全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第3期
近年来的研究表明,几乎所有植物中都存在内
生菌,其种类极其丰富。内生菌的种类主要包括:真
菌、细菌和放线菌等。他们主要生长在植物表皮下
的的组织当中[1,2]。
“内生菌”是生态意义的称谓,泛指那些在其生
活史中的某一阶段生活在植物组织内,对植物组织
没有引起明显病害症状的菌,这个定义包括那些在
其生活史中的某一阶段营表面生的腐生菌,对宿主
暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌[1,2]。
植物内生菌能产生多种全新的活性物质,作为
生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源,在
农业、医药卫生领域有着巨大的应用潜力。随着人
们对微生物资源的不断开发,微生物研究领域的不
断扩展,微生物研究方法的不断创新和改进,内生
菌的研究越来越受到科研工作者的重视。虽然经过
几十年的研究,但是目前植物内生菌的研究仍处于
起步阶段,人们对于内生菌还知之甚少,对内生菌
的开发和应用刚刚展开,现已成为国内外学者的研
究热点。
近年来的研究表明很多植物的内生菌是新属
或者新种,目前对于植物内生菌的开发和研究主要
集中在热带[3]、亚热带和温带地区[4],大多数植物的
内生菌还没有得到开发和应用。因此植物内生菌是
宝贵的菌种资源库,有待于进一步的开发和更多的
学者深入的研究。
1 植物内生菌起源的研究
关于内生菌的起源问题有着多种假说。大致分
为三类:有人认为内生菌是通过植物种子传递给植
物的[5];有人认为内生菌最初可能是通过对植物细
胞纤维素的降解,破坏植物细胞壁,从而进入植物
体内[6];还有人认为有的根际菌可以通过植物侧根
的裂缝进入植物当中,经过长期的协同进化,与植
物建立了一种和谐的内生关系,成为内生菌[7]。笔者
认为三种假说均有一定的道理,三种途径均可能是
内生菌的起源方式。笔者通过对分离到的植物内生
菌分解纤维素情况的研究,表明很多内生菌能够利
植物内生菌的开发与研究进展
李强 刘军 周东坡 朱婧
(黑龙江大学生命科学学院,哈尔滨 150080)
摘 要: 植物的内生菌是巨大的资源宝库,具有重大的研究和开发价值。对近年来植物内生菌的开发与研究进展进行了
综述,包括内生菌的起源、分布特点、分离方法,内生菌在医药、生物防治、对污染物的降解等开发与应用方面的研究进展。
关键词: 内生菌细菌 内生真菌 内生放线菌 开发与研究进展
AdvanceonExploitationandResearchofEndophyte
LiQiang LiuJun ZhouDongpo ZhuJing
(ColegeoflifeScionceHeilongjiangUniversity,Harbin150080)
Abstract: Endophytesaregreatresourceswhicharedeservedtoberesearchedandexploited.Recentadvanceonexploitation
andresearchwerediscused.Includingorigin,distributingcharacteristic,isolationmethodsofendophyte;theapplicationofendophytes
onmedicine,biologicalcontrol,biologicaldegradation,andsoon.
Keywords:EndophyticbacteriaEndopyhticfunguiEndopyhticactinomycetesExploitationandresearch
·综述与专论·
收稿日期:2006-03-08
基金项目:国家自然科学基金资助项目、中美合作项目
