全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2006年增刊


作者简介:赵清,女,黑龙江人,硕士,主要从事转基因棉花环境安全研究, Te:l 072-2562290, E-m ia:l zhaoqing826@ 126. con


通讯作者:崔金杰
转 Bt基因作物杀虫蛋白土壤残留及检测研究进展
赵清
崔金杰
李树红
雒 瑜
王春义
(中国农业科学院棉花研究所,安阳
455000)


摘
要:
随着转 B t基因作物的大面积推广和应用,其释放的毒蛋白在土壤中的残留及对土壤生态系统的影
响等问题已经成为人们关注的热点。国内外学者们通过室内构建大田模拟模型的方法对土壤中残留的 Bt毒蛋白
进行了研究, 并取得了显著的进展。土壤是生态系统中物质循环和能量转化过程的主要场所,转 B t基因植物的外
源基因表达的 B t毒蛋白可以通过植株残体、根及根系分泌物和花粉的散播等途径进入土壤生态系统,这些高度特
化了的 B t毒素蛋白一旦在土壤中积累, 将会导致土壤特异生物功能类群以及土壤多样性发生改变, 甚至产生级联
效应。大量研究表明, 苏云金芽孢杆菌产生的 Bt毒蛋白进入土壤后,可与土壤粘粒和腐质酸迅速结合, 不易分离,
而且较之游离态, 更难被土壤微生物降解。纯化的 Bt毒蛋白与无菌土壤中活性颗粒紧密结合后, 存留时间至少可
达 234d。虽然结合态的 Bt蛋白用酶联免疫法 ( EL ISA )方法检测不到, 但生物测定表明其仍保持杀虫活性。对转
B t基因作物的研究表明, Bt棉组织埋入土壤 7d内,土壤中可提取的杀虫晶体蛋白浓度快速下降, 之后下降速度比
较稳定, 甚至维持数周不变。而 Bt玉米根系分泌物和植株残体释放的杀虫晶体蛋白在土壤中至少保持 180d杀虫
活性。虽然关于 B t毒蛋白在土壤中存留时间的长短, 可能因实验材料、试验方法和条件的不同而不同。但是总
之, 如果长期种植转 B t基因作物, 很可能会造成 Bt毒蛋白在土壤中的积累, 并最终威胁到整个土壤生态系统的平
衡。目前对土壤中 B t毒蛋白定性和定量检测的方法主要有印迹分析法 ( W estern-b lo tting)、SDS-PAGE法、斑点印迹
酶联免疫吸附法 ( do t-b lo t EL ISA )、流式细胞仪法 ( F low cy tom eter, FCM )、ELISA平板试剂盒及试剂条和生物测定
法。其中最直接、简易、准确的方法是 ELISA平板试剂盒及试纸条快速检测法和生物测定法。但检测土壤残留 Bt
毒蛋白时, 采用的方法不同,检测的结果也有差异。
关键词:
转 B t基因作物
Bt毒蛋白
土壤残留
生态风险
Research Advances in SoilRemaining andM onitor
of Toxins Protein Released by TransgenicBt Crops
Zhao Q ing
Cu i Jinjie
L i Shuhong
Luo Junyu
W ang Chuny i
(Cotton R esearch Institu te, CAAS, Anyang H enan 455004)


Abstrac:t
W ith the large a rea popu lariza tion and applica tion o f transgen icB t crops, such questions as its tox in pro-
te in residue in the so il and im pact on so il ecosystem released, etc. have already becom e concerned focuses of people. Do-
m estic and internationa l scho lar structu re land fo r g row ing fie ld crops m ethod, s imu la tion o fm ode l Bt tox in prote in that re-
m ain carry on research to so il in room, m ake rem arkable prog ress. The so il is am a in place tha t them a terial c irculation and
