全 文 ：第26卷 第12期
2014年12月
Vol. 26, No. 12
Dec., 2014
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2014)12-1255-11
DOI: 10.13376/j.cbls/2014181
收稿日期：2014-12-01
*通信作者：E-mail: yxren@sibcb.ac.cn
超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究
任煜轩*，于　洋，王　艳
(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心·上海(筹)，上海 201210)
摘　要：超高分辨率显微镜是近年来生命科学领域重要的研究手段之一。2014年诺贝尔化学奖颁发给超高
分辨率显微技术领域的三位科学家，以表彰他们在该领域所作出的杰出贡献。超高分辨率技术的典型代表
有受激损耗、结构光照明以及单分子定位等。这些技术的出现使得传统光学显微镜难以分辨的细胞器、分
子等细节信息可以被观察到，帮助科学家从纳米尺度认识细胞内分子结构、定位以及相互作用。
关键词：超高分辨率；受激损耗；结构光照明；光敏定位；随机光学重构
中图分类号：Q-336 文献标志码：A
Super-resolution microscopy in Nanobiology
REN Yu-Xuan*, YU Yang, WANG Yan
(National Center for Protein Sciences Shanghai, Institute of Biochemistry and Cell Biology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China)
Abstract: Super-resolution microscopy is one of the advanced means for the study of life sciences. The 2014 Nobel
prize in Chemistry was awarded to three scientists for their contributions to the super-resolution microscopy.
Representative techniques achieving super-resolution are stimulated-emission, structured-illumination, and single-
molecule localization. The advancement of these techniques enable the visualization of the detail in cell organelle,
macromolecules, and the localization of molecules. Such kind of information was unresolvable under traditional
optical microscopes and will help understand the structure, location, interaction of molecules within cells in
nanometer scale.
Key words: super-resolution; stimulated emission depletion; structured illumination; photo-activation localization;
stochastic optical reconstruction
生命科学处处充满着神奇。人类对生命科学奥
秘的揭示是随着科学技术的进步而逐渐加深的，生
物学的发展得益于物理学和工程技术的进步，生命
科学的探索也同时促进工程技术的不断发展。早在
17世纪，荷兰博物学家、显微镜创制人列文虎克
(Antonie van Leeuwenhoek, 1632-1723)第一次将光
线通过透镜聚焦形成光学显微镜，并用它第一次观
察到微生物 [1]。显微镜从此成为生物学家探寻生命
奥秘必不可少的利器。显微镜相关的技术，如显微
镜设计、荧光标记，以及图像分析的不断进步也使
得细胞生物学的面貌焕然一新。然而，光学显微镜
成像的分辨本领却受光学衍射极限的限制，这个衍
射极限无法通过提高透镜的质量、信号灵敏度以及
系统放大率等来突破。