作者简介:李强(1978-),男,硕士,研究方向:植物内生菌活性代谢产物分析,分子生物学
通讯作者:周东坡,教授,博士,E-mail:zhoudp2003@yahoo.com.cn Tel:0451-86609016
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
用纤维素为惟一碳源生长。这说明一些植物内生菌
可能是通过分解植物表皮和细胞壁进入植物,并且
可能利用植物组织中的纤维素为碳源,以维持生长
活动的需要。
2 内生菌的分布特点
内生菌普遍存在于植物之中,几乎每种植物都
有内生菌存在。从不同地区、不同植物体内分离到
内生真菌种类的数量也不相同,少则十几种,多则
近百种。研究表明植物内生菌的种类的多样性与植
物生长环境和不同的植物有关系。热带、亚热带地
区的植物与生长在较干燥、寒冷环境条件下植物相
比,其内生菌种类和数目多[8]。
就同一种植物来说,植物中的内生菌种类和数
目随着生长时间的增加而增多。健康植株的内生菌
种类和数目比受到胁迫条件下的植株当中的内生
菌的种类、数目都多[9]。同种类的内生菌具有一定组
织专一性[10]。
3 内生菌的分离
分离工作首先要考虑宿主植物的选择。宿主植
物的选择一般要考虑植物的独特生物学特性、一些
特有的现象、生长年限、生长环境等条件。首先明确
分离目的,例如要分离可以产生对疾病有治疗作用
物质的内生菌,一般选择某些药用植物;如果要选
择对农作物病虫害具有防治作用的内生菌一般要
选择具有天然抗虫作用的植物;如果要选择对污染
物有降解作用的内生菌,可以选择生长在有污染物
环境下的植物。这样可以减少工作量,避免随机筛
选带来的繁重的工作。确定了宿主植物之后,对植
物的不同部位进行采样。选择不同生长时期的植
物,对植物的不同部位,不同的组织器官进行采样。
一般采集植物的皮、茎、叶、根,4℃保存备用。
目前内生菌的分离过程一般采用表面消毒技
术,通常采用升汞、乙醇、H2O2、次氯酸钠、DMSO等
表面消毒剂进行消毒。如果是木本植物通常将采集
的树皮、茎等可以切成小段,表面消毒之后接入分
离培养基。如果材料是草本植物可以将材料表面消
毒后研磨成匀浆涂布于培养基之中。分离时可以设
空白对照以检验表面消毒是否彻底。
4 内生菌在生物制药方面的应用
研究表明内生菌能够产生多种全新的生物活
性物质,其中有很多对严重威胁人类健康的疾病有
着神奇的疗效。因此,对于植物内生菌的研究和开
发对医药卫生领域有重大的现实意义。
4.1 内生菌代谢产物的抗癌作用
目前已经发现多种内生菌能够产生抗癌物质。
内生菌产生这些生物活性物质可能会帮助它们同
其它的微生物相互竞争或者适应生存环境。
内生菌产生抗癌药物紫杉醇就是很好的例子。
紫杉醇是红豆杉产生的一种生物碱,紫杉醇的抗癌
机理不同于其他抗癌药,它能促进微管蛋白的聚
合,抑制其解聚,抑制细胞的有丝分裂[11]。经美国
FDA批准,其用途为治疗晚期卵巢癌、乳腺癌等。
StrobelG等从短叶红豆杉中分离到一种可产
紫杉醇的内生真菌(产量 24～50μg/L),为紫杉醇的
微生物生产提供了可能性[12]。接着人们从红豆杉类
植物当中陆续分离出多种能够产生紫杉醇的内生
菌。周东坡等于 1999年从中国东北红豆杉(Taxus
cuspidala)中分离到的一种能产生紫杉醇的内生真
菌——树状多节孢(Nodulisporium syviforme)[13]。紫
杉醇产量最初经色谱测定为 51.06～125.70μg/L;其
后用孢子经一系列的诱变、筛选,获得突变衍生株
NCEU-1,其紫杉醇产量为 314.07μg/L;最后,以
NCEU-1为出发菌株构建了基因工程菌株 TPF-1,
通过微生物发酵法生产紫杉醇产量达到 448.52μg/
L[13,14]。这就为紫杉醇的工业化生产打下了基础,将
为大量生产紫杉醇满足患者的需求开辟了全新的
途径。
图 1 抗癌药物紫杉醇结构图
