全 文 ：食品级高效诱导表达系统 NICE系统
徐波 曹郁生
(食品科学教育部重点实验室 南昌大学中德联合研究院, 南昌 330047 )
摘 要: 乳酸菌 NICE 系统是在乳链菌肽诱导下由 nisA 启动子控制目的基因表达的, 含 nisR 和 nisK 的两
组分调节系统的高效诱导表达系统。由于 NICE 系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的, 其应用前景十分广
阔。
关键词: 乳酸菌 食品级 NICE 系统
The Food-Grade Inducible Over-production
Expression System-NICE System
Xu Bo Cao Yusheng
( T he K ey L aborator y of F ood S cience of MOE , N anchang Univ er si t y , N anchang 330047, China )
Abstract: The food-g rade nisin- contr olled expression ( NICE) sy st em o f Lactic Acid Bacter ic ( LAB) is the o-
ver-production and inducible expression system . N ICE system is based on the two-compontent r egulato ry system
cont rolled by the nisA promo ter, tog et her w it h nisin- regulato ry g enes nisR and nisK , that encode t he histidine pr o-
tein kinase N isK and the r esponse r egulato r N isR. T he g reat pr omising application of the N ICE sy st em is due to the
food-g rade inducer N isin, stra ins and vect or.
Key words: Lactic acid bacteria Food-g rade NICE system
乳酸菌( Lact ic Acid Bacter ia, LAB)广泛应用
于食品和工业发酵中,是人类及哺乳动物的益生菌。
最近十年来随着乳酸菌表达调控元件的分离, 相继
发展了一批适用于乳酸菌的克隆载体、表达载体和
整合载体,乳酸菌食品级高效表达系统的构建及应
用已成为研究的热点。
由于密度感受( quorum sensing)现象广泛存在
于乳酸菌中,人们据此开发了乳酸菌的可控制基因
表达系统, 目前最有效的食品级诱导表达系统是
NICE ( The Nisin-Contro lled Expression) 系统, 该
系统在加入诱导物-乳链菌肽( Nisin)后其诱导效率
可达 1 000倍以上[ 1] 。因此, 该系统是可控制的蛋
白质生产的最理想的系统,同时因其良好的安全性,
在工业生产中具有很大的发展潜力。
1 乳链菌肽生物合成基因与 NICE系统的提
出
乳链菌肽是由某些乳酸乳球菌产生的小肽,是
一种广泛应用的高效无毒的天然食品防腐剂。其生
物合成涉及 11 个基因, 以 nisA / Z, nisB, ni sT ,
nisC, nisI , nisP , ni sR, nisK , nisF, ni sE 和 nisG 的顺
序成簇排列在约 14kb的 DNA片段上(见图 1)。其
中 nisR 和 nisK 是两组分调节系统, 并且 3个启动
子中的 nisA 和 nisF 启动子可被乳链菌肽诱导[ 1] 。
因此, Kuipers 等提出了一个乳链菌肽生物合
成自身调节的模型, 即 NICE 系统。与 NICE 系统
相关的是 nisA 启动子和 nisRK 基因, 它们编码一
个两组分调节系统, 并且可用食品级选择标记取代
抗生素抗性标记[ 2] 。目前 NICE 系统已成功地应用
于许多革兰氏阳性菌, 包括乳球菌( L actococcus)、乳
杆菌( L actobaci llus)、链球菌( S tr ep tococcus)、明串
球菌( L euconostoc)、肠球菌( Enter ococcus)和芽孢杆
菌( Bacil lus)等[ 1]。
收稿日期: 2004-11-15
作者简介:徐波( 1970- ) ,男(汉族) ,硕士,在读博士生,电子信箱: xubo583@ sohu. com