energy transform course in the ecosy stem, transfe r to B t o ther source B t tox in prote in of gene expression, gene o f p lant can
enter the so il ecosystem through plant incomp lete body, roo t, roo t exuda tes and way o f d issem inating e tc. o f po llen, once
Bt tox in prote in that he ight take spec ially the accumu la te am ong so i,l cause so il peculiar bio log ica l function group and so il
va riety change, even produce the e ffect o f one g rade o f an tithetical couplets. A large number of resea rch indicate, Bt tox in
prote in of Bac illus thuring iensis that produce enter afte r the so i,l can glue gra in sour to com bine rap id ly w ith rotten quality,
d ifficu lt to separate, and compared w ith the attitude of dissoc iating w ith so i,l difficult the little b iodeg rada tion o f so i.l A fte r
2006年增刊 赵清等: 转 B t基因作物杀虫蛋白土壤残留及检测研究进展
tox in prote in o fB t o f the pur ification is comb ined c lose lyw ith active partic le in the aseptic so i,l it is can be up to 234 days
a t least to reta in tim e. Though the Bt pro te in w hich comb ines can not m easure w ith EL ISA m e thod, but it indicates it still
keeps insectic ida l activ ity that the liv ing be ings determ ine. To transgen ic B t crops resea rch ind ica te B t cotton o rganiza tion
im bed so il in the 7d , w hom so il can draw insecticida l crysta l prote in dens ity drop fast, la ter the decrease speed w as mo re
steady, had even kept not chang ing fo r severalw eeks. AndB tm a ize root exudates and plan t that incom plete body re lease to
k ill w orm crystal a lbumen keep 180d abatingw orm
s activa tion at least of the so i.l Though reta in size o f tim e am ong so il by
tox in prote in about B t, m ay be d ifferent because exper iment m ate ria,l test m e thod are d ifferent from cond ition. But in a
