全 文 ：第26卷 第3期
2014年3月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 26, No. 3
Mar., 2014
文章编号：1004-0374(2014)03-0270-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2014040
高通量组织特异表达谱分析技术
刘　晓
(清华大学生命科学学院，北京 100084)
摘　要：测量基因表达谱是研究动物如何发育和应对刺激的重要途径。基因表达谱实验检测的 RNA通常
来自多种细胞的混合体。这样的数据具有较低的分辨率，不能区分动物体内不同细胞类型的转录组，而且
会偏袒 RNA含量占优势的组织以及上调的基因。这个问题可以通过获得特异组织的 RNA进行表达谱分析
来实现。这十几年来已有多种方法被开发出来获取特异的细胞类型或它们的 RNA，并与高通量 RNA分析
技术结合起来生成各种特异组织或细胞的转录组。本综述将介绍这些方法的基本原理和在大尺度表达谱分
析中的应用，并讨论它们各自的优点和局限性。
关键词：组织特异；基因表达谱；功能基因组技术；细胞标记；RNA标记
中图分类号：Q786 文献标志码：A
Technologies of high-throughput tissue-specific gene expression profiling
LIU Xiao
(School of Life Science, Tsing-Hua University, Beijing 100084, China)
Abstract: Gene expression profiling is an important strategy to study animal development and response to stimuli.
RNAs measured in gene expression profiling experiments are frequently purified from mixture of multiple cell
types. The resultant data have low resolution, incapable of distinguishing transcriptome of different cell types and
likely biased to up-regulated genes in dominant tissues. These problems can be solved by obtaining tissue-specific
gene expression profile. For a dozen years, there have been several strategies developed to isolate specific tissues or
purify RNAs from tissue of interest, and combined with high-throughput RNA assays to generate transcriptome of
various specific tissues or cell types. This review will introduce basic principles of these methods and their
application in large-scale transcriptome analysis, and discuss on their advantages and limitation.
Key words: tissue-specific; gene expression profile; functional genomic technique; cell labeling; RNA labeling
收稿日期：2013-10-08； 修回日期：2014-03-05
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)(2013CB945600)
*通信作者：E-mail: xiaoliu@tsinghua.edu.cn
刘晓实验室从功能基因组学和系统生物学角度，主要以线虫神经系统
