全 文 ： 生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
以 gfp 为报告基因研究蛋白亚细胞定位
夏玉凤
(河北师范大学 生命科学学院,石家庄 050016)
摘 要: 以 g f p 作为报告基因研究了烟草中蛋白亚细胞定位。就表达系统选择、蛋白亚细胞定位软件分析、
载体构造、材料选择等问题作一简要总结。
关键词: gf p 融合蛋白 亚细胞定位
Experience of gf p as A Report Gene to Study Subcellular Localization
Xia Yufeng
( Coll eg e of L i f e S ci ence , H eBe i N or mal Unive rsi ty , S hij iaz hu ang 050016)
Abstract: GFP is w idely used as a r epo rt g ene to study prot ein subcellular localizat ion. Targ et g ene fused at
the 5( or 3) end of the gr een fluor escent pr otein ( GFP) coding sequence w as int roduced and stably expressed in to
bacco t o study subcellular lo cat ion. Vect or construction, obtainat ion o f t ransgenic tobacco and fluor escence det ection
were summarized. W ish it helpful to r eader s.
Key words: gf p Fusion pro tein Subcellular localization
蛋白质在细胞内的定位问题是细胞生物学研究
的中心问题,也是分子生物学研究的热门话题。观
察细胞的胞器、蛋白或细胞动态对于理解细胞生理
事件是很有帮助的。
用染色方法对蛋白定位, 由于非特异性、染料扩
散或细胞毒性等原因可能会影响结果的可靠性。研
究蛋白的亚细胞定位可采取其它的多种方法, 比如
蔗糖密度梯度离心; 多糖序列分析; 与 gf p 构建融
合基因,用荧光显微镜观察;免疫荧光; 免疫胶体金
标记等。
gf p 用作报告基因有众多优点。 比较稳定
并且分子量小, 易于与其它目的基因构建在一起表
达融合蛋白。 灵敏度高,易检测并且是活体检测,
对组织细胞不具破坏性。 在活体内表达不受生物
类型、基因型、细胞和组织类型的限制。不需任何
底物和外源辅因子参与 [ 1]。随着 GFP 在植物中的
应用和改进,越来越多的研究人员用 gf p 作报告基
因研究细胞生理事件。由于 GFP 单克隆抗体可以
购买到, 给目的蛋白加上 GFP 标签后, 可以使用
GFP 单克隆抗体以免疫胶体金标记的方法对目的
蛋白进一步精确定位, 非常方便,也免去了专门为目
的蛋白制备抗体的繁琐步骤。尽管 gf p 用作报告
基因存在一定的局限性(比如 GFP 的检测受背景
荧光和光漂白现象的限制) ,但鉴于它在生物学研究
中的极大优越性, 选择 gf p 作为报告基因来研究目
的蛋白的亚细胞定位, 在研究过程中,总结了一些经
验和体会。
1 表达系统的选择
有人用基因枪法转化洋葱表皮细胞, 观察蛋白
的亚细胞定位 [ 2]。我们也曾经尝试用农杆菌法转化
洋葱表皮作瞬时表达, 但最终未得到有明显荧光的
细胞。
Akane Kam igaki等人( 2003年)使用瞬时表达
和稳定表达这两个表达体系来研究 CAT1 ( cata
lase1,一种定位在过氧物酶体的蛋白)系列缺失区
段的亚细胞定位, 却得到了相互矛盾的结果。
Akane Kamigaki建议,瞬时表达系统不太适合定位
信号研究。他们认为在瞬时表达系统,蛋白表达过
收稿日期: 20060208
作者简介:夏玉凤( 1972 ) ,女,博士,讲师,主要从事分子生物学领域植物基因工程研究。Tel: 031186617065; Email: tw eiyi@ sohu . com
量可能会造成蛋白从胞器溢出 [ 3]。因此, 使用了稳