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 2期
2 NICE系统的构建及原理
有效的 NICE 系统主要由三个成份构成: ( 1)携
有 nisRK 基因的革兰氏阳性宿主菌; ( 2)作为诱导
分子的乳链菌肽或其类似物及突变体; (3)含有 ni-
sA 或 nisF 启动子片段的质粒,其中含有可导入目
的基因的多克隆位点[ 2] 。
图 1 乳链菌肽生物合成基因簇[1] (P* :可诱导的启动子)
在 NICE 系统中乳链菌肽是作为信号分子起作
用的,它通过一个典型的两组分调节系统诱导乳链
菌肽生物合成基因簇在 nisA 或 nisF 启动子控制之
下进行基因转录。此两组分调节系统由 nisK 和
nisR 基因编码的组氨酸激酶( NisK)和反应调节蛋
白( NisR)构成[ 2]。NisK 识别亚抑制量的乳链菌肽
(〈0. 05ng/ m l〉, 然后作为传感蛋白起作用, 磷酸化
NisR[ 3]。NisR作为反应调节蛋白起作用, 激活 ni-
sA 启动子的转录,使 nisin 操纵子下游的靶基因得
以转录[ 1, 3] ,靶基因通常为诱导分子的结构基因(见
图 2)。此两组分信号转导机制已证明是不依赖转
录活性,由几种主要是细菌素或类似细菌素的自体
诱导物所诱导。NisR的 cis-活性成份经鉴定为 n-i
sA和 nisF 启动子片段 [ 1]。在 NICE 系统中, 表达
图 2 一个根据两组分调节系统基础上构建的乳链菌肽基
因信号转导途径的模型[ 6]
水平可由加入的诱导剂-乳链菌肽的量来控制, 这种
诱导作用与乳链菌肽的浓度在一定范围内成正比
例,诱导效率可达 1 000倍以上。利用 nisA 启动子
和nisR、nisK 基因构建的一系列表达载体和相应的
宿主菌,已于 1996年起开始用于目的基因的表达研
究[ 2 ]。
由于 nisA 启动子可以切除到少于 50bp 的片
段,克隆到一系列的转录和翻译融合载体中 [ 4] , 并且
其转录可受细胞内的乳链菌肽的有效诱导,因此,可
用产乳链菌肽的菌株(如: L . lacti s NZ9700)为宿主
菌,持续表达外源基因, 而不必添加乳链菌肽,另外
可用含有克隆了目的基因的质粒来进行诱导表达。
人们在这些产乳链菌肽的菌株构建中做了适当的改
进,例如 L . lact isNZ3900缺失了 nisI 和 nisFEG 基
因,但保留 nisRK 基因, 以适合乳链菌肽诱导,并且
缺失了 lacF基因以配合 lacF 的选择,使该系统具
有很高的诱导效率 [ 5]。当带有 nisA 启动子及其所
控制的外源目的基因的质粒导入不加乳链菌肽或其
类似物而具有nisR 和 nisK 基因的乳酸菌中时,外
源基因的表达很弱,甚至检测不到。但当对数生长
期时在培养基中加入乳链菌肽( 0. 01 到 10ng/ ml)
后,由 nisA 启动子控制的外源基因的转录被激活,
其表达水平在一定范围内随乳链菌肽加入量成比例
上升, 最高诱导效率可达 1 000 倍以上[ 1, 6] 。由于
L . lacti s NZ9800 能表达免疫基因 nisI FEG, 通过
NisI或别的免疫蛋白从培养基中结合一些乳链菌
肽,可忍受相对高浓度的乳链菌肽,其最高诱导水平
约为 5~ 10ng/ ml, 此浓度是 L . lact is NZ9000的诱
152005年第 2期 徐波等:食品级高效诱导表达系统 NICE系统
导浓度的上限, 故 L . lact i s NZ9000诱导效率比 L .
lact is NZ 9800高。因此 L . lacti s NZ9000是最敏感
的诱导菌株,在诱导 2小时之后,目的蛋白的生产达
到最高约 60%细胞可溶蛋白水平 [ 1]。
最近研究表明乳链菌肽还可控制 nisF 的表达,
但表达水平比 nisA 启动子要低, 因此有可能使用
nisF 启动子代替nisA 启动子[ 2] 。Reunanen等人将
绿色荧光蛋白基因置于 nisF 启动子的控制下从而
构建了含nisRK 的质粒 pLEB599 [ 7] 。
同时人们为了能在其它乳酸菌中使用 NICE 系
统, 还构建了由两个相容的质粒构成的双质粒
NICE 系统:一个质粒携有 nisRK 调节基因,另一个
质粒携有在 nisA 启动子控制之下的目的基因。其
可诱导性与乳酸乳球菌中相同, 但达到最高蛋白质
生产水平的时间明显比乳酸乳球菌长 [ 5, 8]。人们构
建的各种含 nisRK 质粒, 如 pNZ9520, pNZ9521、
pNZ9530和 pNZ9531, 它们转录起始点上都含有
nisR 和 nisK 基因 [ 5]。
在乳杆菌中一些类型Ⅱ细菌素的生产也是由密
度感受机制调节的,此机制不同于乳酸乳球菌的调