为模型，研究细胞命运决定和进化的分子机制。目前重点在线虫建立单细
胞精度的基因表达谱，构建以转录因子和 lncRNA为核心的基因调控网络，
并揭示它们在神经细胞命运决定中的作用，认识神经系统多样性的分子发
育基础。为实现这一目标，我们开发和利用多种高通量实验方法，包括组
织特异转录组技术和单细胞精度线虫影像分析系统。同时，我们开发基因
组学技术，高效组装非模式动物的基因组。通过开发非模式动物的基因组
和遗传资源，开展进化发育生物学研究。
刘晓 教授
刘　晓：高通量组织特异表达谱分析技术第3期 271
动物是由多种组织和细胞类型构成的有机体。
这些细胞的分裂分化、相互作用和对环境的反应需
要通过改变它们的基因表达调控程序改变转录组。
因此获得各组织的转录组是认识动物如何发育和产
生疾病所必需的。虽然原位杂交、免疫组织荧光和
报告基因能够高分辨率地鉴定基因表达的组织特异
性，这些实验花费高、工作量大，尤其是影像分析
尚不能高度自动化，很难高通量获得准确量化的基
因表达数据 [1-3]。随着基因组学和功能基因组学的
兴起，各种大尺度表达谱分析方法被开发出来，包
括基因芯片 (microarray)、RNA深度测序 (RNA-seq)
和染色质免疫共沉淀并深度测序 (ChIP-seq)。这些
方法使得研究人员可以在全基因水平分析基因表达
谱和基因表达的转录启始调控机制 [4-6]。虽然这些
方法可以鉴定出成百上千差异表达或可能被特定转
录因子调控的基因，这些候选基因的生物学意义和
调控机制经常很模糊。这其中的一个重要原因是这
些实验的样品通常是动物的某一部分，甚至是整个
个体，换句话说是多种类型细胞的混合体。因此，
研究人员无法轻易区分这些基因表达变化发生在哪
些细胞。如果某类细胞在样品中占的比例少，它们
的基因表达变化则不易被检测到，尤其是那些表达
量下调的基因。
这些年功能基因组学领域开发出一些技术能够
有效地获得组织特异的转录组，包括细胞分选、以
及共价和非共价 RNA标记。单细胞测序在本专刊
由汤富酬撰写，本文不详细讨论。除了介绍这些实
验技术的基本原理和应用状况。本文还会讨论这些
组织特异转录组技术各自的优点和局限性，以及它
们的适用范围。
1　细胞分选
获取动物组织特异转录组最常用的方法是把
样品组织块解离成单细胞，再利用组织特异表达
的荧光蛋白转基因或者是细胞表面特异抗原的抗
体通过荧光激活细胞分类术 (fluorescence-activated
cell sorting, FACS)收集目的细胞，最后对纯化的细
胞进行表达谱分析。利用细胞分选策略的方法还包
括人工分离 [7]、激光显微切割 [8]和单细胞深度 RNA
测序 [9]。细胞分选法不但在体外培养的细胞系和哺
乳动物样品中广泛使用，对小型模式动物也可以成
为一种有效的手段。例如为了鉴定负责秀丽杆线虫
机械感受神经元分化的基因，Martin Chalfie实验室
尝试对比野生型线虫和机械感受神经元缺陷型线虫
的转录组 [10]。然而一条成年秀丽杆线虫雌雄同体有
959个体细胞和数千生殖细胞，而其机械感受神经
元只有六对。所以分析整个虫体的 RNA无法鉴定
出在野生型和突变型间表达有显著差异的基因。为
了特异地获得机械感受神经元的表达谱，Martin
Chalfie实验室生成了特异在机械感受神经元表达绿
色荧光蛋白 (GFP)的转基因线虫，分别把携带这个
报告基因的野生型线虫品系和机械感受神经元缺陷
型线虫品系的胚胎解离成单细胞。通过体外培养过
夜，部分被培养的胚胎细胞分化成类似体内机械感
受神经元的表达 GFP的细胞。用 FACS分选出表达
GFP的细胞，对其 RNA进行生物芯片分析，鉴定
出 19个非常显著地在突变型细胞里下调的基因，
包括已知的 11个机械感受神经元表达基因中的 7
个。对 12个未知基因的进一步研究鉴定出负责维
持机械感受神经元基因 mec-17[10]。
虽然细胞分选法非常有效，但其需要把样本组
织块分解为大量单个细胞。而某些样品不能满足这
一点，例如成体秀丽杆线虫。为此，Steven Henikoff
开发了特异细胞类型标记细胞核分离法 (isolation of
nuclei tagged in specific cell types, INTACT)(图 1)直
接从动物体内通过亲和纯化收集特异组织的细胞核
以分析转录组和染色质结构 [11]。 INTACT利用了大
