全 文 ：猕猴桃叶 DNA的 AFLP分析
柯辉鹏 李小丹 梁红*
(仲恺农业技术学院生命科学学院,广州 510225)
摘 要: 以猕猴桃幼叶为材料提取基因组 DNA 并进行 AFLP 扩增。对主要实验步聚包括 DNA 纯化、DNA
的酶切、酶切片段与接头的连接、PCR扩增、电泳、以及银染等方面的反应参数进行比较和优选,初步摸索出适合于
猕猴桃叶为材料的 AFLP 程序,并得到较为清晰可辩的 AFLP指纹图谱, 为开展猕猴桃遗传多态性研究和在分子
水平上开展物种生物学分析提供一个实用的手段。
关键词: 猕猴桃 DNA AFLP
AFLP Analysis of DNA from Kiwifruit leaves
Ke Huipeng Li Xiaodan Liang Hong*
( Coll eg e of L i f e S ci ences , Zh ong kai Univ ersi ty of A g ri cul tur e and T echnolog y , G uang zh ou 510225)
Abstract: Genomic DNA was ex tracted from kiwif ruit leaves and AFLP w as carr ied out w ith the DNA . The
important parameter s in the pr ocedure including DNA pur ification, endonucleic lysis o f DNA , ligation between
DNAs and adapt ors, PCR, electr ophoresis and silver staining w ere compared and optimized. A better pro cedure for
DNA ex traction and AFLP analy sis of kiw if ruit w as suggested. And a distinct electr opho reto gr am fr om the AFLP
amplificates could be show ed. By means of AFLP analysis, g enet ic div ersity and species biolog y of kiw ifr uit in mo-
lecular level could be studied.
Key words: Kiwifruit DNA AFLP
猕猴桃是猕猴桃科( Actinidiaceae)猕猴桃属( A ctinidia)植物的统称, 为原产我国的木质藤本植物。猕
猴桃属植物约有 63种,我国至少有其中的 59种、43变种和 7个以上的变形[ 1, 2 ]。猕猴桃属的一些种如中华
猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃、阔叶猕猴桃和毛花猕猴桃等已有一些类型被驯化为栽培品种,在世界各地
作为新兴水果种植。我国猕猴桃栽培面积居世界第一位,产量排第三位。随着猕猴桃产业的发展,对猕猴桃
的科学技术研究受到越来越多的重视,分子生物学研究也取得许多成果 [ 3~ 15]。本文主要进行猕猴桃 DNA
提取及 AFLP 的研究, 以其进一步研究猕猴桃的遗传多样性和物种生物学, 为猕猴桃资源的深入开发利用
提供分子生物学证据。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
本研究所用的为中华猕猴桃( A . chinensis)品种武雄和美味猕猴桃( A. del iciosa)品种帮增,枝条
引自广东和平县水果研究所, 嫁接于仲恺业技术学院(位于广州)猕猴桃品种资源圃内,取当年新生的未完全
展开的幼叶作为基因组 DNA 提取材料,即取即用。
1. 2 DNA 提取
取 1g 新鲜幼叶于研砵中加液氮磨成粉末,再加 2 m l SDS裂解液( 1. 25% SDS, 100 mM T ris-HCl, 1%
巯基乙醇, 1% PV P, pH 7. 5)磨成匀浆,转移到 7. 5 ml离心管中, 再用 1 m l SDS 裂解液洗研砵后转入同一
收稿日期: 2005-11-16
基金项目:本研究为广东省科技项目 广东猕猴桃资源保护及开发利用 ( 2005B60301010)部分内容
* 通讯作者:梁红,理学博士,仲恺农业技术学院教授,主要从事资源植物学及其生物技术的教学科研工作
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