w ord, if plant and transfe r to the gene crop ofB t for a long tim e, w ill possib ly cause the accumu lation in the soil o f Bt tox in
prote in, and threaten the balance of thewho le so il ecosystem fina lly. B t tox in pro te in determ ine the natu re to so il at present
and for ana ly tic approach of a trace me thod that ra tion m easu re (W estern-blotting) , SDS-PAGE law, spo t trace enzym e u-
n ite the imm une adsorp tion m e thod ( do t-blot EL ISA ) , flow ing type ce ll
s appearance law ( FCM ), EL ISA du ll and ste reo-
typed reagent box and reagent artic le and liv ing be ings determ ine the law. Am ong them m ost d irect s imp le and easy, accu-
ra tem ethod whether EL ISA du ll and ste reotyped reagent box try on notem easure law and liv ing beings determ ine law fast.
Bu t wh ile m easuring the so il and rem a in ing Bt tox in pro tein, m ethods to adopt are d ifferent, the resu lt m easured has a
d ifference.
Key words:
T ransgenicB t crop
Tox in prote ins
So il rem a ining
Eco log ica l risk


自 1983年第一例转基因植物问世以来,植物转
基因研究发展迅速。转 B t抗虫基因棉花、玉米和马
铃薯等都已经进入了商业化生产 [ 1, 2]。随着转 B t基
因植物的大面积推广种植,其环境安全性问题日益
引起国内外专家学者的关注,成为研究的热点和焦
点。转 B t基因植物外源基因表达的毒蛋白可以通
过植株残枝落叶、根系、花粉等形式进入土壤生态系
统,并能够在土壤中积累, 保持杀虫活性, 由于毒蛋
白在土壤中的降解不需要一定的 pH值和特殊的蛋
白水解酶来激活,就可直接作用于土壤生物体,因此
有可能对土壤特异生物功能类群以及土壤多样性产
生一系列影响 [ 3~ 5] , 最终可能会影响到整个土壤生
态系统的安全 [ 6, 7]。转 B t基因作物释放的毒蛋白进
入土壤后,其危害性可能比商业化 Bt制剂防治害虫
残留在土壤中的前毒素危害性更大, 尤其是产生的
级联效应可进一步扩大这种影响。因此,研究转 B t
基因植物毒蛋白在土壤中的残留和降解动态对于保
护生态环境安全、保障人类健康具有十分重要的意
义。
1
转 B t基因植物释放 B t杀虫毒蛋白的途
径及其潜在风险
土壤是生态系统中物质循环和能量转化过程的
主要场所,转基因植物外源基因表达的毒蛋白可通
过多种途径进入土壤生态系统, 其中最直接的途径
包括以下 3个方面: ( 1)植株残体, 转 B t植物在收割
前后遗留在田间的植株残体是毒蛋白进入土壤中最
重要的途径,尤其是随着作物秸秆还田技术在农业
生产上的大面积推广应用,为大量转 Bt植物释放的
杀虫蛋白进入土壤并在其中累积提供了有利条
件 [ 3, 8~ 10] ; ( 2)根及根系分泌物, 转 B t植物的根系也
表达 B t毒蛋白 [ 11] , 水培和土培实验均证实了转 B t
基因玉米的根系分泌物中有活性 B t毒素 [ 12] , 同时
其根系分泌物也在源源不断向这些作物根际周围的
土壤生物圈导入 B t毒蛋白 [ 12, 13] ; ( 3)花粉, 大多数
转 Bt植物在花粉中表达 B t毒蛋白, 且表达的量很