1873年，恩斯特 ·阿贝尔 (Ernst Abbe，1840-
1905)提出光学衍射极限计算法则，d = λ/2NA。对
λ = 532 nm波长的激光 (光子能量 2.33 eV)，衍射
极限为 ，这里假设物镜的数值
孔径 NA=1。为提高显微镜的分辨本领，一种方法
是提高物镜的数值孔径，但是数值孔径的提高是很
有限的；另一种途径是降低入射光波的波长，这可
以通过电子显微镜实现。对能量同样为 2.33 eV的
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电子，在不考虑相对论效应时，电子的德布罗意 (De
Broglie)波长为 ，相应地，
电子显微镜的衍射极限可达 。电
子波长与加速电压有关，提高电压可获得更小波长
的电子束。1974年诺贝尔生理学或医学奖得主乔
治 ·帕拉德 (George Emil Palade)正是利用电子显微
镜观察细胞分化而开创了现代生物学研究领域。
然而，许多生命科学问题需要在活体环境或电
解质环境下寻找答案，光学显微镜的优势就在于不
会破坏样品本身且可对样品进行高度特异的多色标
记及三维成像 [2]，这是电镜无法满足的。为了提高
光学显微镜的分辨本领，人们发明了多种技术，如
数字全息 (DHM)、全内反射荧光 (TIRF)、近场光
学扫描 (SNOM) [3-4]、多光子 (multi-photon)荧光 [5-6]、
I5M [2]、4π [7]、饱和结构光照明 (SSIM)、受激发射
损耗 (STED)、光敏定位 (PALM)以及随机光学重构
(STORM)等技术。2014年 10月 8日，瑞典皇家科
学院宣布，诺贝尔化学奖授予美国科学家埃里克·贝
齐格 (Eric Betzig)、威廉 ·莫尔纳 (William EscoMoerner)
和德国科学家斯特凡 · 黑尔 (Stefan Hell)等，以表
彰他们为发展超高分辨率荧光显微镜所做出的杰
出贡献。这一系列超高分辨率显微镜的诞生是物理
科学、工程技术以及生物化学等多学科交叉融合的
产物。
1　超高分辨率显微镜发展历程
光学系统对点光源的响应一般用点扩散函数
(PSF, point spread function)来刻画。一般的点扩
散函数为一个艾里斑，其表达式为
，J 1 是第一类贝塞尔函数，
为焦平面尺度，r是到焦点的距
离，NA是成像系统收集透镜的数值孔径。光学系
统点扩散函数的大小直接制约系统分辨本领的提
升，这个限制不仅体现在横切面，还制约着沿光轴
方向的成像精度。
图像干涉显微镜 [2] (I2M, image interference micros-
copy)是为了提高轴向分辨率而设计的，它所采用
的共焦双物镜设计使得焦平面上的荧光样品同时由
两个物镜成像到 CCD相机上并形成叠加的像。调
节两个成像光路使得他们的光程相等，这会使得两
束光产生的荧光分子影像相干涉，干涉图形包含轴
向的高分辨信息。采用扩展的非相干光干涉照明，
即实现 I3M (incoherent interference illumination)。I5M
显微镜是结合图像干涉和非相干光干涉技术而成
的。在 I2M和 I3M两种模式下，利用卷积算法还原
图像。在不同的轴向位置拍摄一系列图像，通过计
算卷积去除失焦产生的像模糊并且重构出样品的三
维图。采用 I5M显微技术可以获得优于 100 nm轴
向分辨率的 3D宽场荧光图象 [2]。双物镜模式的一
个优势是增加物镜的接收角，4π显微镜 [6,8]亦采取
这样的模式。接收角的增加减小了 PSF的尺度从而
提高分辨率。4π显微镜得名源自通过样品前后双物
镜的总接收角接近 4π。与 I5M显微镜所不同的是
4π显微镜采用相干光照明，而 I5M显微镜采用非相
干光照明 [9]。具有较高轴向分辨率的显微技术还有
利用疏逝波照明产生的全内反射荧光显微镜 (TIRF)
以及近场光学扫描显微镜 (SNOM)等。
除了利用图像干涉或者疏逝场提高分辨率以
外，斯特凡·黑尔开创性地提出受激损耗显微原理。
利用环形的损耗光将荧光显微镜点扩散函数边缘
的荧光分子从激发态受激损耗到基态，在荧光激
发光作用下，只有中心区域发射荧光，实现点扩
散函数的压缩，进而达到亚衍射尺寸的分辨率。另
一种类似的技术是基态损耗 (GSD)。此后，许多超
高分辨率成像技术不断涌现 [10]。如古斯塔夫森 (Mats
Gustafsson)发展了一种结构光照明显微术 (SIM)。
这个技术采用一系列不同图案的调制照明光束，使
得样品与预设图形形成莫尔条纹，通过采集低分辨
的莫尔条纹来获取常规光学显微镜不能分辨的精细
结构。为改善 SIM的性能，还出现了非线性结构光