离心管, 65 水浴 30 min。加入 1 ml 5 M KAc摇匀后冰浴 30 m in, 10 000 r pm 离心 5 min后取上清液加等
体积苯酚/氯仿/异戊醇( 25: 24: 1)提取液摇匀后再次离心。转移上清液加 1/ 10体积 3 M NaAc混合均匀后
加入 2倍体积无水乙醇, 轻轻摇匀后静置数分钟。挑取絮状物于 75%乙醇中漂洗 2次,晾干后用 0. 8 ml T E
溶解,再加 0. 8 ml 苯酚/氯仿/异戊醇( 25: 24: 1)混匀后 10 000 rpm 离心 5 min,取上清液加入等体积氯仿混
合均匀,再次离心后倾去上清液,用 75%乙醇洗沉淀 2次,晾干后保存于-20 冰箱中备用。
1. 3 AFLP 扩增
1. 3. 1 DNA双酶切及 A dapter 连接 将 DNA 样品溶解于 1 T BE 缓冲液中, 用公司生产的 AFLP 试剂
盒进行双酶切、Adapter(人工接头)连接和 PCR扩增。两种 Adapter 的序列如下:
EcoRI-adapter MseI adapter
5-CTCGTAGACTGCGTACC 5-GA CGAT GAGT CCT GAG
CATCT GA CGCATGGTT AA-5 T ACT CAGGACT CAT-5
双酶切和 Adapter 连接的反应体系如下:
Adapter(混合) 1 l、EcoRI/ M seI(各 4U /l) 2 l、10 反应缓冲液 2. 5 l、AT P( 10 mM , pH 8. 0) , 双蒸
水 9 l, T4 DNA 连接酶( 3U/l) 1 l, DNA 样品 2l。上述试剂依次加入完毕后在离心机上混合均匀, 37
温育 6h后再经 8 保温 5h,于 4 中过夜。
1. 3. 2 PCR扩增 本试验中的 PCR扩增包括预扩增和选择性扩增。上述 DNA双酶切及 Adapter 连接的
产物用等体积重蒸水稀释后作为预扩增模板,预扩增产物经稀释后作为选择性扩增的模板。
预扩增的反应体系为: 重蒸水 18. 5l、10 PCR缓冲液 2. 5 l、dNT Ps 0. 5l ( 200 M )、预扩增引物
1l、T aq酶( 2 U/L) 0. 5l、DNA 模板 2l,上述试剂混匀后按以下程序进行 PCR反应: 94 2 m in; 94
( 30 s)-56 ( 30 s)-72 ( 80 s) 30个循环; 72 5 m in。
选择性扩增的反应体系为:重蒸水 17. 5l、10 PCR缓冲液 2. 5 l、dNTPs 0. 5l( 200 M )、E 引物( 5
ng /l) 1l、M 引物( 30 ng /l) 1l、Taq酶( 2 U/l ) 0. 5l、DNA 模板 2l,上述试剂混匀后按以下程序进行
PCR反应: 94 2 min; 94 ( 30 s)-65 ( 30 s, 每循环递减 0. 7 )-72 ( 80 s) 13个循环; 94 ( 30 s)-55
( 30 s)-72 ( 80 s) 22个循环; 72 5 min。
1. 3. 3 聚丙烯酰胺变性胶凝胶电泳 按常规方法进行 [ 3] ,制备 7. 5% 含 12. 6g 尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶
溶液,加入20l TEMED和200l APS 摇匀后灌胶,胶板厚 1 mm。以 1 T BE 缓冲液为电泳缓冲液,于 600
V恒压下预电泳 30 min,加样后于 280 V恒压下电泳 8~ 10 h。电泳后剥胶,经 10%醋酸固定 40 m in, 再经
蒸馏水漂洗后用硝酸银染色液染色 20 m in后终止染色,在凝胶成像装置上观察 DNA 扩增带和拍照。
图 1 猕猴桃基因组 DNA电泳图谱
261. 帮增; 251. 武雄; M . 分子量标记
2 结果与分析
2. 1 DNA 提取与纯化
用猕猴桃幼叶通过上述方法提取基因组 DNA 和纯化后得到的样品,为白色沉淀。用 1 TBE缓冲液
66 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
溶解 DNA 样品,经 1%琼脂糖凝胶电泳,可见到 1条明显的亮带,其大小超过 3 000 bp(图 1) ,说明所获得的
DNA 样品有较高的纯度。将此 DNA 样品用双蒸水溶解后进行分光光度测定,其 A260/ A280值约为 1. 80,
也证明所得 DNA 样品的质量较好。由于 DNA 片段较大,对于后续的双酶切及 AFLP 扩增也是有利的,有
可能得到较多的扩增带。该 DNA 样品经 EcoRI和 MseI 两种内切酶双酶切之后, 图 1所显示的大片段酶带
消失,在 200~ 1 200 bp范围内呈现一片边界不清晰的 DNA 带, 说明酶切较为充分。