高 [ 11]。因此,转 B t植物的花粉落入田中也是转 Bt
作物释放的 B t毒蛋白进入土壤中的一条重要途径。
通过上述途径不断地向土壤中释放的这些外源
高度特化了的 B t毒素蛋白, 一旦在土壤中积累, 将
会导致土壤特异生物功能类群以及土壤多样性发生
改变,甚至产生级联效应。因此, 转 B t基因植物对
土壤生态系统的影响是继转基因作物与近源物种基
因流、靶标害虫抗性问题和对非靶标生物影响之后
的又一个倍受人们关注的热点问题。
B t制剂作为微生物杀虫剂使用已经有 30多
年,其残留在土壤中的是无活性的前毒素 ( protox-
in) ,对于人畜来说是安全的, 但通过基因工程转入
到天然和已经适应某种特殊生境而能存活并且繁殖
的生物体的 B t基因,是经过修饰的并直接编码合成
了活性 Bt毒素,该毒素已经不再需要靶标害虫肠道
71
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2006年增刊
内一定的 pH 值和特殊的蛋白水解酶来激活, 就可
直接作用于土壤生物体,而且这些毒素,也许能够在
此种生活环境下继续存在并积累, 因此当其向环境
释放后,可能会产生负面影响。已有研究证实, 转
B t基因植物的 Bt毒素蛋白田间释放后,可使土壤中
毒素浓度高于使用 Bt制剂造成的残留, 并且这种外
源表达的活性 B t毒素在土壤中存在的时间也超过
了 B t制剂导入的毒素 [ 14, 15 ]。此外转 B t基因作物释
放到土壤中的 B t毒蛋白, 不易被土壤微生物降解,
并保持杀虫活性,这必然加剧了毒素的积累,因此可
想而知,其危害性远比商业化 Bt制剂要大。导入土
壤中的 B t毒素存活能力主要取决于: 加入浓度、昆
虫幼体消耗和钝化的速度、微生物降解的速度等。
如果毒素合成或残留的量超过了消耗、钝化和降解
的量, 则在积累到一定浓度后, 一方面可能增强靶标
害虫抗性的选择和富集, 另一方面可能导致对非靶
标生物体的持续危害,如土壤微生物群系,有益昆虫
和其它动物,可能会破坏原有土壤生物间的平衡,引
发一系列的反应,尤其是级联效应可进一步扩大这
种影响,最终可能会影响到整个土壤生态系统的安
全 [ 16]。
2
转 B t基因植物的外源基因表达产物



B t毒蛋白在土壤中的残留特性
国内外大量研究表明 B t毒蛋白进入土壤后,与
土壤粘粒 [ 17]和腐质酸 [ 18]迅速结合不易分离, 这种
结合态较之游离态,更难被土壤微生物降解,而且仍
然长期保持杀虫活性 [ 14]。转 B t基因作物释放后,
导入土壤中杀虫晶体蛋白的生物活性是评价其环境
状况和对非目标物种潜在风险的重要参数。因而,
学者们对杀虫晶体蛋白在土壤中的残余量及毒性进
行了大量的试验并取得了一些成果。如孙彩霞等在
实验室内进行的纯化杀虫晶体蛋白与土壤性质关系
的研究结果同国外的结果一致, 即杀虫晶体蛋白能
快速被土壤吸附并紧紧地结合, 结合态杀虫晶体蛋
白仍保持杀虫活性且比游离态杀虫晶体蛋白更抗降
解。
2. 1
B t杀虫晶体蛋白的土壤存留状态
试验表明, Bt毒蛋白进入土壤后, 与土壤粘粒
(蒙脱石和高岭石 )、腐质酸和有机矿物聚合体等表
面活性颗粒迅速结合, 且不易分离 [ 15, 17, 18, 20, 24]。因
为纯化的 B t毒蛋白与土壤表面活性颗粒快速结合
并没有改变其蛋白结构 [ 14, 15, 17, 24]。对纯化杀虫晶体
蛋白存留状态与土壤性质的关系研究表明, B tk杀
虫晶体蛋白 (由 B t亚种 kurstak i产生 )和 B tt杀虫晶
体蛋白 (由 B t亚种 tenebrion is产生 )能快速被土壤
吸附并紧紧地结合,吸附在 30m in内达到动态平衡,
但结合蛋白的结构并未被修饰 [ 24]。这种结合态一
旦达到平衡态就很难被蒸馏水冲刷析出, 即使增加
冲刷次数最多也只能有 10% ~ 30%游离态的毒蛋
白能被冲刷析出 [ 15, 20]。C recch io等不仅深入研究了
从 4种不同土壤中纯化的腐殖酸与纯化的 B tk杀虫
晶体蛋白之间的动态吸附解吸平衡规律 [ 18] ,还模拟
自然土壤 (蒙脱石-腐殖酸-A l羟基聚合体混合物 )
对纯化的 B t毒蛋白的吸附特性, 研究结果表明, 在
第 1h内, 纯化的 B t毒蛋白的吸附达到总吸附量的
70%, 在 8h内产生了最大吸附 [ 25] ,有机矿物聚合物