节机制。这些乳杆菌分泌一种未修饰的肽, 此肽的
最初功能是作为一个信息素而不是细菌素起作用
的。这些系统中的调节操纵子构成了编码肽信息素
前体,感应信息素的 NisK和调节蛋白 NisR的三个
基因。NisR的激活增强了启动子的转录, 此启动子
位于所有涉及细菌素生产、处理、分泌、免疫和调节
操纵子之前[ 8]。
最近,在清酒乳杆菌素( sakacinP)、植物乳杆菌
素( plantaricinA)和肉杆菌素( carnbacteriocin)生物
合成基因簇中也发现了这种两组分调节系统, 如果
这些细菌素对人体是安全的, 它们都有可能用作食
品级表达系统的诱导物[ 8] 。
3 NICE系统的特点
3. 1 乳链菌肽是一个理想的食品级诱导分子,它高
效安全无毒,能直接用于食品中。
3. 2 可使用染色体上 lacF 缺失并含 nisRK 基因
的乳酸球菌菌株以及含有 nisA 启动子控制之下目
的基因和 lacF 基因的质粒[ 6] , 用食品级选择标记
lacF 替代抗生素抗性基因,以互补染色体上的 lacF
缺失[ 5] 。这样不仅构建了稳定的完全的食品级表达
系统,而且采用诱导型表达替代原来的组成型表达,
使细菌生长与外源基因的表达分为两阶段,减轻了
宿主细胞的代谢负荷[ 9] 。
3. 3 由于生产乳链菌肽的菌株的稀释的上清液即
可用作诱导剂,所以生产乳链菌肽的菌株可以包含
在发酵液中,并可简单地加入小量的乳链菌肽来进
行诱导,而别的起始培养细菌不会遭受亚抑制量乳
链菌肽的损害。随着一些乳链菌肽突变体的构建成
功,甚至可用比野生型菌株所需的更低浓度的乳链
菌肽作为诱导剂[ 6] 。
3. 4 工艺上具有灵活性,并可以达到极高的蛋白表
达水平。根据加入的乳链菌肽的量, 最终蛋白质生
产可达到 60%细胞内蛋白质水平, 表达水平可控制
在 1 000倍的动力范围之内, 在此范围内诱导浓度
和蛋白质生产水平之间有线性剂量反应关系[ 1, 5, 6] ;
3. 5 目的基因的表达是十分严谨地控制的,在未诱
导状态时,使目的基因表达处于不可检测的蛋白水
平。这样可以获得严谨调节的启动子系统,并可表
达毒素基因产物[ 5, 6, 10] 。
表 1 列举一些目前已构建的 N ICE 系统的例
子。
4 NICE系统的应用与前景
由于 NICE 系统具有高效表达的特征和实际应
用的价值,故可应用于生物技术上重要的蛋白质(风
味酶,转运蛋白,防腐剂,调节蛋白等)在多种乳酸菌
中的高效表达,同时在细胞代谢途径中它还能够精
确调制关键酶的活性, 控制目的代谢物的生产。更
进一步的是,由于 NICE 系统在未诱导状态时目的
基因的表达水平都是可忽略的, 在相对高的细胞密
度时诱导之后,能大量生产毒素蛋白[ 3] 。
最近由 nisA 启动子诱导的 holin/ ly sin盒已应
用于可生产肽酶的乳酸球菌的裂解[ 2] 。deRuyter
等人把编码 U S3的 holin( lytH )- lysin( ly tA)盒克
隆到 nisA 启动子片段之后,并构建了稳定的乳酸乳
球菌菌株。具裂解性的溶菌酶 lytA 能降解乳酸菌
的细胞壁, 并由 holin表达的蛋白 ly tH 形成的孔以
被动扩散方式进行运输。在培养基中加入乳链菌肽
诱导后, 可使细胞迅速有效裂解, 表明 lysin和 holin
产物对细胞有效的裂解和胞内酶的释放起重要作
用, 故此严谨控制表达系统可表达致死基因, 潜在
16 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期
的应用是把裂解基因与那些涉及风味形成的酶如肽 酶、脂酶和氨基酸转化酶等的基因结合起来[ 3, 6, 13]。
表 1 目前已构建的 NICE系统及其特征
食品级载体 菌株/属 描 述 参考文献
pSIP502
pSIP503
L b. sakei
L b. p lantar um
双质粒 NICE系统,生产类型Ⅱ细菌素 s akacinA 和 sak acinP,以 gusA作为报告
酶,严谨控制有效表达 gu sA
[ 8]
pNZ8048 L . lac ti sNZ9000 获得 pepN 高水平的表达 [ 10]
pGIP014 L . lac ti s
L b. p lantar um
MD007
通过 NICE系统的 al r 的逐步过量表达,使D-环丝氨酸抗性水平成比例逐步增
加
[ 11]
pLNG1363 L b. d elbr uecki i PnisA : : pepI 转录的诱导导致 pe pI 活性的持续增加控制表达 PnisA融合子 [ 12]
pNZ8040
pNZ8008
L . lac ti sNZ3900
L . lac ti sNZ9800