照明显微镜 [11-12]、双色 3D SIM[13]等。
早在 1959年，著名的物理学家费曼 (Richard
Feynman)先生提出纳米构造从底层设计的思想，能
够在原子或者分子层次操纵和控制物质 [14]。1986年，
贝尔实验室的阿希金 (Arthur Ashkin)等发现激光辐
射压力可以用来捕获和操控微米级粒子 [15-16]，这一
发现开创了激光光镊和原子冷却两个研究方向。激
光光镊可用来间接操纵单个生物大分子，但是难以
对单个分子进行可视化。1989年莫纳尔首次观测到
并五苯分子的单分子光谱 [17]，为单分子的识别和探
测奠定了基础。从大量分子中获取单个分子的信息
需要所有分子的运动严格同步，这是非常难以实现
的。系综测量的结果是无数个分子集体表现的平均
信息，掩盖了单个分子运动的个体特性，因此迫切
需要发展单分子技术。为了探测单分子，需要采用
一束波长与分子共振能级匹配的激光激发电子跃
迁，直接通过吸收光谱或者间接利用发射荧光光谱
任煜轩，等：超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究第12期 1257
来探测 [18]。早期的单分子探测研究多在固态基底表
面 [17,19-20]，而细胞等多存在于液体环境中。直到
2006年，单分子定位超高分辨率成像在埃里克 ·贝
齐格、庄小威和赫斯实验室分别实现。他们将各自
的发明技术命名为光敏定位显微镜 (PALM) [21]、随
机光学重构显微镜 (STORM) [22]和荧光光敏定位显
微镜 (fPALM) [23]。在这些技术中，荧光分子是可以
在亮态和暗态之间转换的。荧光分子密集布满在样
品中，每次随机激活样本中少部分分子发射荧光，
接着对这些分子进行高精度的定位，通过获取足够
多的图像并对这些图像中的分子位置进行重构获得
超高分辨率的图像。为方便比较，表 1列出了各类
显微镜的横向分辨率、纵向分辨率以及时间分辨率。
2　超高分辨率显微技术
受激发射损耗、结构光照明以及光敏定位等超
高分辨率显微技术有各自的特点和适用范围。这三
种技术分别运用点扩散函数调控、调制光照明以及
单分子定位，且具有一定的代表性。为更好地利用
这些技术在纳米尺度解决一些重要的生物化学问
题，使得相关领域的生化学家了解这些新兴技术，
以下对这三类技术进行逐一介绍。
2.1　受激发射损耗显微镜
用一根粗笔绘出一条线，再用橡皮擦去两边多
余的部分，线条会变细。受激发射损耗显微镜
(STED)的原理与此类似，通过在衍射受限区域边
缘重叠一束环形光来淬灭荧光，使得发射的荧光受
限在很小的区域。为实现荧光淬灭，用螺旋形的相
位片在激光焦斑处产生一个中空的区域。STED光
的点扩散函数 (PSF)在二维空间呈现出中空的环、
在三维空间为一个面包圈形的环形腔。对衍射受限
的荧光点周围进行荧光淬灭，使得荧光来自比通常
共聚焦光斑小许多的区域。
典型有机荧光素分子的能级图如图1A所示 [30]。
S0和 S1分别为荧光分子的基态和激发态。荧光激
发光由一束聚焦到针孔上的激光构成，激发光引起
荧光分子 S0→S1的跃迁。分子通过自发荧光辐射再
从激发态 S1回到 S0态，返回基态 S0的过程可以通
过受激发射得到增强，这个过程和常规的吸收具有
同样的吸收截面和强度依赖。为了抑制自发辐射，
STED光需要在比 S1寿命短的时间内产生强的光脉
冲。为避免重复激发，需要将 STED光的波长调到
发射谱的红端。T1是一个暗的三重态，它跃迁自 S1
态，并且可以在 1~104 µs内回到基态 S0。点光源由
显微镜系统成像到样品上，其空间分布由点扩散函
数 (PSF)确定。随着 ISTED的增加，S1态损耗会饱和
(图 1B)，这样在荧光和 STED光强之间建立一个
非线性关系。饱和是打破衍射极限的最基本的要素。
图 1 B插图显示饱和光强 I sat。在 STED作用下，亚
衍射极限分辨率由修正的阿贝公式描述，
(1)
图 1C 为点扫描 STED 显微镜，激发光和
STED光所产生的荧光信号用一个点探测器记录，
激发光斑 (左图 )重叠在 STED光斑 (中间 )上。饱
和的损耗光缩减了受激发分子 (右图 )的区域，获
得一个亚衍射尺寸的荧光光斑。与共聚焦显微镜中
的荧光光斑对比发现，STED横向与轴向分辨率分
别提高两倍和五倍。三维体积的缩小产生一个超小
的亚衍射尺寸的焦体积，约为 0.67阿升，是共聚焦
的 6%。STED从根本上打破了经典的分辨率极限，
能够在远场提供最好的分辨率。
生物学应用中往往关注样品上受照射的激光
功率密度。STED光源多采用锁模染料激光，可产
生重复率为 100 MHz的皮秒激光输出 [32]。典型的