的吸附量与 B t毒蛋白的量成正比。
2. 2
B t杀虫晶体蛋白在土壤中的活性存留
B t毒蛋白与土壤颗粒的结合, 增加了其对生物
降解的抵抗性,从而保护了 B t毒蛋白的杀虫活性,
因而能够在土壤中长期残留。Tapp等研究表明, 添
加到土壤中的纯化的 B t杀虫晶体蛋白可与土壤微
粒结合,在灭菌土壤中能够保持杀虫活性,且存留时
间至少可达 234d[ 10] ; 然而即便是在非灭菌条件下
40d后,用点印迹酶联免疫法仍然检测到其杀虫活
性。活性持续时间与粘粒含量呈正比, 而与土壤 pH
值呈反比 [ 14, 20 ]。
通过转 B t基因作物的根系分泌而进入根际土
壤是 B t毒蛋导入土壤的途径之一,这些根分泌的纯
B t蛋白在土壤中活性存留情况首先引起科学家的
注意。S totzky& Saxena等 [ 12]将灭菌或非灭菌土壤
进行试验,发现即使转 B t基因玉米生长 25d后, 其
根系中分泌的毒蛋白仍具有杀虫活性,用根际土壤
的悬浮颗粒直接进行了生物测定,具有相当的杀死
率。 Saxena还用生物检测法检测了 B t基因玉米根
系分泌的毒蛋白, 烟草螟虫幼虫 7d的死亡率高达
92. 5% (对照为 5% ), 存活幼虫个体单重也明显低
于对照。这些结果与早期的关于纯化杀虫晶体蛋白
快速与土壤活性表面颗粒结合并保持杀虫毒性且免
于生物降解的研究结果是一致的。
72
2006年增刊 赵清等: 转 B t基因作物杀虫蛋白土壤残留及检测研究进展
同样大田生长的 B t玉米植株的根际土壤在整
个生长季和其收获后的几个月以及随后的霜冻期间
也存在杀虫晶体蛋白 [ 13 ] ,即使对土壤进行 40d冻融
和干湿交替处理也如此。
此外,田间秸秆分解试验也证实, 转 B t基因玉
米残茬分解释放的 B t毒素, 在土壤中至少保持
180d的杀虫活性 [ 3, 13, 19]。 Palm等 [ 8]比较了转 B t基
因棉花叶片的 B t蛋白和纯化的 B t蛋白在土壤中的
讲解速度, 发现无论是叶片 Bt蛋白还是纯化的 B t
蛋白, 其在土壤中的浓度均是在前 14d里迅速下降,
然后缓慢下降,并在较长时期 (几个月 )内保持一定
浓度。
B t毒素与粘土成分 (蒙脱石和高岭石等 )和有
机质 (腐质酸 )结合时, 虽然用 EL ISA方法检测不
到,但生测证明其杀虫活性可持续 25d[ 12] , 且更不
易被土壤生物分解 [ 18, 20]。结合态 B t毒素活性持续
时间与土壤粘粒含量呈正比, 而与土壤 pH值呈反
比 [ 14, 20 ]。中性土壤中转 B t基因棉花和玉米 B t毒素
的活性降低较快, 120d下降到 17% ~ 23%。但玉米
收获后,根茬中的杀虫蛋白 1 447d后才消失 [ 21, 22 ]。
正是持留在土壤中的这些与粘土矿物及紧密结合且
较低含量的 B t毒蛋白可能会对非靶标生物产生不
利的影响,并且这种影响有可能随着转 B t基因植物
的长期种植而积累。
3
B t杀虫晶体蛋白在土壤中的降解规律特
性
B t杀虫蛋白在土壤环境中失活或消除的途径
主要包括三个方面: 一是昆虫消耗, 即土壤中的 B t
杀虫蛋白进入昆虫 (包括靶标昆虫和非靶标昆虫 )
体内后被降解;二是太阳光的作用, B t杀虫蛋白在
紫外线的照射下降解而失效;三是微生物的降解和
最终的矿化作用 [ 48]。这三种降解方式一般以两种
和多种作用相伴或相继进行,其中土壤微生物是影
响 B t毒蛋白在土壤中存留以及积累的最关键因子。
研究表明, B t杀虫蛋白易被土壤中的粘粒、腐殖质
等活性颗粒吸附而形成结合态, 这种结合态仍有较
强的杀虫活性并能抵抗土壤微生物的降解; 在 pH
值为中性的土壤中, B t杀虫蛋白被降解得很快, 而
pH值较低的土壤不利于微生物的降解 [ 49]。
由于 Bt毒蛋白进入土壤的最主要途径就是根
茬和凋落物,因而学者们将转 B t基因植物组织添加
到土壤中以模拟大田环境中 B t杀虫晶体蛋白在土
壤中的降解规律。Palm等的研究表明, 由于生物降
解或与土壤颗粒的缓慢结合和吸附,转 B t棉花组织
加入土壤的 7d内, 土壤中可提取的杀虫晶体蛋白浓
度快速下降,之后下降的速度比较稳定,甚至维持数
周不变 [ 8]。这与孙彩霞等 [ 16 ]对 GK棉和 ZK棉品种
棉花组织中 B t杀虫晶体蛋白在土壤中的降解情况
的研究结果相似, 即随着培养时间的延长, 两种 Bt