GaryA.Strobel等从欧洲红豆杉中分离到内生
真菌 Acremonium SP.能产生一系列抗真菌、抗癌的
肽类活性物质,其中白灰制菌素(leucinostatin)A在
1μmol/L的浓度下就能够对人类的一些肿瘤细胞起
到很好的抑制作用[15]。
既然内生菌长期生活在植物体内,与植物能够
34
2006年第3期 李强等:植物内生菌的开发与研究进展
建立和谐的关系,不对植物产生危害作用,那么内
生菌产物的毒性就相当于经过在真核细胞中初步
筛选。这样就可能获得对人类细胞低毒的内生菌产
物。因此,在植物内生菌的代谢产物中就有可能筛
选到对人体低毒的药剂来防治肿瘤等疾病。
目前有很多药物的药源非常紧缺,造成价格昂
贵,如果微生物用于生产这些难于人工合成的药
物,将解决药源紧缺的问题。
4.2 内生菌产生抗菌活性物质
研究表明很多内生菌的产物能够抑制人类的
病原微生物(细菌、真菌、原生动物、原生动物、病毒
等)。目前发现较多的是内生菌能够产生多种新的
抗菌肽类物质。
Cryptosporiopsisquercina是普遍存在于阔叶树
中的一种内生真菌,Strobel对从雷公藤中分离出的
Cryptosporiopsisquercina的研究表明:该菌能够产生
一种特殊的活性多肽 cryptocandin。Cryptocandin是
由一些特殊的羟基氨基酸和一种新的 3-羟基-4羟
甲基脯氨酸组成。研究表明 Cryptocandin的活性类
似于抗真菌剂,对很多病原真菌有抑制作用[16]。
内生菌黄绿假单胞菌存在于植物组织当中,它
能够产生一类新的脂肽类化合物 ecomycins,这类脂
肽的分子量在 1153~1181之间,含有几种不常见的
氨基酸。抑菌试验表明这类物质能够抑制隐球菌等
人类病原真菌[17]。
Castilo等发现 K.nigriscans的一株内生链霉菌
能够产生一类活性多肽 Munumbicins。这类多肽不
仅具有广谱的抗菌活性,而且对有耐药性的病原
菌、寄生虫有很好的抑制作用[18]。
4.3 内生菌产生抗病毒物质
有的内生菌的产物还有抗病毒的作用。Guo
B.等人研究发现内生真菌 Cytonaemasp.能够产生
一种新物质—p-三缩酚酸的同分异构体,这种物质
对人类的细胞巨化病毒的蛋白酶有很好的抑制作
用[19]。但是目前关于内生菌抗病毒的研究较少,主
要是由于在很多化合物的活性研究过程中没有好
的筛选模型。
5 内生菌在植物保护方面的开发与应用
植物内生细菌可以通过分泌抗生物质和诱导
植物系统抗性[20]等不同机制,起到减轻和防治植物
病害的生物学作用。其作用对象主要包括:植物病
原性细菌、真菌、寄生性线虫和昆虫。目前污染严
重,人们对于各种“绿色”商品的需求不断高涨的情
况下,生物防治可以说是顺应了这一潮流,它对人
畜低毒或者完全无毒,同时又能够有效地控制植物
病虫害和杂草,有助于减少环境污染。
人们对于内生菌的生物防治研究由来已久,早
在 19世纪人们就发现牛毛草能使牲畜中毒,原因
是其内生菌产生有毒的物质。近年来的研究表明牛
毛草之中有的内生真菌产生具有毒性的生物碱。这
些生物碱还能调节植物生理活动,使植物能够耐受
干旱等胁迫。黑麦草是分布很广泛的野生牧草,它
的内生菌真菌 Neotyphodium loli与其是互惠共生
的关系,不仅能够提高黑麦草的抗逆性,而且能提
高土地肥效[21]。
目前应用植物内生菌进行生物防治的应用性
研究主要集中在对植物病原菌的抑制方面。Chang
HongLiu等人从可以产生抗疟药的一年生艾草中
分离出 39种内生菌,通过对植物病原菌抑制的试
验,表明其中 21种内生菌对于供试的 6种植物病
原菌有不同程度的抑制作用[22]。Okazaki报道一些植
物的内生放线菌有广泛的宿主范围,有些内生放线
菌的此生代谢产物含有调节植物生长的物质和新
的抗生素[23]。
植物的内生菌还能产生生理活性物质来调节
植物的生理代谢,使植物产生抗逆性。BrianA.