STED光脉冲峰值功率约为 hSTED = 1 300 MW/cm
2，
这比双光子荧光显微镜小 3个数量级 [32]。STED荧
光显微镜可以对透明样品内部空间进行三维成像，
在活体脑成像、神经元等研究中具有独特的优势 [33]。
表1 各类显微镜参数比较
横向分辨率(nm) 轴向分辨率(nm) 时间分辨率 文献
SNOM 20~120 10 s~min [20, 24-25]
TIRF ~200 100 ms [25-26]
I5M、4π ~200 ~100 ms [2, 8-9]
STED、GSD 70~100 ~100 ms~min [27-28]
(S)SIM <50 250 ms~s [11]
(f)PALM ~2-25 ~50 s~min [21-23]
STORM ~20 ~50 s~min [22, 25, 29]
生命科学 第26卷1258
此外，STED显微镜的分辨率还可以通过改变损耗
光阈值来提高 [28]。
另外一种 GSD显微镜利用荧光分子长寿命的
三重态作为亚稳态，相对于激发态最低振动能级 S1
寿命大大增加。首先采用连续环形 GSD光饱和激
发荧光分子，耗尽基态的电子使它们布居于长寿命
的三重态上，再用波长相同的脉冲光激发样品，只
有没被 GSD光耗尽基态电子的中心区域荧光分子
可被正常激发并发射荧光，从而实现 PSF尺度压缩。
2.2　结构光照明显微镜
根据阿贝衍射极限，dx,y = λ/2NA、dz = 2λ/NA
2，
其中 λ是激发光的波长，NA是显微物镜的数值孔径。
实空间衍射极限关系限定两个发光体之间的可分辨
距离。频率域形式的阿贝公式决定了最大可观测频
率，
k0 = 2NA/λem (2)
其中，k0是最大可观测空间频率，NA 是数值孔径，
λem是发射光波长。运用傅里叶变换可以将一个函
数在空间域和频率域进行变换。空间频率难以可视
化，高频信息对应尖锐的变化，而缓慢变化的结构
则对应低频信息。
用 2D频域空间描述样品信息，光学衍射极限
为一个以原点为坐标，k0为半径的可观测区域。这
个区域以外的信息在传统显微镜里不可分辨。提高
显微镜分辨率的目标就是扩大频域可观测区域，使
得原有受限区域以外的信息可观测 [11]。传统显微镜
的光学传递函数 (OTF)限制在最大可观测频率内，
这个区域的半径是阿贝衍射极限的倒数。在 TIRF
模式下，激发光空间频率可以在探测光光学传递函
数之外 (图 2B)。在线性结构光照明时 (图 2C)，直
流分量在坐标原点，照明光有一个单一的空间频率，
这和样品结构的频率混合在一起，通常样品上很多
图1 STED工作原理图[31]
图2 结构光照明显微镜光学传递函数示意图[11]
任煜轩，等：超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究第12期 1259
精细结构太小而不能分辨。将样品信息中非零频区
域外的信息移到光学传递函数 (OTF)以内，就可以
分辨。重构时，样品信息中的高频成分移回到频域
合适的地方，分辨率会比传统显微镜提高 2倍。非
线性结构光照明有效照明图形包括图形空间频率整
数倍的信息 (图 2D)。和线性 SIM类似，这些信息
与样品信息混合，重构图可以更大地提高分辨率。
2D超高分辨率图像可通过旋转一维图形实现 (图
2E)。
调制图案与样品中的高频信息形成莫尔条纹，
这个莫尔条纹具有较低的空间频率，能够被显微镜
所观测 [34]。SIM正是通过形成莫尔条纹将可观测区
域外的信息移到可观测区 [11]，将不可见的高频信息
与条纹干涉后进行编码 [35]，从而产生超高分辨率的
图像。
2.3　单分子定位超高分辨率显微镜
在量子力学中，所有荧光分子由量子态描述，
处于暗态的分子既不能吸收也不能发射光子。基于
单分子定位的超高分辨率显微镜正是利用荧光探针
在亮态与暗态的可逆转换来精确定位每个荧光分
子。典型的技术有光敏定位显微镜 ((f)PALM)和随
机光学重构显微镜 (STORM)。图 3为 PALM工作
过程的示意图 [21]。用 405 nm的活化光稀疏地激活
部分光敏荧光蛋白分子。再用 561 nm激光激发荧
光直到大部分荧光分子被漂白 (图 3C)。重复这个
过程许多次 (图 3C和 3D)直到未失活的和未被漂
白的分子耗尽。将所有帧中荧光分子的位置叠加到
一起会形成一幅衍射受限的图像 (图 3E和 3F)。单
分子定位技术将每帧中单分子影像 (图 3G图左图 )
用显微镜系统的点扩散函数 (图 3G图中间 )拟合，
得到分子中心坐标以及坐标的标准偏差，对所有帧
中的分子重复这一过程直到荧光分子全部漂白 (图
3A’, 3D’)，并将这些结果叠加到一张图像上 (图