肠杆菌的生物素连接酶 (BirA)能将生物素连接到生
生物素连接酶birA和与生物素接受肽BLBP融合的细胞核表
面蛋白表达在特异细胞里，使得目的细胞核表面特异地共
价连接生物素。利用生物素亲和层析收集的细胞核可以进
行高通量RNA和DNA分析。
图1 特异细胞类型标记细胞核分离法示意图
第26卷272 RNA研究的新技术和新方法专题
物 素 连 接 酶 识 别 肽 链 (Biotin ligase recognition
peptide, BLRP)这一生化特性，将 BLRP融合在表
达在核包被的蛋白上，如暴露在细胞质的核膜孔复
合物蛋白。这个融合蛋白就是细胞核标记融合蛋白
(nuclear tagging fusion, NTF)。通过转基因，利用组
织特异启动子把细胞核标记融合蛋白 NTF和生物
素连接酶 BirA共表达在目的组织中，使其细胞核
外表面表达 NTF并且连接上生物素。提取这些转
基因动物的完整细胞核，利用亲和层析把携带生物
素标记 NTF的细胞核纯化出来。这种组织特异的
细胞核不但可以通过分析其 RNA研究其转录组，
还可以对其基因组进行表观遗传学分析 [11]。组织特
异转录组和表观遗传组的结合为研究基因表达调控
机制提供了独特的资源。虽然实验过程比较复杂，
INTACT已成功地在多种模式生物中使用，包括线
虫、果蝇和拟南芥 [11-13]。
2　RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,
RIP)
RIP是一种研究 RNA蛋白质在体内相互作用
的方法。通过交联剂处理把细胞内空间距离很近的
大分子交联起来，再利用抗体把特异的蛋白质和与
其交联的 RNA通过亲和层析分离出来，从而鉴定
出与特异蛋白结合的RNA[14]。多聚A结合蛋白 (Poly
A-binding protein, PAB)可以结合所有 mRNA，把
PAB表达在特异组织并作 RIP分析就可鉴定目的细
胞的转录组。这种 PAB-RIP法是第一个通过标记
RNA研究组织特异转录组的方法，最先用来研究
秀丽杆线虫肌肉特异转录组 [15]。PAB-RIP法非常灵
敏，甚至可以研究单细胞精度的基因表达谱。秀丽
杆线虫有两个神经元，ASEL和 ASER负责味觉感
受。虽然这对细胞在解剖位置上左右对称，但是它
们表达不同的化学受体，而且感受不同的小分子。
ASEL感受钠离子而 ASER感受氯离子。为了研究
ASE神经元左右不对称的分子机制，Lino实验室构
建了两个转基因线虫品系，分别在 ASEL和 ASER
神经元表达有 FLAG肽链标记的 PAB。利用 FLAG
抗原决定簇亲和层析，与 FLAG-PAB交联的 mRNA
被纯化。生物芯片分析鉴定出 188个左右不对称表
达的基因，包括 13个已知在 ASEL和 ASER差异
表达的基因中的 8个。进一步实验核实了 9个新的
左亚型和右亚型特异基因，包括倾向于在 ASER表
达的神经肽类基因 nlp-5和 nlp-7。分别检测 nlp-5
和 nlp-7单突变体没有发现显著表型，然而 nlp-5和
nlp-7双突变体线虫表现出一定的盐趋化性缺陷，
提示这两个基因功能冗余。另外，对倾向于在
ASEL表达基因的启动子序列分析，发现它们的表
达都受细胞特异转录因子 CHE-1调控 [16]。
PAB-RIP法简单灵敏，在秀丽杆线虫功能基因
组研究中广泛使用。比如模式生物 DNA因子大百
科全书计划 (model organism ENCyclopedia Of DNA
Element, modENCODE)用 PAB-RIP测量了 15个在
不同发育时期的组织转录组 [17]。对海量的组织特异
转录组的计算分析揭示了基因调控网络新性质。例
如，75%的基因被发现具有不同程度的时空表达特
异性，包括大量持家基因。以这套数据为基础还鉴
定出超过 200个长链非编码 RNA (long non-coding
RNA)，而且绝大部分都显示组织表达特异性 [18]。
对 modENCODE的组织特异转录组数据的自组织
图谱分析 (self-organizing map)鉴定出大量共表达基
因。对它们启动子和 mRNA的 3非翻译区的序列
分析准确预测了 DNA调控序列和 miroRNA结合位
点 [17]。总之，通过 PAB-RIP产生的大尺度组织特
异转录组数据结合计算分析构建了高精密度基因表