定表达系统研究目的蛋白的定位。
2 软件分析蛋白的亚细胞定位
做亚细胞定位实验之前, 人们往往先使用软件
来分析蛋白可能的定位区域。PSORT ( Predict ion
of Protein Localizat ion Sites)是专门分析蛋白的亚
细胞定位的软件。软件分析可以给我们提供理论预
测。有时候,对于同一个蛋白, 用不同的软件分析,
结果可能会有很大不同, 甚至软件分析无法给出建
议,所以具体的定位还需要实验验证。比如, 拟南芥
的乙烯受体 ETR1具有跨膜区域,有结合乙烯并定
位在膜上的功能。然而序列分析没有提供 ET R1
定位在何种膜系统。通过两相分离( aqueous tw o
– phase part it ioning )以及蔗糖密度梯度离心和免
疫电镜技术检测到 ETR1 主要存在于内质网。
ETR1没有信号肽序列, 也不具有内质网定位信号
( KKXXCOOH, K( H ) DEL) ,也许它具有人们还没
有发现的定位到内质网的信号序列 [ 4]。
研究的 PF40蛋白,经软件分析, 认为它可能位
于内膜系统, 但软件分析没有确定 PF40定位在哪
种膜系统。我们选用农杆菌介导转化烟草这个稳定
表达系统来研究目的蛋白的亚细胞定位。
3 载体构建
可以用两种方式将目的基因与 gf p 融合: (1)
将 gf p 置于目的基因后面, 即目的基因gf p。(2)
将 gf p 置于目的基因前面, 即 g f p目的基因。两
个基因之间用六核苷酸的酶切位点连接。有的研究
人员,喜欢在两个基因交接处增加一段核苷酸( 3的
倍数) ,比如增加几个为甘氨酸或赖氨酸等编码的三
核苷酸,目的是使得两个基因的蛋白产物的空间结
构相互影响较小,有利于 gf p 发光。注意前一基因
必须要有起始密码, 而不能带有终止密码;后一基因
要保证有终止密码。构建了融合基因后, 必须测序
进行验证,确保融合基因读框正确之后才能进行后
续研究,以免浪费人力、物力和宝贵的时间。将融合
基因克隆至合适的表达载体 (比如 pBI121) , 以农
杆菌介导法转化烟草。
水稻的 CaM 类蛋白 OsCaM61,含有 N端 CaM
区域, C 端有异戊二烯化位点。将 OsCaM 61 与
GFP 融合起来, 研究其亚细胞定位。结果发现
GFP OsCaM 61 融合蛋白是膜结合的, 而 Os
CaM 61GFP 却主要在核质。前者 C 端的异戊二烯
化位点被掩盖而后者的位点是活跃的。此蛋白的异
戊二烯化状态对于细胞定位起决定性作用。用
mevinolin处理细胞, 阻止类异戊二烯合成, 引起
GFP OsCaM 61 运输到核质。亚细胞定位依赖于
蛋白的异戊二烯化状态,表明在不同的生理条件下,
这种 CaM 可能通过结合到定位于不同细胞成分的
靶子上, 起到不同的功能作用[ 5]。因此,研究两种方
式的融合基因,对于理解目的蛋白的功能可能会有
一定的帮助。
4 材料选择
在材料选择上, 由于烟草根部受叶绿体的自发
红色荧光干扰较少, 适合进行荧光观察;另外,用根
为材料进行免疫胶体金标记法进一步精确研究蛋白
定位,在实验操作方面也很方便,所以我们想使用成
苗的根进行研究。但从转化的烟草叶片开始至长成
小苗并出现根,需要 2~ 3 个月时间,比较耗时。为
避免冒险,我们欲选用愈伤组织进行检测,从而了解
构建的表达载体是否能在转化材料中表达。通过摸
索组培条件,我们得到了质地疏松柔软的白色愈伤,
适合荧光观察。在较短时间内, 检测出载体能够表
达,为后续实验打下坚实的基础[ 6 ]。
在烟草根的选择上,尽量不使用又细又长的生
长时间较长的根。如果转基因烟草在培养基上生长
时间过长,则根可能会发软变烂,这样的根更不能使
用。生长约 2~ 3厘米的粗壮白嫩的根,检测效果较
好。在取转基因烟草根部部分酶解后进行压片, 荧
光观察, 发现转基因烟草根有明显绿色荧光。但细
胞之间离散的不够充分, 有的细胞有重叠, 另外, 细
胞壁也对荧光观察有一定影响。为进一步了解荧光
的发光部位,将根尖切成 0. 5cm 小段, 置酶解液酶
解 5小时,得到原生质体。对原生质体进行荧光观
察,能够清晰的观察到胞内荧光,确定了 PF40是定
位在内质网[ 7] 。
以 gf p 作为报告基因研究蛋白亚细胞定位,必
须做对照。植物材料本身也有自发荧光, 认真识别
自发荧光与 gf p 的绿色荧光, 以免假象干扰实验,