3E’和 3F’)。影像的精度由 PSF的不确定度和定位
分子的浓度等决定。PALM获得超高分辨率图像是
通过牺牲时间分辨来实现空间超高分辨的，早期一
幅 PALM图需要约 2~12 h [21]。
PALM技术首次由诺贝尔奖得主 Eric Betzig实
现。在同一时期，缅因大学的赫斯 (Samuel T. Hess)
和哈佛大学庄小威教授组分别独立实现荧光光敏定
位显微镜 (fPALM)和随机光学重构显微镜 (STORM)。
(f)PALM和 STORM构成基于光可逆荧光探针和高
精度的单分子定位显微技术基础。它们主要通过对
标记在细胞上的大量荧光分子进行成像，根据荧光
分子的单分子定位来重构超高分辨率的影像。
3　超高分辨率显微镜在纳米生物学中的应用
超高分辨率显微镜将生物学研究带入纳米时
代，开创了纳米生物学研究新领域。超高分辨率显
微技术革命性研究成果加深了人们对蛋白质和细胞
器相互作用的理解，如肌动蛋白和微管相互作用、
蛋白质与线粒体相互作用等。此外，在细菌、病毒
以及真菌等与人类密切相关的微生物中，遗传物质
的传递方向与传统中心法则不同，超高分辨率显微
技术可以从单分子层次研究核酸、蛋白质的相互作
用机理，为设计小分子抗病毒药物提供指导。
3.1　细胞生物学研究
细胞是生命体的基本构成单元，细胞本身也是
一个非常复杂的动态流体体系，超高分辨率显微技
术的不断涌现与革新为研究细胞内多种生命活动提
图3 光敏定位显微镜示意图[21]
生命科学 第26卷1260
供了解决方案。
细胞膜主要由磷脂双分子层构成，在磷脂膜的
内部镶嵌着各种蛋白质、离子通道以及小分子。对
细胞膜的研究是细胞生物学中的一个重要课题，然
而，膜域的大小、脂质筏的寿命等诸多与细胞膜
相关的问题仍然困扰着人们。细胞内的单分子实时
检测技术提供一个解答这类生命科学问题的技术手
段 [36]。对膜结构的超高分辨率成像有利于加深人们
对超微动力学、细胞功能的理解 [37]。比如，2008年，
施瓦茨 (Lippincott-Schwartz)院士等采用 PALM技
术首次成功地观测到活体细胞中膜蛋白的运动。
2010年，理乐迈尔 (Lillemeier)等采用快速 PALM
成像，研究 TCR和 Lat在 T淋巴细胞膜上的时空
分布特性 [38]。
超高分辨率显微成像技术的发展促进了对细胞
内细胞器精细结构与动态过程的研究。2012年，庄
小威组针对细胞膜、线粒体、内质网和溶菌酶等多
种细胞器和蛋白质 [39]，设计了 8种光转换膜探针。
在这些荧光探针的帮助下，研究人员获得了线粒体
和内质网的双色超高分辨率影像，揭示了线粒体融
合和内质网重构的形态动力学细节。2013年，朱学
良研究组利用多色 3D-SIM观察 Deup1、PIK4、SAS6
等蛋白质在中心体扩增过程中的结构和分布特性，
研究中心体扩增的分子机制 [40]。
细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网格结构，
它不仅在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部
结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重
要的生命活动。研究细胞骨架对于理解细胞的迁移、
细胞内物质运输、细胞分裂等多种生命现象具有重
要的意义。2000年，Gustafsson [41]利用 SIM对 HeLa
细胞中肌动蛋白细胞骨架成像，获得横向分辨率达
到 110 nm的超高分辨率影像。2007年，庄小威组
采用双色 STORM记录多种蛋白质的空间位置，阐
明网格蛋白小窝与细胞骨架蛋白之间的位置关系，
而且采用双色荧光时每种颜色的分辨率都可以达到
20~30 nm [42]。2008年，庄小威组首次利用 3D-STORM
拍摄肾细胞内微管结构，该技术的空间分辨率比传
统 3D光学成像技术高 10倍 [43]。
真核细胞中的遗传物质以染色质的形式存储于
细胞核中，在染色质末端有一段端粒 DNA。端粒
在各物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性
均有重要作用，端粒长度的减少会导致细胞复制能
力的受限。端粒酶是一种基本的核蛋白逆转录酶 [44-45]，
它可将 DNA合成到真核细胞染色体末端，延长短
的端粒从而增强体外细胞的增殖能力。因此研究
端粒的结构、功能和破译端粒酶在细胞中的组装过
程，对基础医学研究具有重要的意义。2007年，庄
小威组通过单分子技术实时跟踪观察了嗜热四膜虫
(Tetrahymena thermophila)的端粒酶结构变化，精确