达图谱，为构建基因的调控网络和鉴定其生物功能
奠定了基础。
3　共价RNA标记
原生动物存在一些多细胞动物没有的核苷酸合
成代谢酶，可以把核苷类似物加工成 RNA可以识
别的核苷酸类似物，从而整合到 RNA当中。通过
转基因把这些核苷酸合成代谢酶表达在真核生物细
胞内并施加核苷类似物，这些核苷类似物就可以通
过参与真核细胞的 RNA合成代谢从而掺入其
RNA。这样，这些核苷类似物可以用作 RNA标记
以区别于不表达这些核苷酸合成代谢酶的细胞合成
的 RNA。目前使用最广泛的是 Toxoplasma gondii
的尿嘧啶磷酸核苷转移酶 (uracil phosphoribosy-
ltransferase, UPRT)。UPRT能够把尿嘧啶类似物 4
硫尿嘧啶 (4-thiouracil, 4tU)转化为 4tUMP，从而最
终掺入到 RNA中 [19]。哺乳动物和昆虫没有 UPRT
活性，因此 4tU可以在这些动物中用作标记 (图 2)。
因为不需要分离单个细胞，4tU标记法首先使用在
不易解离的果蝇组织上。比如果蝇的神经胶质细胞
在脑中分散，而且具有复杂的形态，很难通过组织
解离收获大量完整的细胞体。为了鉴定神经胶质细
胞特异的基因，Chris Doe实验室生成由神经胶质
细胞特异启动子驱动的 UPRT转基因果蝇 [20]。实验
刘　晓：高通量组织特异表达谱分析技术第3期 273
表明，在果蝇细胞里仅表达 UPRT就足以改变其核
苷酸合成代谢途径，使转基因细胞可以利用 4tU作
为合成 RNA的原料。而且 UPRT转基因的表达和
4tU的掺入没有显著影响果蝇的生长发育和行为。
给转基因幼虫喂食含有 4tU的食物融合，然后纯化
整个果蝇的 RNA，通过硫酯键使生物素与 4tU共
价结合使掺有 4tU的 RNA标记上生物素，最后通
过对生物素亲和层析纯化的 biotin-4tU-RNA进行生
物芯片分析。由于 4tU只掺入到 RNA序列中 U的
位置，富含 U的 RNA序列就倾向于被富集。计算
分析时通过对 U的数目进行线性回归过滤掉了这种
倾向性。最后，这个实验鉴定出大量幼虫神经胶质
细胞富集的基因，其中已知的 4个神经胶质细胞特
异基因属于前 3.2%富集的基因 [20]。
4tU标记不但需要组织特异的 UPRT表达，还
依赖外源的 4tU给药。这使研究者可以结合 UPRT
表达的组织特异性和 4tU给药的时间特异性研究特
异组织转录组的动态变化 (图 2)。即使对组织解离
相对容易的哺乳动物，细胞分离法也很难获得大量
真实反映体内应对某种刺激的特异细胞类型。比如，
对注射了 LPS的小鼠脾脏进行转录组分析可以鉴定
出大量 LPS反应基因，但不知道哪些基因代表哪些
细胞的反应。为了分析小鼠脾内皮细胞对 LPS的反
应，Chris Doe实验室构建了特异在脾内皮细胞表
达 UPRT的转基因小鼠 [21]。给小鼠施加 4tU后 1 h
注射 LPS，3 h后收集脾 RNA，生物素纯化 4tU标
记的 RNA后进行 RNA-seq分析，鉴定出 97个脾
内皮细胞的 LPS-诱导基因，包涵 24个以前全脾转
录组分析鉴定出的被 LPS诱导的基因。对显著被
LPS诱导的脾内皮细胞进行 GO分析，发现这些基
因高度富集免疫反应相关基因，包括“防卫反应”、
“先天免疫反应”及“细胞因子 (cytokine)激活反
应”[21]。
4　讨论
动物体是由多种细胞构成的混合体。因此对动
物整体或大组织块样品的 RNA分析会失去组织特
异的信息。为此，科研人员开发了各种检测组织特
异转录组的功能基因组学方法。对于可以在体外培
养的细胞和易解离的哺乳动物组织样品，通过
在特异细胞表达UPRT，并且在特定时间加入4tU使得只有目的细胞在限定时间能将4tU掺入RNA。对纯化的RNA进行化学处
理使4tU与生物素耦联，再利用生物素亲和层析收集掺入了4tU的RNA。
图2 4tU RNA脉冲标记法获得时空特异转录组
第26卷274 RNA研究的新技术和新方法专题
FACS分选特异细胞类型是最广泛使用的手段之一。
单细胞 RNA深度测序目前在哺乳动物细胞的研究
发展很快。但由于线虫和果蝇细胞的 RNA丰度低，
目前还不能实现有效的单细胞测序。而显微切割和
特异细胞类型标记细胞核分离法可以用于不易解离
成单细胞的组织。但这种细胞分离策略都需要长时
间处理组织，改变其微环境，很可能改变了细胞的