2. 2 AFLP 扩增
猕猴桃基因组 DNA 经过双酶切和酶切片段的 Adaptor 连接之后, 通过预扩增和选择性扩增程序, 再将
扩增产物进行电泳分离, 获得 AFLP 扩增图谱(图 2)。从图 2可以看出,同一引物组合对不同的猕猴桃品种
图 2 猕猴桃基因组 DNA的 AFLP扩增产物电泳图谱(A、B)及模式图( C)
1 引物 E coRI- AGC/ M seI- CAC扩增 武雄基因组 DNA
2 引物 E coRI- AGC/ M seI- CAC扩增 帮增基因组 DNA
1` 引物 EcoRI-ACT / MseI-CT T 扩增武雄基因组 DNA
2` 引物 EcoRI-ACT / MseI-CT T 扩增帮增基因组 DNA
1* 引物 EcoRI- ACG/ M seI- CTC扩增 武雄基因组 DNA
2* 引物 EcoRI- ACG/ M seI- CTC扩增 武雄基因组 DNA
基因组 DNA 所产生的 AFLP 扩增的 DNA 带有一定差异。例如, 用 EcoRI-AGC / M seI-CAC 扩增武雄
基因组 DNA 产生 19条 DNA带,扩增帮增基因组 DNA 产生 16条 DNA 带; 用 EcoRI-ACT / MseI-CTT
扩增武雄基因组DNA产生30条DNA 带,扩增帮增基因组 DNA 产生, 34条 DNA 带; 用 EcoRI-ACG/
672006年第 1期 柯辉鹏等: 猕猴桃叶 DNA 的 AFLP 分析
MseI-CT C扩增武雄和帮增基因组 DNA 均产生 26条 DNA 带, 但各有 1条 DNA 带的位置不相同。而
同一品种基因组 DNA 用不同引物扩增的结果也不相同,表现出一定的多态性。例如, 武雄基因组 DNA
用 EcoRI-AGC/ MseI-CA C扩增产生 19条 DNA 带,用 EcoRI-ACT/ MseI-CT T 扩增产生26条 DNA带。每
一引物组合所扩增的 DNA 带在 15条以上, 大部分 DNA 带的大小都超过 100 bp, 300 bp以上的 DNA 带
(可能是基因 DNA 片段)也较多, 说明 AFLP 扩增的质量较高。
3 讨论
我国是猕猴桃属的起源中心, 现已查明约有 59种、43变种和 7 个以上的变形[ 1-2]。随着猕猴桃在全世
界范围内被越来越广泛地栽培,目前已育成栽培品种数百个, 这些品种大都来自野生类型的驯化, 部分是杂
交育成品种,还有一些是从芽变枝条中选育扩繁而成的。对猕猴桃属内各个物种的亲缘关系及起源一直存
在着不同的看法,对于栽培品种的划分标准和一些品种的真实性也一直有争论,用分子标记进行聚类分析是
一个有效和可靠的手段。早期的 RFLP 标记由于需有大量 DNA 样品和 DNA 片段较少而难以应用; RAPD
标记由于受假阳性带的干扰和可重复性较差,一般不适宜用于种间的遗传多态性和亲缘关系研究; SSR是
基于高度生重复的小片段 DNA的差异建立的分子标记分析方法, 重复性好,且扩增出来的 DNA 片段数目
多,用于差异性比较有其优越性,但其扩增片段一般不是基因片段,因为在高等动植物中高度重复基因毕竟
是极少数。AFLP 的扩增产物既有小片段的 DNA 带, 也有大片段的 DNA 带, 从大片段的扩增产物中有可
能进行基因的差异比较, 也可能分离出基因片段, 甚至是分离出完整的基因,用于遗传分析和多态性研究。
在本研究中,在对扩增产物的电泳分离过程中增加了变性胶的厚度(从 0. 4 mm 增加至 1. 0 mm ) ,目的是在
银染显带时,减少小片段的 DNA 带的显示,便于对大片段 DNA 带的比较和分离, 从实验结果可以看出,电
泳图谱中大多数 DNA带的相对大小均超过 100 bp,且每一引物组合的扩增带都在 15条以上(利用不同引
物组合有可能达到 100条带以上)。如果降低凝胶浓度则可能使多数小片段 DNA 带逸出而保留较大片段
的 DNA 带。增加变性胶的厚度, 既减少了制薄层胶的困难,又节省了电泳过程所需的时间。
猕猴桃的幼叶中含有较多的多糖和多酚类物质,对 DNA的提取和分离纯化造成一定困难,这些物质和
DNA 共沉淀又造成 PCR扩增效果不理想。本试验中对常规的 SDS法做了一些改进, 主要是在裂解液中加
入 1%的 PVP 和 1%的巯基乙醇除去多酚类物质,用 5 M KAc 沉淀多糖, 取得了较好的效果。由于多糖形
成的胶状物在第一次离心后多处于中间层, 因而在转移上清液后进行再次离心是有利的。提取的 DNA 样
品进行再次纯化后中,其 OD260/ OD280值接近 1. 80,已能满足 AFLP 对模板 DNA 的要求。
参 考 文 献
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