观察到端粒酶一步步进行组装的全过程，揭示了端
粒酶中三种不同的蛋白质和 RNA成分是如何相互
配合，并在形成过程中不断修正以确保下一步得到
正确的执行 [44]。2013年，Doksani等 [46]通过 STORM
对去除了 shelterin蛋白复合物 (维持端粒正常功能
的端粒蛋白网络核心部分，包括 TRFl、 TRF2 、RAPl、
TIN2、TPP1 和 POTl六种端粒蛋白 )的功能不全端
粒以及功能性端粒进行了结构成像，发现功能性端
粒能频繁形成一种 T-loop 构象，而对于 shelterin单
个组件条件缺失型端粒的研究，则表明 T-loop 的形
成或维持需要端粒重复序列结合因子 2 (TRF2)，如
果缺失的是 TRF1、Rap1 或 POT1 蛋白，那么不会
对这种构象造成影响。在 shelterin蛋白复合物中，
TRF2 能独一无二地通过两种途径保护端粒：经典
的非同源末端连接 (NHEJ)和 ATM 依赖性 DNA 损
伤信号途径。研究指出 TRF2 依赖性端粒重塑形成
T-loop 构象，会导致染色体末端封闭，因此 NHEJ
和 ATM 信号通路，在存在 TRF2 蛋白的时候会受
到抑制。
3.2　神经生物学研究
神经细胞构成了高等动物脑功能的物质基础，
是人类认知、学习、记忆、思维以及智力的重要承
载单元。传统的神经生物学研究手段有电生理、分
子生物学以及蛋白质组学等。超高分辨率荧光显微
镜的出现为传统神经生物学研究带来生机。通过超
高分辨率成像，有助于理解神经突触蛋白质复合物
结构与功能的关系，从分子水平揭示信号转导规律。
2013年，Marx等 [47]通过超高分辨率荧光显
微镜研究发现，非洲爪蟾细胞质连接相关蛋白
(XCLASP1)的减少会导致脊髓轴突分支。损耗轴突
里的 XCLASP1蛋白，生长锥和丝状伪足中的微管
延伸都受到极大的影响。庄小威等利用 STORM技
术揭示了神经细胞中肌动蛋白及其相关蛋白的空间
结构，其中肌动蛋白呈指环状，缠绕在神经轴突的
外周，沿轴突中心均匀分布 [48]，间隔长度具有周期
性，约为 180~190 nm，详见图 4。这种有规律的结
构并不会出现在树突上，沿着树突出现的是长肌动
蛋白丝。这一成果为研究神经元的极性、运输、神
经突触的生长等提供了理论基础。
任煜轩，等：超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究第12期 1261
神经细胞是通过与相邻的细胞间的信息传输来
实现功能的。能对活体动物的神经细胞进行超高分
辨率的成像，对揭示大脑的工作机理至关重要。
2008年，黑尔组使用 STED技术观察到了离体培养
的神经细胞轴突中突触囊泡 (synaptic vesicles)的运
动过程 [49]。2012年，他们利用 STED直接观察到
活体成年小鼠的大脑皮层，清晰观察到蘑菇头形的
树突棘 [33]。对神经细胞的动态影像分析发现，在和
相邻突起建立或者断开连接时，树突棘头部和颈部
会晃动并改变形状。这些超精细动态成像研究有助
于理解神经突触功能异常引发的疾病。
3.3　微生物学研究
微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型
的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，
它个体微小，却与人类关系密切。微生物的形态观
察从安东尼 ·列文虎克发明显微镜就开始了。
在原核细胞和真核细胞中，肌动蛋白骨架是细
胞许多基本功能的调节机构 [50]。在真核细胞中，这
些功能依赖于肌动蛋白细丝组装和去组装的协调动
力学。细菌肌动蛋白同系物有两类，一类是 MreB
家族蛋白；另一类是特异性质粒 ParM家族蛋白。
MreB蛋白执行其功能的机理仍然不清楚。单分子
荧光成像技术则为在体 (in vivo)研究MreB动力学
提供良好的手段。将MreB和 YFP的基因融合并转
至新月柄杆菌中，利用单分子成像技术观察活体状
态下MreB-YFP复合体的运动。通过时序图像分析，
发现未聚合的球粒状MreB (gMreB)呈现布朗运动
扩散的快速移动，而聚合的细丝状 MreB (fMreB)
做较慢的方向性运动。这种定向运动表明，与肌动
蛋白类似，MreB微丝上 MreB单体呈现出典型的
踏车现象。
人类免疫缺失病毒 (HIV)是造成人类免疫系统
缺陷的一种病毒，它是一种感染人类免疫细胞的慢
病毒 (Lentivirus)，属反转录病毒的一种。2008年，
庄小威组运用单分子定位和荧光共振能量转移可以
观测到逆转录酶RT在双链核酸两端快速地穿梭 [51]。