Kunkel等人研究了黑麦草的内生真菌对黑麦草抗
除草剂的生理调节作用,结果表明在含有除草剂的
环境下生长时,具有内生真菌的植株与不具有内生
真菌的植株相比具有明显的抗性,把具有内生菌植
株置于线虫当中 1.5h,检测到内生真菌 N.loli产
生麦角碱、麦角胺酒石酸盐等物质来减弱线虫的感
染[24]。
内生菌的应用过程当中可以将对植物有益生
作用的内生菌通过某种媒介定植于植物体内。
Katarina Cankar等人研究了挪威云杉种子中的具
有促进植物生长作用的内生细菌,提出种子可以作
为有益的内生菌传播的载体[25],因此可以通过处理
种子来将具有生防作用的内生菌定植于植物当中,
从而将为内生菌的广范应用提供一条简洁的途径。
35
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
目前美欧等国的一些种子公司已经生产内生
菌含量高的草坪用草品种。据不完全统计,1990年
就有大约 6000吨含有内生菌的不同品种黑麦草投
入应用[26]。虽然与化学农药相比目前应用内生菌进
行病虫害的防治的比例还很少,但是相信随着深入
的研究,它们必将代替化学农药成为主要的植物保
护药剂。
6 内生菌降解环境污染物的研究
近几年利用植物和其内生菌来降解环境污染
物已经取得了一定的的进展。研究表明某些植物内
生细菌能够降解三硝基甲苯、HMX、RDX等污染物
[27]。Siciliano等人的研究表明当土壤中有污染物的
时候,植物根部有些内生菌中与分解代谢有关的基
因大量表达。当用不同的污染物处理植物时,有不
同的基因表达 [28]。甲苯是汽车尾气的主要成分之
一,Barac等人的研究表明植物某些内生菌能够降
解甲苯,并且能使其宿主植物产生对甲苯的抗性,
这就使利用微生物接种植物进行环境修复提供了
可能[29]。将植物内生菌应用于环境污染方面的研究
刚刚起步,还有待于深入研究。
7 外源基因载体
植物的内生菌还可以作为外源基因的载体。内
生菌长期生活在植物体内,能够在植物体内稳定的
生长和进行代谢活动,这就使内生菌成为绝佳的载
体在生活的植物体内表达外源基因。
目前的研究较多的主要是构建能够表达外源杀
虫防病基因的工程菌株,起到防治植物病虫害的作
用。研究热点是苏云金芽胞杆菌的杀虫基因导入植
物内生菌之中,使内生菌表达杀虫物质。Snyman,S.
J等人将 Bt杀虫蛋白基因 cry1Ac7导入甘蔗内生菌
Pseudomonasfluorescens构建成工程菌并使其成功表
达,对甘蔗害虫 E.saccharina表现出毒杀作用[30]。
Katrina,J等对 cry1Ac7基因的表达过程进行优化
使其表达杀虫蛋白的量增加,而且工程菌在植物体
内能够稳定的表达杀虫蛋白[31]。
8 内生菌开发应用中存在的问题
8.1 植物细胞与内生菌、内生菌与内生菌之间相
互作用的问题
对于植物与内生菌的关系问题还有很多方面
值得研究。有的内生菌可以产生与植物相同或者相
似的代谢产物,这可能是植物与内生菌之间发生了
遗传物质的交换。研究表明有的活性物质是由植物
与内生菌共同产生的化合物。鲁春华等人从美登木
中分离到美登木素,它属于 I型酮类化合物,研究
表明这种物质不是美登木的代谢产物,而是植物与
微生物共同作用的产生的产物[32]。因此,在研究内
生菌的同时也要考虑植物细胞与微生物相互作用
的问题。
既然植物细胞与微生物之间具有协同作用,那
么生活在植物体内这一特殊环境当中不同种类的
微生物也可能通过某种协同作用产生新的物质,或
者大量产生在它们单独存在时只能够少量产生的
活性物质,目前内生菌之间相互作用的研究还未见
报道。
8.2 内生菌对宿主植物的益生作用的探究
内生菌对宿主植物的益生作用在胁迫条件下
才得以表现或者表现得更为明显。虽然人们已经提
出种种推测,但这一现象的机理还有待进一步研
究,这样才能真正揭示内生菌与植物的关系,更好
的开发和利用内生菌。
8.3 应用内生菌生产药剂存在的问题
目前,利用内生真菌发酵生产活性物质遇到的
主要困难是高产菌株的获得。由于药剂生产一般都
会考虑药源的问题,因此一般采用易于培养、生长
快速、代谢产物产生周期较短的菌为材料进行新药
开发与应用。这样就限制了某些生长缓慢、活性物
质产量低的内生菌的应用。
8.4 内生菌的有害作用
有的内生菌在一些宿主当中不表现出有害的
作用,但是在某些植物当中表现致病作用,成为病
原菌。例如:一种内生细菌 Xylelafastidiosa在柳树
等植物当中不表现病害,但是在葡萄树、柑橘、杏树
等植物中就会引起严重病害,成为病原菌[33]。因此
在应用的过程中要考虑内生菌的致病作用。
9 前景展望
利用青霉菌和链霉菌生产抗生素,极大地推动
了抗生素研究的发展和新抗生素的发现,奠定了现
代抗生素制药工业发展的基础。植物内生菌的开发
与应用必将促使微生物制药、微生物防治、微生物
资源的开发进入新时代。
36
2006年第3期
开发植物内生菌有着极其诱人前景。世界上大
约有 300000种植物,在如此众多种类的植物当中
人们仅仅研究了几百种植物的内生菌,在已经研究
的植物当中,几乎每种植物都具有丰富的内生菌存
在[3]。因此还有如此巨大的内生菌资源宝库等待我
们去开发利用。
虽然近 20多年来植物内生菌的研究受到人们
的重视,但是我们对于内生菌还知之甚少。很多具
有开发价值的植物内生菌还没有被研究。目前对于
内生菌的研究主要集中在药用植物、某些粮食作
物、牧草的内生菌的研究。
对于极端环境条件下生长的植物、海洋植物的
内生菌的研究很少有报道。既然目前的研究表明极
端环境微生物能够产生独特的代谢产物,那么极端
环境生长的植物内生菌也很有可能产生有价值的
代谢产物,或者具有独特的代谢途径。因此,海洋植
物的内生菌可能具有产生多种新颖抑菌活性物质
的巨大潜力。
参 考 文 献
1 Denise K.Zinniel,Pat Lambrecht.Applied and Environmental
Microbiology,2002,68:2198~2208.