棉花组织中杀虫晶体蛋白的含量均降低, 在培养初
期 ( 7d内 )下降的速度较快,随后下降缓慢, 至培养
后期 ( 28d后 )基本稳定。但至 56d培养结束时 Bt
杀虫晶体蛋白含量仍分别为初始量的 44. 7%
( ZK)、56. 1% ( GK )。
导致这种现象的原因主要有三方面:一,是由于
植物材料腐烂时能够释放出降解性酶和化合物 (直
接来源于植物或者是来源于植物相关微生物 )加速
了降解过程;二,可能是植物材料中的杀虫晶体蛋白
比纯化杀虫晶体蛋白易于受土壤中降解性微生物影
响,三,可能由于植物材料的添加增加了土壤微生物
的种群数量。
4
土壤中毒蛋白的检测方法
印迹分析法 (W estern-b lo tt ing )是在蛋白质水平
上检测转基因植物中的目标蛋白质的一项重要技
术,可为外源目基因在植物中的整合与表达提供最
直接的分子生物学证据。但是检测效果不理想, 且
费时、费力、难度较大, 定量准确性不高 [ 12, 17] ; SDS-
PAGE法首先通过 SDS-PAGE电泳检测转基因植株
中是否表达了杀虫蛋白质, 然后与薄层扫描测定相
结合可以进一步分析 [ 10, 26] , 从而导致 SDS-PAGE检
测效果不理想; 斑点印迹酶联免疫吸附法 ( do-t blot
ELISA )在检测无菌土壤中 B t毒蛋白时, 最低检测
限约为 3ng /m l土壤溶液; 流式细胞仪法 ( F low cy-
tometer, FCM )可以直接测定土壤中 B t毒蛋白, 可以
定性测定还易于定量检测 [ 27, 28]。
ELISA平板试剂盒和 QuickS tix试剂条快速检
测法利用抗原抗体特异性结合以及酶法测定原理,
具有所需样品少, 测定时间短,操作标准, 检测极限
高等优点,是目前已知的最简便、快速、灵敏的一种
方法,还可对大量样品进行定量检测。美国 Env ior-
73
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2006年增刊
olog ix公司生产的 Cry1Ab /Cry1Ac平板试剂盒是定
量检测 B t杀虫蛋白的专用试剂盒, 已经在转 B t基
因玉米、水稻上应用 [ 6, 29]。Qu ickStix试剂条已广泛
用来快速定性检测转 B t基因玉米释放到土壤中的
B t毒蛋白的存留和降解等 [ 12, 13]。中国农业大学、北
京大学、中国农业科学院等单位研究了转 B t植物毒
蛋白的免疫学检测方法,制备出高效的抗血清,并研
制出了 ELISA检测试剂盒和试纸条 [ 30 ]。生物测定
法以目标害虫取食转 B t作物组织后的死亡率、化蛹
率、羽化率、体重变化等作为指标, 是确认土壤中残
留的 Bt毒蛋白杀虫活性的一种直接、有效、简便易
行的手段,只需将含有 B t毒蛋白的抽提液直接加入
到敏感昆虫的人工饲料中即可,且灵敏度高,可检测
到亚致死剂量的 B t毒蛋白 [ 6] ,如 B tC ry1A毒蛋白在
饲料中为 0. 5ng
m l- 1时就能明显抑制烟芽夜蛾幼
虫的生长 [ 32]。但生物测试法需要统一虫源、虫龄和
饲养条件,且占用的空间大, 检测所需的时间长,环
境因素干扰大, 因此难以对大量的样品进行检
测 [ 7, 26, 11 ]。
5
结束语
转 B t基因植物分泌的毒蛋白可以通过花粉、根
系、植株残体等形式进入土壤生态系统。毒蛋白在
土壤中存留时间、特性,以及是否产生积累和级联效
应,都有待于深入研究。目前国内外多数研究,都是
通过室内模拟试验来进行研究并得出结论, 而大田
条件下 B t度蛋白在土壤中的存留、降解动态规律及
特性尚需进一步做长期大量的研究工作。
随着转 B t基因作物的大面积种植, 其对土壤
生态系统的潜在风险正日益成为国内外关注的热
点。目前转 B t基因植物商品化生产的时间还不长,
而其对环境安全的影响往往需要在相当长的时期内
才表现出来; 此外实验中一些不显著的问题, 在产
业化规模种植较长时间后, 均可能会直接和间接对
土壤生态系统造成不利影响。因此, 对于转 B t基
因植物毒蛋白对土壤生态系统的影响需要进行长期
的检测和监测, 这对于保护生态环境、保障人类健
康、确保生物技术沿着健康的轨道发展具有重要的
意义。
参 考 文 献
1
张宏宇,李中奎,喻子牛.生物技术通报, 1997, 3: 13~ 15.