在到达 DNA 3端时，RT能自发蹦跳，转到聚合的
方向，这种滑动的动力学过程能够被同源的核苷酸
A: 肌动蛋白(绿色)和βII-血影蛋白(紫色)；B: 肌动蛋白(绿色)和内收蛋白(紫色)；C: βII-血影蛋白(绿色)和内收蛋白(紫色)；D:
钠离子通道(Nav，绿色)和βII-血影蛋白(紫色)；E: 肌动蛋白和βII-血影蛋白(C端标记)的空间相关性[(C)，红色]，钠离子通道
和βII-血影蛋白(N-端标记)的空间相关性[(D)，绿色]；F: 轴突外层细胞骨架模型。短的肌动蛋白微丝(绿色)，末端由内收蛋白
加帽(蓝色)，形成一个指环结构，沿着轴突圆周缠绕
图4 神经轴突中肌动蛋白、血影蛋白与内收蛋白相互作用的超高分辨率成像[48]
生命科学 第26卷1262
和抗 HIV药物调控。这种长距离的转移活性有利于
逆转录酶 RT的多级式作用，包括 DNA聚合和置
换链的合成。她们还发现作用于不同模板基底的逆
转录酶还具有不同的方向动力学 [52]，在 RNA链上，
逆转录酶可以快速地在两个方向切换，这种切换可
以由同源核苷酸和包含不同核苷酸逆转录酶抑制剂
进行调控，大多抗 HIV药物都是抑制剂。这些单分
子研究结果表明逆转录酶的活性是由绑定在模板基
底时的方向决定的。
对原核生物核区的单分子研究可以揭示细菌遗
传物质的组织机制 [53]，有助于从单分子层次理解流
感、艾滋等病毒侵入宿主细胞的过程，为研制相关
疾病的治疗药物提供一定的依据。
4　超高分辨率显微技术展望
超高分辨率显微技术的发展依赖于物理和工程
技术的进步所代替，如各种算法的设计和优化、光
学设计和计算机软硬件控制以及荧光蛋白和荧光染
料的合成和标记等。2014年诺贝尔化学奖仅是超高
分辨率显微技术的良好起始，相信越来越多的技术
会逐渐丰富和发展超高分辨率显微技术。
4.1　单分子定位技术
在单分子定位超高分辨率显微镜中，需要确定
单个荧光分子的影像位置。2003年，Yildiz等 [26]
采用 1 nm精度的荧光成像技术 (FIONA)观测到
Myosin V以交手形式沿着微管运动，其核心是对单
个荧光分子影像进行拟合。优化的衍射极限点是一
个艾里斑。零级艾里斑近似于二维高斯分布，因此，
在许多单分子定位实验中采用二维高斯分布拟合单
个荧光分子 [26]，这并不影响单分子定位的精度。设
荧光点强度分布为，
常数项 z0由背景荧光、探测器噪声、CCD的
本底噪声等决定，A是拟合的峰值振幅，x0和 y0是
荧光分子中心的坐标，sx和 sy是每个方向坐标的标
准偏差。基于定位的超高分辨率显微技术的基础是
采用最小似然估计 (MLA)精细确定荧光探针图像
光斑的中心。用最小二乘法将单个荧光分子的影像
拟合为二维高斯分布，定位的均方差为 [54]，
(4)
上式中右边三项依次是光子噪声、探测器像素化噪
声以及背景效应。其中 s是点扩散函数的标准偏差，
a是图像上每个像素的大小，Nm是测量得到的来自
分子 m的总光子数。bm是拟合窗口中采集到的背
景光子数。类似地可以得到总光子数的标准偏差 [54]，
光子计数噪声源自总光子数的计数误差，而背景噪
声为一个低强度的基底。单分子定位的目标是获得
最高的衍射受限分辨率 (s)、最大的采集效率 (Nm)
以及最小的背景噪声 (bm)。
此外，在单分子定位实验中，可以采用单个
荧光分子影像的灰度重心 [55]或者图像相关识别技
术 [55]对荧光分子进行定位。这两类技术在光镊、
磁镊等实验中广泛使用。以灰度重心法为例，首先
对图像的合法性进行判定，如某个分子影像是否被
图像的边缘剪切、是否存在饱和像素以及是否与已
经分析的荧光光斑重叠等。通过这些判定后，再利
用灰度重心法 [56]计算每个荧光光斑中心位置 (cx, cy)，
(6a)
(6b)
其中，i, j是光斑中 x轴和 y轴方向的坐标索引，
xi,j和 yi,j是像素坐标，si,j为对应像素的荧光强度。
通过灰度中心算法还可以确定荧光光斑的形状 [56]。
荧光分子的 3D定位可采用柱透镜压缩点扩散函数，
通过识别点扩散函数的椭圆度确定荧光分子的轴向
位置 [57]。
对具有本征闪烁和漂白的高密度 GFP标记的
活细胞样品，还可以采用贝叶斯分析获得高分辨率
图像 [58]，其优点是不需要对荧光素进行精确定位。
此外，针对特定应用，还出现了一系列具有用户友
好型界面的处理软件，如 LivePALM、QuickPALM [56]、
DAOSTORM [59]、RapidSTORM [30]。这些软件以其
承载的新特性丰富了 STORM的内涵，同时扩大了
STORM能够解析的问题的范围。
4.2　光学设计
由于设计、加工以及组装精度的制约，光学成
