关的，你们有没发现在
冰上做 UV交联拿到的数据是和外界刺激压力相关比如说冷刺激，这问题你们怎么看？
A：其实在 UV交联时，不一定要将细胞放在冰上，现在有一种技术可以直接在培养基中生长的细胞
进行 UV交联。