2
张永军,吴孔明,彭于发,等. 昆虫知识, 2002, 39( 5) : 321~ 327.
3
王建武,冯远娇,骆世明. 应用生态学报, 2002, 13 ( 4) : 491~ 494.
4
王忠华,叶庆富,舒庆尧,等. 应用生态学报, 2002, 13 ( 3 ) : 373~
375.
5
张美俊,杨武德.山西农业大学学报, 2005, 25( 3 ) : 302~ 305.
6
白耀宇,蒋明星,程家安,姜永厚. 应用生态学报, 2003, 14( 11) :
2062~ 2066.
7
魏伟,钱迎倩,马克平. 生物多样性, 1999, 7 ( 4) : 1~ 6.
8
Plam C J, S challer DL, Don egan KK, et a.l C an JM icrob io,l 1996,
42: 1258~ 1262.
9
S teven RS, and Larry RH. Env iron En tomo,l 1996, 25: 659~ 664.
10
T appH, S totzky G. S oil B iol B iochem, 1998, 30( 4) : 471~ 476.
11
吴刚,崔海瑞,舒庆尧,夏英武. 生物技术, 1999, 9 ( 5) : 34~ 38.
12
Saxena D, F lores S, S totzky G. Natu re, 1999, 402: 480.
13
Saxena D, S totzky G. FEMSM icrob ialE co,l 2000, 33: 35~ 39.
14
T appH, S totzky G. Appl Environ M icrob io,l 1995, 61: 602~ 609.
15
TappH, Stotzky G. Appl EnvironM icrob io,l 1995, 61: 1786~ 1790.
16
孙彩霞,陈利军,武志杰.应用生态学报, 2002, 13 ( 11 ) : 1478~
1482.
17
T appH, Calam aiL, S totzky G. S oil B iol B ioch em, 1994, 26: 663~
679.
18
Crecch io C, Stotzky G. So ilB iolB ioch em, 1998, 30: 463~ 470.
19
Saxena D, S totzky G. S oilB io B iochem, 2001, 33 ( 9) : 1225~ 1230.
20
S totzky G. J Environ Qua,l 2000, 29: 691~ 705.
21
S im s SR, H olden LR. Environ E ntom o,l 1996, 25: 659~ 664.
22
S im s SR, Ream JE. JAgrc Food Chem, 1997, 45: 1502~ 1505.
23
Donegan KK, Seid ler R J, F ieland VJ, et a.l J App lE co,l 1997, 34:
767~ 777.
24
V enkatesw erlu G and S totzky G. Curren tM icrob io,l 1992, 25 ( 4) :
225~ 233.
25
Crecch io C, Stotzky G. Soil B iol B iochem, 2001, 33 ( 5) : 573~ 581.
26
H ilbeck A, Baum gartner M, Fried P M, et a.l En ciron En tomo,l
1998, 27: 470~ 480.
27
D aveyH W, Kel lDB. M icrob iolR ev, 1996, 60: 641~ 696.
28
T appH, S totzky G. C an JM icrob io,l 1998, 43: 1074~ 1078.
29
贾士荣,郭三堆,安道昌,等. 北京:北京科学出版社, 2001.
30
王保民,荷钟佩,赵继勋.棉花学报, 1998, 10 ( 4) : 220~ 221.
31
F ischhoffDA, B ow dischKS, Perlak FJ, et a.l B iolT echno,l 1978, 5:
807~ 813.
32
S teven RS, JoelER. J Econ En tomo,l 1996, 89: 247~ 251.
33
Vaeck M, Reynaerts A, H ofte H, Jansens S, et a.l Natu re, 1987,
328: 33~ 37.
(参考文献 34~ 49略 )
74