(3)
(5)
任煜轩，等：超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究第12期 1263
像系统不可避免地存在像差。在更精细的超高分辨
率显微镜实验中，需要采用自适应光学系统对这些
像差进行消除。通过光束调制很容易生成一些具有
无衍射特性的光束，如贝塞尔光、艾里光以及片层
光，利用这些光束做照明构建超高分辨显微镜将
会有巨大的应用前景 [60]。此外，通过对光束相位进
行调制可以按设定的需求对点扩散函数进行整形，
并衍生出一个学科分支，点扩散函数工程 (PSF
engineering)。通过点扩散函数工程，可以将聚焦光
斑整形成具有一定结构，如笼状、立体螺旋，或具
有更精细更长的焦斑。
2014年，威廉 ·莫尔纳组采用自适应光学手段
对点扩散函数进行优化，实现在更大轴向范围内进
行 3D高精度空间定位实验 [61]。这些点扩散函数还
可以直接运用到单粒子追踪 (SPT)上。这些技术开
启了前所未有的探索细胞结构和功能的可能性。优
化的单分子三维定位评估带噪声的、有像差的、或
者操纵的 PSF成像 [62]。研究表明，通过光学器件
的合适的点扩散函数操控，可以改善 3D定位的计
算和精度。为获得每个分子的位置，采用相位搜索
算法实现最大似然估计。用螺旋形焦斑可以对单个
闪烁的荧光分子定位，实现扩展的生物结构的三维
纳米尺度成像 [63]。
在基于单分子定位的荧光显微镜中，为实现对
多种荧光蛋白进行同时定位和成像，而且在不同实
验中所采用荧光蛋白的激发波长也有差异，这就需
要采用的设备具有多种波长的激发光，且能够方便
地在这些波长之间切换。一个解决办法是利用 Ar+
离子激光器具有多输出光谱线的特性，能够选择合
适的波长做定位实验。另一种实现办法是通过声光
调制器 (AOTF, acousto-optic tunable filters)将多个波
长的激发光耦合到一根光纤中，通过 AOTF在不同
波长激发光之间进行切换并控制激发光的功率来实
现多波长激发光的切换。
4.3　荧光染料与生化修饰
超高分辨率显微镜能够分辨细胞内部结构，
离不开荧光染料的修饰和标记，如获 2008年诺贝
尔化学奖的绿色荧光蛋白 (GFP)。诺贝尔化学奖得
主钱永健 (Roger Y. Tsien)还拓展了可用于标记其他
颜色的荧光蛋白，可对目标蛋白进行多色荧光标记，
使得同一时间跟踪多个蛋白成为可能。2002年，施
瓦茨 (Lippincott-Schwartz)等发现光敏绿色荧光蛋
白，为 PALM成功实现奠定良好的基础。而 STORM
首次采用光敏荧光染料作为光开关。对比几种超高
分辨率显微技术发现，SIM不依赖于荧光素的物理
性质，它几乎适用于所有传统荧光成像的探针；而
STED对多色荧光成像缺少灵活性，目前报道的多
色荧光只有两种颜色；在 STORM和 PALM技术中，
荧光分子需要具有亮态和暗态，且在一定波长活化
光作用下可发生转变。光可切换荧光探针大致可分
为两类：一类是荧光蛋白，如 PA-GFP、PS-CFP2、
mEos2、eYFP、PA-mCherry等；另一类是有机合成染料，
如 Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa Fluor 647、Rhodamine
等。其中，PA-mCherry [64]和 mEOS2 [65]蛋白具有
优异的性能得到了广泛的应用。荧光探针还可以通
过间接标记连接到蛋白上，如 Trimethoprim标记 [66]、
SNAP tag标记 [67]，能够直接在活细胞中标记蛋白，
和明场快速切换探针结合，从而实现活细胞中快速
3D定位，定位精度可达 25 nm[29]。此外，还可以用
更小的探针，如纳米棒 [68]或适体 [69]，或通过 DNA
核苷酸来标记，如条码 [70]、序列标记 [71-72]可以对
目标蛋白和核酸进行多重标记。
5　小结
超高分辨率显微技术是物理工程技术与生命科
学结合的产物，它为生物化学家提供一个从纳米尺
度研究生命科学现象的工具。越来越多的物理技术
会助推生命科学研究，如诺贝尔化学奖获得者贝齐
格 (Eric Betzig)近期又采用晶格片层光实现超高分
辨率显微镜 [73]，能够对分子以及胚胎进行高时空精
度的成像。我们有理由相信会有更多的技术会被用
来改进、完善和充实超高分辨率显微技术，更好地
为生命科学服务。

致谢：感谢蔡司、尼康、莱卡等显微镜供应商技术
工程师提出许多有益的建议。
[参　考　文　献]
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