L . lac ti sNZ9700
lacF标记代替 cat-194 氯霉素抗性基因, 0. 5ng/ ml Nisin 诱导后过量表达
p ep N ,达到 47%总蛋白产量,且产量与诱导物为线形剂量关系,基因表达动力
超过 1000倍
[ 2]
pNZ8048
PAL
L . lac ti sNZ9000 翻译融合菌株有更高酶活性, 对数生长期高剂量 Nisin 的诱导时间达 6h,肉桂
酸生成量达到峰值
[ 9]
pNZ8008
pNZ9530
L . lac ti sMG1363
Lact isNZ6091
CNRZ32
Nis in诱导浓度与-葡糖醛酸酶活性之间有线形剂量关系 [ 5]
Mart in 等 人 将 nisRK 整 合 进 L . casei
ATCC393染色体中, 以 -葡糖醛酸酶( gus)基因作
为报告基因,构建了食品级 NICE 系统。而后,他们
将引起人胃肠炎的 Norw alk 病毒的主要抗原蛋白
VP60结构蛋白基因置于 nisA 启动子的控制之下,
并成功地高效表达了抗原蛋白 V P60, 从而开创了生
产口服疫苗的新前景 [ 14]。
所以此系统将来可应用于诱导和控制干酪的加
速成熟及胞内酶释放,有助于风味形成及乳品安全,
并在蛋白质、肽、配料、疫苗和抗原的生产方面具有
广泛的应用前景。
5 结语
多种食品级基因表达系统正在乳酸菌中建立起
来, 这不仅有助于了解乳酸菌的基因功能和表达调
控的规律,而且为乳酸菌后基因组时代所需要。由
于乳酸菌的 NICE 系统的宿主菌、载体及诱导物均
为食品级, 其工程菌及表达产物可直接制成口服制
剂,免去一般基因工程菌所需的繁琐、复杂的后提取
工艺,可直接应用于食品、医药和保健业等领域, 生
产安全、廉价的生物制品,所以有着巨大的应用前景
和潜在的商业价值。
参 考 文 献
1 Ku ipers OP, De Ruyter PG, Kleereb ezem M, et al. J Biotechnol-
ogy, 1998, 64: 15~ 21.
2 De Ruyter PG, Ku ipers OP, d e Vos WM. Appl En vir on Microb-i
ol, 1996, 62: 3662~ 3667.
3 Djoird jevic GM, Klaenhammer T R. M olecu lar Biotechn ology,
1998, 9: 127~ 139.
4 De Vos W . Cu rren t Opinion in M icrobiology, 1999, 2: 289~
295.
5 Kleereb ezem M, Beerthuyz en M M, Vaughan EE, et al. Appl En-
viron Microbiol, 1997, 63: 4581~ 4584.
6 Ku ipers OP, de Ruyter PGA, Kleerebezem M , et al . Tib tech A-
pril , 1997, 15: 135~ 140.
7 Reunan en J, S ari s PEJ. Appl En viron Microbiol, 2003, 69: 4214
~ 4218.
8 S r vig E, Gronqvist S , Naterstad K, et al. FEM S Microb iology
L et ters, 2003, 229: 119~ 126.
9 张晶,刘敬忠,谭淑珍,等.生物工程学报, 2002, 18(6) : 713~ 717.
10 Kunji ERS, S lotboom DJ , Poolman B. Biophys ica Acta, 2003,
1610: 97~ 108.
11 Bron PA, Benchim ol M G, Lambert J, et al. Appl Environ M-i
crob iol , 2002, 68: 5663~ 5670.
12 H enrich B, Klein JR, Weber B, et al. Appl Environ Microbiol ,
2002, 68: 5429~ 5436.
13 De Ruyter PGA, Kuipers OP, Meijer WC, et al. Nature Bio-
technology, 1997, 15: 976~ 979.
14 Martin MC, Fernand ez M , Mart in-Alonso JM , et al . FEMS M-i
crobiology Let ters , 2004, 237: 385~ 391.
172005年第 2期 徐波等:食品级高效诱导表达系统 NICE系统