基因表达程序。还有，细胞分离法容易损伤细胞的
特化结构，如神经的轴突和树突，从而丢失位于这
些结构的 RNA。而共价或非共价标记纯化特异组
织的 RNA则可以很好地解决这些问题。RNA标记
更大的优势在于其不需要解离组织块，所以能在线
虫果蝇这些小型模式动物中广泛使用，与它们高度
发达的遗传学研究结合起来构建基因调控网络，探
索其生物功能。由于其操作简单、检测灵敏，PAB-
RIP是线虫功能基因组研究的主要手段之一。但是
RIP实验需要交联这一步骤，其数据不可避免地具
有较高的噪音。而且 PAB-RIP只能研究具有 PolyA
的 RNA分子，不能检测大部分非编码 RNA。以
4tU为代表的代谢物共价标记法则没有这些限制。
而且由于代谢物共价标记需要施药这一步骤，使研
究者能够检测特异组织应对特异刺激的转录组反应
以及 RNA的生成和降解等动态过程。不过，4tU
共价标记法需要研究对象能够摄入核苷类似物，所
以不能应用到所有模式动物上。比如目前秀丽杆线
虫没有成功的组织特异 4tU共价标记的报道。最近，
我们实验室开发了一种利用反式拼接标记 mRNA
获得线虫组织特异转录组的方法。线虫 70%编码
基因的 pre-mRNA 会与拼接导链 (splicing leader,
SL) RNA发生反式拼接，使 mRNA的 5’端获得 SL-
RNA的 22个碱基。我们在 SL-RNA基因的 5’端加
一个标记序列，用组织特异启动子驱动被标记的
SL-RNA基因的表达，使得目标组织的 mRNA拼接
上标记序列。对携带标记序列的mRNA高通量测序，
就获得了目标组织的转录组 (未发表 )。总之，这
些功能基因组方法各有千秋，需针对研究对象的特
点和生物学问题选取合适的组织特异转录组检测
方法。

[参　考　文　献]
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刘　晓：高通量组织特异表达谱分析技术第3期 275
刘晓报告讨论
付向东 ( 加州大学圣地亚哥分校 )
Q：建立秀丽隐杆线虫的组织特异性 mRNA标记时，需要将启动子扩增多少碱基的长度才能保证组织
特异性？
A：2~2.5 kb。因为线虫的基因组有 1亿个碱基，2万个基因，那么平均到每个基因就是 5 kb，除去内
含子和其他非编码序列，那么大概是 2~2.5 kb的大小。而从我们实验的结果来看，对于那些表达比较复杂
的基因，如转录因子，一般需要 5~7 kb才能比较完整的鉴定出来。
Q：那么对于不同的基因，你们就需要去尝试扩增不同长度的启动子，以保证能检测出组织特异性？
A：我们扩增的时候有两种解决的方案，一般我们都尽量扩增出长些的片段，当然受限于 PCR扩增的
效率，我们能保证的是在 5 kb内都有良好的扩增效果，对于超过 5 kb长度的序列，扩增效果就不是很好。
另一个就是根据已有的测序资料，找到那些比较保守的区域。
Q：那么当你扩增的片段过长的时候也有一个问题，因为启动子自身的分布比较分散，就可能两个启
动子相距比较近的时候，你都把这个两个基因扩增进去，那么你测序的结果就不能反映这两个基因的组织
特异性？
A：我的这个系统中，在报告基因的上游只有一个启动子，那么我们就能保证绝大多数的基因都是组
织特异性的表达，当然有可能存在就是由于扩增太长而添入其他启动子，但这毕竟是极少数的，我们只要
能保证我们获得的绝大多数结果都是组织特异性的就可以了。
沈晓骅 ( 清华大学生命科学学院 )
Q：其实现在已经有了单细胞的测序方法。而你使用的 SL-RNA方法现需要去鉴定启动子，然后又将
其导入线虫的不同阶段的 1 000多个细胞，再去鉴定它的基因表达，操作就很复杂。那单细胞的测序方法
不是更简单方便？
A：对于单细胞测序，我也想过这个问题，但是线虫有个特点，细胞只有哺乳细胞的 1/9，那么同样的
细胞就需要有 9个，那么就需要去从 9个线虫中，取 9个相同的细胞，这本身就是一件很有难度的事，最
重要的是还需要保证这 9个细胞的同步性，这样 9个细胞内的转录组才会一致，否则就是将处在不同发育
状态的细胞合并测序，获得的结果也就不能很好地反映组织特异性。
cell type-specific RNA isolation from intact complex
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