2 PetriniO.NewYork:Springer-Verlag.1991,179～197.
3 GaryStrobel,BrynDaisy.MicrobiologyandBiologyRevews,2003,12:
491～502.
4 郭良栋.菌物系统,2001,20(1):148~152.
5 McInroyJA,KloepperJW.PlantSoil,1995,173:337～342
6 Quadt-HalmannA,HalmannJKloepperJW.CanJMicrobiol,1997,42:
1144～1154.
7 GoughC,GaleraC,VasseJ,WebsterG,CockingEC,etal.JPlant-
MicrobeInteract,1997,10:560～570.
8 FisherPJ,PrtriniO,SutonBC.Sydowia,1993,45:338～345.
9 MartinJ.Spiering,GeofreyA.Lane,MichaelJChristensen,etal.
Phytochemistry,2005,66:195~202.
10 YuemeiDong,A.LeonardoIniguez,BrianMMAhmer,etal.Applied
andEnviromentalMicrobiology,2003,69(3):1783～1790.
11 周东坡,平文祥.微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇.北京:中
国科学技术出版社,2003,111~113.
12 AStierle,GAStrobel,DStierle.Science,1993,260:214~216.
13 周东坡,平文祥,孙剑秋,等.微生物学杂志,2001,21(l):18～
19,32.
14 周东坡,孙剑秋,于寒颖,等.菌物系统,2001,20(2):277~278.
15 GaryAS,RichardT,ArthurB.PlantScience,1997,128:97~108.
16 GaryAS,RVMiler,C.Miler,MCondron,DBTeplow,WMHess.
Microbiology,1999,145:1919～1926.
17 MilerRV,MilerCM,Garton-KinneyD,etal.JApplMicrobiol,
1998,84:937～944.
18 CastiloU,GaryAS,FordEJ,etal.Microbiology,2002,148:2675~2685.
19 GuoB,JDai,SNg,YHuang,etal.JNatProd,2000,63:602~604.
20 BangeraMG,ThomashowLS,WelerDM,etal.MolPlant-Microbe
Interact,1996,9:83.
21 DESpiers,PAEichena,M.J.Leonarda,etal.JournalofThermal
Biology,2004,29:753~757.
22 ChangHongLiu,WongXinZou,HongLu,RenXiangTan,Journal
ofBiotechnology,200188:277~282.
23 Okazaki,T,Takahashi,K,Kizuka,MandEnokita,RAnnu.Rep.
SankyoResLab,1995,47:97～106.
24 BrianAKunkel.BiologicalControl,2004,29:100～108.
25 KatarinaCankar,HojkaKraigher,MajaRavnikar,etal.FEMS
MicrobiologyLeters,2005,244:341~345.
26 FunkCR,WhiteRH,BreceJP.EcosystemsEnvironment,1993,44:
215~232.
27 VanAken,BEvol.Microbiol,2004,54:1191～1196.
28 Siciliano,SD.AppliedandEnvironmentalMicrobiol.,2001,67:2469～
2475.
29 Barac,T,DanielVDL.NatBiotechnol,2004,22:583~588.
30 SnymanSJ,KGBlack,GHerera,etal.SugarTechnolog,1993,67:
78～81.
31 KatrinaJDowning,Gramem Leslie.AppliedandEnvironmental
Microbiology,2000,7:2804～2810.
32 ChunhuaLu,YuemaoShen.BioEssays,2003,26:808～818.
33 KarynL,Newman,RodrigoPP.Almeida,AlexanderH,Purcel,et
al.Applied and EnviromentalMicrobiology,2003,12:7319～
7327.
李强等:植物内生菌的开发与研究进展 37