避免得出错误结论。
12 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
5 转基因植物的群体
并不是所有的构建正确的融合基因都能正常表
达。在转化植物后, 要尽可能多的获得转基因植株,
如果植株数目较少, 可能会检测不到荧光。外源基
因表达量不足, 也往往导致检测失败。有人使用
35SET R1GFP 载体进行瞬时表达, 由于胞内聚集
很多的荧光而不能给出确切定位;而在拟南芥中进
行稳定表达时, 却因为荧光太弱而没有确切结果 [ 4]。
基因表达量与启动子的活性有很大关系。在我们的
实验里,使用了 35S promoter.而有不少人使用活性
更强的 35S promo ter 双启动子等。表达成败还跟
基因插入位点有关。在获得的再生苗中, 有一部分
苗没有发生外源基因的转入, 而转基因苗中也有一
部分苗会因为位置效应等原因没有表达或表达的强
度很弱。在实验里, 转化 GFP的植株较容易检测到
荧光, 10棵转基因植株中有 5棵能检测到较强的荧
光;而在转融合基因的烟草中, 情况就不是这样乐
观。在得到的 13棵转 pBIGFPPF40的植株中, 虽
然有 7棵能够发出荧光, 但荧光较弱,不能对蛋白进
行精确定位, 在 16棵转 pBIPF40GFP 的植株中,
尽管有 10棵能够发出荧光, 但只有 3棵荧光较强,
可以进行亚细胞定位观察 [ 6 ]。据分析, 有可能目的
蛋白与 GFP 融合后, 会对 GFP 空间折叠有所影
响,从而影响 GFP 的发光。我们认为, 以 GFP 为
报告基因进行蛋白亚细胞定位研究时, 尽量获得较
多的转基因植株, 以增加成功的机率。
参 考 文 献
1 汪恒英,周守标,常志州,等.生物技术, 2004, 14( 3) : 70~ 73.
2 S cot t A, Wyat t S, T souP L, et al. Biotechniques, 1999, 26:
1125~ 1132.
3 Akane Kam igak i, Shoji Mano, Kaori Terauchi, et al. Plant Jour
nal, 2003, 33: 161~ 175.
4 YiFen g C hen, M elynda D. Randlett , Jennifer L. Findell , et al .
th e Journal of Biological Chem ist ry, 2002, 277: 19861~ 19866.
5 Aiw u Dong, H ua Xin , Yu Yu, et al . Plant Molecular Biology,
2002, 48: 203~ 210.
6 夏玉凤. pf40 基因产物的亚细胞定位以及其功能研究[ 学位论
文] .北京:中国农业大学生物学院 2005.
7 夏玉凤,赵倩,于静娟, 等.生物化学与生物物理进展, 2005, 32
( 11) : 1020~ 1025.
信息交流
美国家人类基因组研究所将 18种生物列为测序对象
Science New s 2004年 166卷 7期 109页报道: 美国马里兰州贝塞斯达市美国国家人类基因组研究所
( NHGRI)的生物学家 Adam Felsenfeld最近宣称 NHGRI 已从整个生命树的各个支干的种系中精选出了
18种有代表性的生物,作为今后基因组测序的重点对象。
这 18种生物包括:海七鳃鳗, 据悉其祖先可能是最早的脊椎动物之一; 9 种哺乳动物, 即:非洲萨凡纳
象、猩猩、九带犰狳、家猫、欧洲刺猥、兔、豚鼠、小多刺无尾猬和欧洲普通鼩鼱;两种人类的卫生有害动物,即
可从未煮熟的猪肉传播到人的毛形线虫( T richinel la) , 以及可传播血吸虫病的寄生吸虫的宿主 淡水双
脐螺( Biomphalar ia) ;包含扁盘动物( P lacozoa)在内的三种微生物, 已知由于扁盘动物很奇特, 所以某些分
类学家将其单独列为一个门;此外,还有三种生物,即:另一种线虫、水螅(含珊瑚)以及粘菌。
除了上述 18种新选定的生物外,在 NHGRI 的资助下, 此前美国已经开始对袋鼠、牛、赤拟谷盗和几种
果蝇的基因组进行了测序工作。 汪开治
132006年第 2期 夏玉凤: 以 gf p 为报告基因研究蛋白亚细胞定位